Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 9
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
Словарь 13
Методы сравнительной геномики для изучения транскрипции 14
Выработка бактериоцинов гтам-положительными бактериями и механизмы
транскрипционной регуляции 17
Бактериальные взаимодействия 17
Общие сведения о бактериоцинах 18
Классификация бактериоцинов 19
Формирование биологически активных молекул 20
Регуляция выработки бактериоцинов 21
Распознавание сайтов связывания транскрипционного фактора 23
Наиболее распространенные модели; консенсусная и весовых матриц 24
Другие модели 29
Древо жизни и эволюция 31
Молекулярные часы 31
Теория отбора, нейтральная и почти нейтральная эволюции 32
Определение расстояний между геномами и построение деревьев 35
Эволюция ДНК сайтов связывания транскрипционных факторов 38
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 44
Исходные данные 44
I Глава. Системы выработки бактериоцинов 44
11-я иШ-я Главы. Анализ моделей связывания и эволюции 44
Методы и программы, использованные в работе 46
Поиск ортологов 46
Распознавание ДНК-сигналов ....46
Межгеномные расстояния и кнастеры ортологжных генов 48
Математические методы 49
Хи-квадрат тест на однородность 49
Дисперсионный анализ (ANOVA) 50
Непараметрические критерии 53
ГЛАВА I. ПРЕДСКАЗАНИЕ И АНАЛИЗ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ
ВЫРАБОТКИ БАКТЕРИОЦИНОВ 57
Генетика выработки бактериоцинов 57
Генетическая организация бактериоцинных кластеров 57
Регуляция транскрипции 65
Регуляторньш элементы системы выработки бактериоцинов класса II 66
Регуляция транскрипции в системе выработки бактериоцинов Streptococcus equi..,.68
Кластеризация регуляторных сайтов и регуляторов ответа 70
Обсуждение 72
ГЛАВА II. МОДЕЛИ РАСПОЗНАВАНИЯ ТРАНСКРИПЦИОННЫМ
РЕГУЛЯТОРОМ САЙТОВ ДНК 74
Анализ существующих моделей связывания 74
Альтернативная модель 77
Обсуждение 80
ГЛАВА III. ЭВОЛЮЦИОННАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ НЕКОНЕСЕНСУСНЫХ
НУКЛЕОТИДОВ В САЙТАХ ДНК 81
Влияние регулируемого гена на выбор неконсенсусного ну клеотида сайта 81
Нейтральная эволюция и эволюционная стабильность некопсенсусных
нукпеотидов 87
Сравнение консенсусной и неконсенсусной консервативности 92
Обсуждение 94
ВЫВОДЫ 96
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 97
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 98
Общая характеристика проблемы
Актуальность темы
Предсказание регуляции экспрессии генов является важным разделом компьютерной генетики и системной биологии. Это связано с тем, что, с одной стороны, в настоящее время сравнительно легко осуществляется секвенирование геномов, а с другой - использование этой информации для описания возможного фенотипа встречает определенные трудности, обусловленные отставанием понимания механизмов дифференциальной экспрессии от темпов секвенирования.
Связь генотипа и фенотипа у живых организмов осуществляется в первую очередь с помощью контроля экспрессии генов. Одним из важнейших этапов регуляции экспрессии является специфическая инициация транскрипции, связанная с образованием сложных ДНК-белковых комплексов. За последнее время в распоряжении исследователей появилось большое количество данных, включающих как последовательности взаимодействующих белков и ДНК, так и трехмерные структуры собственно ДНК-белковых комплексов. Несмотря на весь этот значительный экспериментальный материал, понимание физикохимических процессов, происходящих при инициации транскрипции, до сих пор не достигнуто.
За последние 20 лет было предложено несколько моделей, в которых описывалось переключение генов в ответ на изменение концентрации регуляторных факторов. Подобные модели предсказывают некоторые особенности регуляции экспрессии генов у различных видов, геномы которых уже секвенированы. В то же время, малые концентрации регуляторных факторов не позволяют осуществить экспериментальный выбор между этими моделями. В этой связи большое значение приобретают косвенные следствия тех или иных
характеристик, которые бы позволяли определить физико-химические параметры ДНК-белкового взаимодействия. В частности, актуальным является изучение закономерностей в изменении регуляторных областей различных генов родственных геномов, возникающие в ходе эволюции. Особенности взаимодействия белковых факторов с регуляторными областями обуславливают ту или иную степень консервативности ДНК в регуляторных участках. Это же взаимодействие определяет консервативность аминокислот, входящих в ДНК-распознающие домены.
