Введение к работе
Актуальность проблемы. Изучение молекулярно-генетической организации факторов патогенносте чумного микроба имеет большое теоретическое и практическое значение. К настоящему времени можно считать окончательно установленным, что такие факторы патогенносте чумного микроба, как зависимость роста от ионов Са++ при температуре роста 37 С, V и W антигены, белки наружной мембраны, фракция 1 и "мышиный" токсин имеют плазмидную локализацию.
Клетки возбудителя чумы, как правило, обладают тремя плазми-дами: pYP, pYV и pYT отличающимися как по своим размерам, так и по роли кодируемых продуктов в физиологии бактерий и развитии инфекционного процесса (Проценко 0.А.с соавт., 1981,1983; Ben-Gurion R. et al.,1981; Ferber D.H. et al.,1981). В связи с молекуляр-но-генетическими особенностями и детерминируемыми факторами вирулентности основное внимание уделялось изучению pYP и pYV плазми-дам, а высокомолекулярная плазмида pYT оставалась изучена недостаточно. К моменту начала нашей работы было известно, что её молекулярная масса составляет 55-65 Md и что она детерминирует синтез "мышиного" токсина и капсульного антигена F1 (Проценко 0.А. с соавт., 1983). Поэтому, исследования в данном направлении представляли значительный научный и практический интерес.
Цель работы. Изучение структурно-функциональной организации pYT плазмиды и участка ДНК, ответственного за синтез капсульного антигена F1 чумного микроба.
Основные задачи исследования.
-
Рестрикционный анализ pYT плазмиды чумного микроба.
-
Построение рестрикционной карты pYT плазмиды.
-
Молекулярное клонирование гена фракции 1 и его локализация на физической карте pYT плазмиды.
-
Изучение продукции фракции і в гетерологичных системах.
-
Конструирование ДНК-зонда на основе структурного гена фракции!..
-
Изучение pYT плазмид атипичных (Fra~) штаммов чумного микроба.
Научная новизна.
-
Построена рестрикционная карта pYT плазмиды штамма Y. pestis EV-76 для зндонуклеаз: BamHI.Xhol.BstEII,Smal.EcoRI и Hindlll.
-
Локализован структурный ген фракции 1 на pYT плазмиде.
-
Создана серия рекомбинантных плазмид на основе векторных молекул pBR-322, pUC-128 и фрагмента плазмиды pYT детерминирующего синтез фракции 1.
-
Сконструированы рекомбинантные штаммы Y. pseudotuberculosis и Е. coli - продуценты капсульного антигена чумного микроба.
-
Получены данные об экспрессии генов fra-оперона в гетерологичных системах.
-
Сконструирован ДНК-зонд на основе структурного гена фракции 1 чумного микроба.
-
Изучен состав и структурная организация плазмид из четырёх атипичных-штаммов чумного микроба.
Практическая значимость.
-
В результате выполнения работы сконструированы штаммы Y. pseudotuberculosis и Е.сої і - продуценты фракции 1. Штаммы продуценты капсульного антигена F1 депонированы в музее живых культур РНИПЧИ "Микроб" под номерами КМ40 - Е. col і JM103 рМВ-15 и КМ4 - Y. pseudotuberculosis рМВ60-3
-
Сконструирован ДНК-зонд на основе структурного гена фракции 1.
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Построена рестрикционная карта плазмиды pYT из штамма Y. pestis EV-76/3 с использованием эндонуклеаз ВашНІ, Xhol, BstEII, Smal, EcoRI и Hindlll, на которой локализован структурный ген
- 5 -фракции 1 чумного микроба.
-
Получена серия рекомбинантных молекул рМВбО, рМВ60/3. рМВ60/4, рНВ60/9 и рНВ15 детерминирующих синтез фракцииі.
-
Генетическая информация fra-оперона по разному реализуется в клетках Е.coll, Y.pseudotuberculosis 1292 и Y.pestis PKR133.
-
Показано наличие в плазмиде pYT двух участков ДНК влияющих на репрессию и термозависимый характер синтеза фракции 1.
-
Сконструированный ДНК-зонд позволяет идентифицировать клетки чумного микроба, содержащие структурный ген фракцииі.
-
Изученные атипичные Fra" штаммы чумного микроба содержат структурный ген фракции 1.
-
Клетки штамма Y.pestis М16 содержат в своём составе высокомолекулярный репликон длиной около 100 тыс. н.п. по своей структуре отличной от плазмид pYV и pYT клеток Y.pestis EV-76.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на научных конференциях РПЧИ (1989,19S0,1992,1994г.}, на областной научной конференции молодых учёных "Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных инфекций" Ростов-на-Дону, 1989, научной конференции "Бактериальные плазмиды" Нальчик,1990, Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" Волгоград, 1992.
Публикации. Основное содержание работы отражено в четырёх опубликованных работах. Список публикаций приводится в конце автореферата.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах машинописи, состоит из оглавления, введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, трёх глав собственных исследований, заключения, выводов. Текст иллюстрирован 7 таблица-
ми и 19 рисунками. Список литературы включает работы 146 авторов.
