Введение к работе
Актуальность проблемы. Система синтеза ДНК через повреждение (translesion ithesis, TLS) - одна из основных систем, используемых клеткой при репликации врежденной геномной ДНК. Несмотря на существующий большой массив иных, объясняющий детали этого процесса, тем не менее, остается ряд разрешенных вопросов, например, какие ДНК-полимеразы и белковые факторы инимают участие в синтезе ДНК через тот или иной тип повреждения; каковы эбенности процесса TLS при синтезе лидирующей и отстающей цепей геномной ПС. Синтез ДНК через повреждение осуществляется специализированными ДНК-лимеразами. Исследования последних лет показали, что к их числу можно яести и ДНК-полимеразы р и X (пол В и пол X) структурного семейства X. На годняшний день основная часть исследований сосредоточена на реконструкции мплекса белков, осуществляющего TLS в процессе репликации лидирующей пи геномной ДНК, то есть с участием праймированных ДНК-дуплексов с отяженными 5'-оц-участками с повреждением в определенном положении тричной цепи. В то же время, например, в условиях окислительного стресса жет возникнуть необходимость синтеза ДНК по поврежденной матрице при шгакации отстающей цепи геномной ДНК, то есть по ДНК-субстрату, в котором вреждение находится непосредственно напротив бреши внутри ДНК-дуплекса.
Целью работы являлось исследование TLS-процесса, катализируемого пол р и л X, на ДНК-субстратах, имитирующих интермедиаты репликации ДНК на дирующей и отстающей цепях, и влиянию на этот процесс таких репликативных кторов, как hRPA и hPCNA. В ходе работы решались следующие задачи: 1) следование TLS-активности пол р и пол X на частичных ДНК-дуплексах, держащих тетрагидрофуран, 8-оксогуанин или тимингликоль в качестве вреждения матричной цепи, а также протяженные 5'-оц-участки матрицы или іно-, да-, пентануклеотидные бреши с З'-ОН и 5'-фосфатной группами; влияние
этот процесс ионов Mg2+ и Мп2+; 2) изучение влияния hRPA на TLS-активность л X при использовании 8-оксогуанин-содержащих ДНК с протяженными 5'-оц-астками; 3) анализ влияния hRPA и hPCNA на синтез ДНК через тимингликоль, гализируемый пол р и пол X, в частичных ДНК-дуплексах, содержащих бреши шой длины; 4) изучение характера взаимодействия белков фракционированного ерного экстракта клеток HeLa с частичными 5'-оц-ДНК-дуплексами, держащими тетрагидрофуран или 8-оксогуанин; 5) идентификация белков ерного экстракта семенников крупного рогатого скота и белков (акционированного ядерного экстракта клеток HeLa, взаимодействующих с анин-, 8-оксогуанин- и тетрагидрофуран-содержащими ДНК-субстратами, с именением метода фотоаффинной модификации.
Научная новизна и практическая значимость. Проведено систематическое следование TLS-активности пол р и пол X через тетрагидрофуран, 8-оксогуанин и
тимингликоль на частичных ДНК-дуплексах, имитирующих интермеди репликации ДНК на лидирующей и отстающей цепях. Обнаружено, что фермента способны катализировать синтез ДНК, независимо от типа повреждеї Впервые показано, что hRPA стимулирует TLS-активность пол X на 8-оксогуан содержащих ДНК с протяженными 5'-оц-участки, находясь в глобулярной, но вытянутой конформации; показано, что этот эффект обусловлен белок-белковь взаимодействиями между ДНК-полимеразой и репликативным фактором А. 1 изучении влияния hRPA и hPCNA на TLS через тимингликоль в составе Д! дуплексов, имитирующих интермедиаты репликации ДНК на отстающей ц< впервые показано, что: (i) hPCNA оказывает стимулирующее действие на Т активность пол Я, в то время как hRPA не проявляет специфического влияния работу этого фермента; (ii) синтез ДНК, катализируемый пол р, как поврежденной, так и на интактной матрице не зависит от присутствия hPCN hRPA. С помощью метода фотоаффинной модификации и иммунофермент* анализа поли(АОР-рибозо)полимераза 1 идентифицирована в качестве одного белков ядерного экстракта Bovine testis, взаимодействующих с ДНК-дуплексг содержащими протяженные 5'-оц-участки или бреши и повреждение в матрич цепи (8-оксогуанин или тетрагидрофуран). Аналогичным образом б продемонстрировано, что пол \ - один из белков фракционированного ядері экстракта клеток HeLa, взаимодействующих с теми же ДНК-дуплекс; Основываясь на результатах представленной работы, можно сказать, что уча< пол (3 в процессе TLS через различные типы повреждений, вызывав! окислительным стрессом, требует дополнительного изучения, поскольку : фермент не обладает отчетливой специфичностью при синтезе, например, через а также не демонстрирует функционального взаимодействия с репликативн факторами, такими как hRPA и hPCNA. Сопоставляя полученные результат данными, опубликованными другими авторами, можно предположить, что пол сочетании с hPCNA и hRPA играет важную роль в TLS через поврежде возникающие в результате окислительного стресса (АП-сайт, 8-оксогуа тимингликоль), при репликации отстающей цепи геномной ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликої 4 статьи. Результаты работы были представлены на международных конференц "International Conference on Chemical Biology", Новосибирск, 2005; "Internati Conference on Physico-Chemical Biology", Новосибирск, 2006; "Conference for y< scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics", К Украина, 2007; "IV congress of Russian Society of biochemists and mole< biologists", Новосибирск, 2008; "DNA repair and epigenetic regulation of ger stability", Санкт-Петербург, 2008; "10th International Conference on Environmi Mutagens", Флоренция, Италия, 2009.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, [водов, списка литературы. Работа изложена на 146 страницах, содержит 35 сунков, 31 таблицу и список цитируемой литературы из 301 наименования.