Стремительное развитие биоинформатики, сопровождающее быстрый рост доступных текстов ДНК, привело к появлению большого количества стандартных методов анализа последовательностей ДНК, позволяющих извлекать из них значительную информацию. Например, при помощи исследования некодирующих участков генома можно определять потенциальные участки специфического связывания регуляторных белков с ДНК, что дает основания предполагать активацию или репрессию определенных генов этими регуляторными факторами. Сравнительный анализ этих сигналов позволят делать выводы о характеристиках ДНК-белкового взаимодействия, например о структуре ДНК-белкового комплекса (связывание в форме мономера или димера, взаимодействующего с одной или с разными нитями ДНК), или об афинности связывания.
Кроме того, информация, полученная методами компьютерной биологии, позволяет осуществлять предсказания специфических особенностей метаболизма плохо изученных видов прокариот. В дальнейшем эти предсказания могут быть подтверждены или опровергнуты экспериментом, что делает разработку методов компьютерной геномики актуальной для обеспечения прогресса в биотехнологии и медицине.
Цель работы
Предсказание регуляции экспрессии генов, связанных с выработкой бактериоцинов грамположительными бактериями. Анализ моделей связывания транскрипционного фактора с ДНК. Определение особенностей эволюции ДНК сайтов связывания бактериальных транскрипционных факторов.
Научная новизна и практическая значимость
Произведен обзор механизмов выработки антибактериальных пептидов -бактериоцинов грамположительными бактериями. Систематически описано устройство всех локусов, содержащих гены регуляторных систем, транспорта, иммунитета, процессинга и посттрансляционной модификации антибактериальных пептидов. Показано, что эволюционное дерево транскрипционных регуляторов ответа соответствует дереву узнаваемых ими сайтов связывания, в соответствии с этим произведена классификация регуляторных систем. Для организма Streptococcus «^/'предсказана новая система выработки бактериоцинов.
Проанализированы существующие способы распознавания регуляторных сигналов, показаны условия их применимости. Предложен новый подход к распознаванию регуляторных сигналов.
Описан эффект ген-специфической эволюции регуляторных сайтов, а именно, сохранения неконсенсусных нуклеотидов в ортологичных сайтах, где выбор нуклеотида обусловлен регулируемым геном. Обсуждены возможные применения сделанного наблюдения для предсказания регуляторных систем в малоизученных организмах.
Всё вышесказанное составляет практическую значимость работы и является поводом для экспериментальной проверки.
Апробация работы
Результаты работы представлялись на международных конференциях: 3-я конференция "Bioinformatics of Genome Regulation and Structure" (BGRS, Новосибирск, 2002); 1-я конференция "Moscow Conference on Computational Molecular Biology" (MCCMB, Москва, 2003); International workshop "Structural approaches to sequence evolutions: Molecules, networks, populations" (STRAPP, Дрезден, 2004); Meeting of Howard Hughes International Research Scholars (Таллинн, 2004); VII Международная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (ICMB, Суздаль 2004).
Объём и структуры диссертации.
Диссертация изложена на 106 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, и трех глав. В каждой главе содержится описание и обсуждения оригинальных результатов.
Введение посвящено краткому описанию представленной работы. В главе I обсуждены генетические аспекты выработки антибактериальных пептидов грамположительными бактериями. Произведена классификация изученных регуляторных механизмов, произведено предсказание системы выработки бактериоцинов в Streptococcus equi. В главе II анализируются широко используемые для распознавания регуляторных сигналов модели связывания транскрипционного фактора с ДНК, показаны их недостатки и условия применимости. Предложен альтернативный подход для распознавания сигналов. Глава III содержит исследование эволюционных механизмов, действующих на регуляторные участки. Показано давление отбора на неконсенсусные нуклеотиды регуляторных сигналов.
/Ш
*
Список литературы, приведённый в конце диссертации, включает 138 наименований. Работа содержит 5 рисунков и 11 таблиц.
Введение к работе
Одним из важнейших процессов, который обеспечивает многообразие функциональных возможностей живых организмов, является регуляция транскрипции. Большое количество геномов, отсеквенированных и аннотированных в последние годы, позволяет эффективно использовать методы компьютерной биологии для предсказания новых и детального изучения уже известных регуляторных систем.
Ключевым моментом транскрипционной регуляции является связывание одного или нескольких транскрипционных факторов со специфическими участками молекулы ДНК (ДНК сайтами) в регуляторных областях гена. Как правило, участки связываения одного и того же транскрипционного фактора имеют схожую структуру, при этом несколько различаясь от одного регулируемого гена к другому. Наряду с тем фактом, что в ходе эволюции близкородственные организмы сохранили многие гены и регуляторные механизмы в малоизмененном виде, это дает возможность предсказывать потенциальные регуляторные сайты в новых геномах, а также исследовать механизмы транскрипционной регуляции в уже известных геномах.
