Введение к работе
Актуальность проблемы. Регуляция экспрессии генов — один из основных молекулярных механизмов дифференцировки клеток и развития организма в целом. В настоящее время не вызывает сомнений тот факт, что этот процесс осуществляется на нескольких уровнях и пространственная организация хромосом в ядре играет в этом существенную роль. Показано, что формирование петельных доменов, постоянное или временное взаимодействие хромосомного локуса с ядерной оболочкой может обуславливать его положение в 3-х мерном объеме ядра и функциональное состояние гена(ов) этого локуса (Pai, Engelke, 2010; Montavon, Duboule, 2012). В свою очередь, пространственная организация хромосом в интерфазном ядре в большой степени определяется характером их прикрепления к ядерной оболочке.
Многочисленные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что
ядерная оболочка — это не только структурный компонент ядра, но и
полноценная функциональная единица, участвующая в различных процессах.
Различные конформационные изменения хромосомной ДНК,
компактизация/декомпактизация хроматина, активация или сайленсинг — многие регуляторные процессы функционирования генома осуществляются на ядерной оболочке или при её участии (Guelen et al., 2008; Zullo et al., 2012). Наряду с этим, во многих работах показана "точечная" ассоциация с ядерной оболочкой, затрагивающая непротяжённые участки интерфазных хромосом (Tsanev, Tsaneva, 1986; Fais et al., 1989; Владимирская и др., 1998). При этом происходит разделение хромосомной ДНК на ряд доменов.
В связи с этим большой интерес представляют исследования последовательностей ДНК, обуславливающих прикрепление хромосом к ядерной оболочке (яоДНК), а также барьерных элементов — большой группы последовательностей, предположительно участвующих в установлении границ между структурными/функциональными единицами эукариотических хромосом.
Предметом изучения в данной работе является фрагмент яоДНК, выделенный из ядерных оболочек гепатоцитов мыши, клон EnvMA. Эта последовательность является эволюционно консервативной и обладает рядом необычных характеристик (Глазков и др., 1999). Многообразие функций ядерной оболочки позволяет предположить, что участки заякоривания интерфазных хромосом на ядерной оболочке могут играть в ядре не только структурную роль, но и выполнять дополнительные функции. В настоящее время экспериментальные данные по этому вопросу отсутствуют.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных характеристик участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке (яоДНК). В соответствии с целью в работе были поставлены следующие задачи:
1. Провести анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами
биоинформатики;
-
Провести анализ барьерных свойств последовательности яоДНК;
-
Провести анализ регуляторных свойств последовательности яоДНК;
-
Провести анализ инсуляторных свойств последовательности яоДНК;
-
Определить особенности мест интеграции трансгенов и провести анализ мест локализации последовательности яоДНК на хромосомах Drosophila melanogaster.
Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе впервые проведено исследование функциональных особенностей участков хромосомной ДНК, обуславливающих прикрепление интерфазных хромосом к ядерной оболочке. Проведён анализ нуклеотидной последовательности яоДНК методами биоинформатики, определены особенности её нуклеотидного состава, а также проведён сравнительный анализ яоДНК с другими последовательностями-претендентами на роль барьерных элементов хроматина. В составе яоДНК выявлены консервативные области, одна из которых представляет собой полипуриновый трек, обладающий гомологией до 100% с геномами различных объектов от бактерий до человека. Эти данные позволяют предполагать существование общего ("древнего") нуклеотидного мотива, обуславливающего прикрепление хромосомной ДНК к клеточной/ядерной оболочке.
Впервые проведён экспериментальный анализ функциональных характеристик яоДНК. Обнаружено, что фрагмент яоДНК способен защищать фланкируемые трансгены от эффекта положения, при этом регуляторной функцией изучаемый фрагмент не обладает. Последовательность яоДНК не является инсулятором, однако она может взаимодействовать с инсулятором War і, что было впервые показано в данной работе. Определение сайтов интеграции трансгенов показало, что трансформированные конструкции локализуются в междисках политенных хромосом дрозофилы. В геноме ^трансформированных мух участки, гомологичные яоДНК, выявляются на границах дисков/междисков политенных хромосом.
Полученные результаты имеют важное фундаментальное и прикладное значение. Они вносят весомый вклад в понимание структурно-функциональной организации эукариотических хромосом и могут быть использованы при разработке технологии конструирования биологически безопасных трансгенов для нужд медицины и сельского хозяйства. Кроме того, представленные данные открывают ряд возможностей для дальнейших исследований яоДНК как мало изученной последовательности, участвующей в разграничении генных доменов.
Личный вклад автора. Биоинформатический анализ, молекулярно-генетические манипуляции с ДНК (клонирование, ПЦР и т.д.) осуществлялись автором лично. Трансформация эмбрионов дрозофилы проводилась в Лаборатории молекулярной кариологии и основ клеточной терапии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. Первый эксперимент по Р-опосредованной трансформации эмбрионов дрозофилы был проведён
совместно с к.б.н. Н.Г. Шостак; все последующие трансформации проводились автором лично. Генетические скрещивания и ведение линий дрозофилы также осуществлялись автором. Гибридизация in situ для определения локализации трансгенов на политенных хромосомах дрозофилы была проведена совместно с д.б.н. И.И. Киреевым (Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова). Остальные FISH-эксперименты выполнены автором лично.
Апробация результатов. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XV Школе "Актуальные проблемы биологии развития" (Звенигород, 2008), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), International Moscow Conference on Computational Molecular Biology (Moscow, 2009), 21st International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Ustron, 2009), Международной конференции "Хромосома 2009" (Новосибирск, 2009), Конференции молодых учёных ИБР РАН (Москва, 2009), 14-й Международной пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2010), XVI Всероссийском симпозиуме "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, 2010), IV Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике "Геномика и биология клетки" (Звенигород, 2010), 22nd International Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus (Riga, 2011), 17-й Международной Пущинской школе-конференции молодых учёных "Биология — наука XXI века" (Пущино, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ, 4 из которых — статьи в журналах, соответствующих перечню ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список литературы. Библиография включает 202 источника. Работа иллюстрирована 18 рисунками и 2 таблицами.
![Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки тощей кишки после воздействия [Г]-излучения в малых дозах](/i/i/4495/469880.png "Морфофункциональная характеристика слизистой оболочки тощей кишки после воздействия [Г]-излучения в малых дозах Слюсарева, Ольга Александровна")