В качестве биологической системы, рассмотренной в данной работе с такой точки зрения, была выбрана система выработки бактериоцинов в грамположительных бактериях. Бактериоцины - это пептидные молекулы, синтезирующиеся на рибосомах и обладающие антибактериальным действием. Были замечены некоторые закономерности, имеющие место для всех регуляторных механизмов в различных организмах, обеспечивающих выработку бактериоцинов. При помощи методов компьютерной геномики было предсказано существование подобной системы в организме (Streptococcus equi), для которого это не было известно ранее.
При изучении транскрипционной регуляции, характерной для бактериоцин-продуцирующих организмов, было замечено две проблемы. Во-первых, в ходе анализа регуляторных систем в различных организмах, возникает проблема распознавания предположительных сайтов связывания (сигналов) определенного транскрипционного регулятора в заданном геноме. Во-вторых, сигналы в различных, даже близкородственных, геномах несколько различаются между собой, тем самым ставя вопрос об эволюционных проблемах изменчивости регуляторных областей.
Проблема распознавания регуляторных сайтов напрямую зависит от того, какие модели используются для описания механизмов связывания транскрипционных факторов с ДНК. Среди моделей белок-связывающей последовательности ДНК на сегодняшний день самыми распространенными являются консенсусная модель и модель весовых матриц.
В обеих моделях величина, характеризующая сродство (аффинность) регулятора к сайту, зависит от суммы вкладов отдельных позиций этого сайта, которые, в свою очередь, определяются нуклеотидами, стоящими в этих позициях. Первая модель подразумевает связывание транскрипционного фактора только с одним (консенсусиым) из четырех нуклеотидов в определенной позиции, и любой потенциальный сайт рассматривает с точки зрения количества совпадений с консенсусной последовательностью. Модель весовых матриц предполагает, что все нуклеотиды участвуют в связывании, причем каждому из четырех нуклеотидов в одной позиции приписывается некоторый вес, который впоследствии входит в общую сумму по всем позициям, и определяет сродство потенциального сайта к транскрипционному фактору.
В настоящее время модель весовых матиц считается наиболее адекватно отражающей зависимость афинносги связывания регуляторного белка от последовательности ДНК. Однако, на основе анализа регуляторных сайтов связывания различных транскрипционных факторов, нами показано, что во многих случаях для построения адекватной весовой матрицы данных недостаточно из-за небольшого количества функциональных сайтов в геномах. В таких случаях более адекватной для описания сродства регулятора может оказаться модифицированная консенсусная модель.
Наличие адекватной модели связывания регуляторных белков с ДНК позволяет поставить вопрос о закономерностях изменчивости сайтов связывания в ходе биологической эволюции. В этом случае необходимо построить модель, описывающую давление отбора на точечные замены нуклеотидов в каждой позиции сайта связывания.
На сегодняшний день в эволюционных моделях, как правило, не рассматривается эволюция индивидуальных позиций регуляторный сайтов связывания транскрипционного фактора с ДНК. Вместо этого рассматривается процесс, в ходе которого важным является суммарное сродство регуляторной последовательности к фактору, вне зависимости от того, какими именно нуклеотидами в каких позициях это родство обеспечивается. При этом ненулевым считается вклад в энергию связывания только консенсусных нуклеотидов, тогда как вклад от неконсенсусного нуклеотида полагается равным нулю (так называемая модель двух состояний).
Как видно, подобные модели либо подразумевают отсутствие давления эволюционного отбора на неконсенсусные позиции ДНК-сайтов связывания (в случае модели двух состояний), либо, даже если если такое давление принимается, не рассматривают эволюционные свойства регуляториых сайтов, зависимые от регулируемых генов, а не только от величины сродства к фактору.
В данной работе были рассмотрены эволюционные свойства неконсенсусных позиций регуляторных сайтов. Было показано, что некоторые неконсенсусные позиции "ортологичных сайтов" (сайтов связывания одного и того же фактора в регуляторных областях ортологичных генов), влияние которых на регуляцию ранее считалось пренебрежимо малым, эволюционно очень стабильны и специфичны для определенного ортологичного ряда регулируемых генов. Для каждой рассмотренной пары геномов число неконсенсусных замен в этих позициях было гораздо меньшим, чем ожидаемое число нейтральных замен, оцененное по синонимичным заменам в наборе ортологичных генов из тех же геномов.
