Введение к работе
Актуальность проблемы. Построение цитогенетических карт необходимо для решения фундаментальных проблем генетики, эмбриологии, вирусологии, онкологии и практических целей селекции (Leroux et al., 2005; Morisson et al., 2005); кроме того, в будущем без этих карт будут невозможны исследования в области функциональной геномики (Burt et al., 2002).
Картирование геномов лабораторных и сельскохозяйственных животных — одно из приоритетных направлений в частной генетике этих видов. Генетические карты хромосом позволяют анализировать генотипическую структуру вида, а также исследовать общие закономерности генетического контроля биологически важных признаков. Кроме того, результаты сравнительного картирования необходимы при исследованиях в области эволюции геномов различных видов эукариотических организмов (Burt et al., 1999, 2002, Schmid et al., 2005). Сегодня принято считать, что конечной целью любого типа картирования геномов высших позвоночных животных является установление аналогии нуклеотидных последовательностей этого вида с геномами человека и мыши (Schmid et al., 2000).
Среди позвоночных животных класс Aves (Птицы) занимает особое положение по молекулярно-генетическим характеристикам своего генома. Одной из основных особенностей этого класса животных является почти втрое меньшее, по сравнению с плацентарными, содержание ДНК в ядре, что рассматривается современными авторами как приспособление птиц к полету (Burt et al., 1999). Варьирование количества ДНК в ядре у представителей самых разных таксономических групп выражено незначительно и колеблется от 1.7 до 3.5 пг, что вероятно связано с монофилетическим происхождением этого класса животных (Kadi et al., 1993).
Наиболее изученным с генетической точки зрения видом птиц является домашняя курица Gallus domesticus. К настоящему моменту выведено большое число пород курицы, обладающих уникальными биологическими свойствами (Rose, 2000; Schmid et al., 2000, 2005; Romanov et al., 2009). Несмотря на то, что курица стала первым животным, использованным в генетических исследованиях (Bateson, Saunders, 1902, цит. по Romanov et al., 2009), а также первым видом птиц, у которого был полностью секвенирован геном (ICGSC, 2006), многие вопросы, связанные с картированием ее хромосом, остаются открытыми.
Японский перепел также является важным модельным объектом в ряде биологических дисциплин, но генетически изучен еще меньше, чем курица (Minvielle et al, 2007).
Кариотипы курицы и перепела очень сходны по своей структуре и состоят из 39 пар хромосом. Большинство из них (30 пар) — это мелкие трудноидентифицируемые микрохромосомы (Ohno, 1961; Bitgood and Shoffher, 1990). Остальную часть кариотипа (8 пар аутосом и половые Z и W хромосомы) относят к группе макрохромосом. На основе дифференциального окрашивания разработана подробная цитологическая карта макрохромосом (Ladjali-Mohammedi, 1999), а также достаточно полная генетическая карта этой части кариотипа курицы (Romanov et al., 2009). К сожалению, карты микрохромосом еще далеки от насыщения. До сих пор существует проблема несоответствия числа групп
сцепления (53) гаплоидному числу хромосом (п=40). К настоящему моменту из 53 групп сцепления к определенным хромосомам отнесена 31. Остальные 22 группы не "привязаны" к какой-либо хромосоме курицы и объединены в одну общую карту под названием "Chran". Для этих групп необходима цитогенетическая локализация с правильным определением хромосомы (Schmid et al., 2005; Morisson et al., 2007; Douaud et al., 2008; Romanov et al., 2009).
В геноме перепела число картированных генов и маркеров меньше, чем у курицы. У перепела известно несколько генетических карт (AFLP-маркеры и микросателлиты), которые в последнее время интенсивно интегрируются. Генов на таких картах не очень много и не все хромосомы имеют маркеры. Например, хромосомы 8, W и 23 пары микрохромосом (Kayang et al., 2006; Sasazaki et al., 2006; Minvielle et al., 2007; Miwa 2007). В настоящее время геном перепела представлен в виде 66 групп сцепления вместо положенных 40 (гаплоидный набор хромосом) (Sasazaki et al., 2006).
До сих пор сохраняется проблема с насыщением цитогенетических карт этих объектов. Как правило, эта проблема касается группы самых мелких микрохромосом, для которых показана высокая транскрипционная активность, (McQueen et al., 1998; Burt, 2002), однако не найдены какие-либо генетические маркеры (Schmid et al., 2005). Прогресс в поиске маркеров для этой группы хромосом у курицы достигнут благодаря использованию ВАС-библиотек, содержащих огромное количество клонов E.coli (ВАС-клоны), несущих искусственные хромосомы с большими вставками из генома (Schmid et al., 2000; Delany et al., 2007; Douaud et al., 2008). На сегодня при помощи хромосомоспецифичных ВАС-клонов удалось идентифицировать 22 пары микрохромосом (Douaud et al., 2008).
Анализ генетической информации из баз данных, касающихся генома курицы показывает существование проблемы "спорной" локализации генов и маркеров (NCBI, ArkDB, Ensembl). Так, например, 10% из 226 контигов имеет двойную локализацию одних и тех же маркеров (Schmid et al., 2005; Romanov et al., 2009), что приводит к необходимости повторной локализации «спорных» маркеров с привлечением других методов картирования.
Цели и задачи исследования. Целью исследования явилось дальнейшее насыщение и совершенствование цитогенетических карт курицы и перепела, а также сравнение результатов картирования у этих видов.
Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:
1. Определить соответствие групп сцепления Е26С13, Е50С23 митотическим
хромосомам курицы. Осуществить локализацию с помощью SSCP-маркеров LEI0345 и LEI0336 из данных групп сцепления методами двухцветной FISH и ПЦР-реакции.
2. Локализовать гены maf, aldhlal, pno, fzf, cwOl и микросателлиты ADL0254,
LEI0342, MCW0330 на митотических хромосомах курицы и перепела с помощью двухцветной FISH.
3. Провести сравнительный анализ локализации генов maf, aldhlal, pno,fzf, cwOl и
микросателлитов ADL0254, LEI0342, MCW0330 у курицы и перепела.
Научная новизна работы. Впервые определено соответствие группы сцепления Е50С23 микрохромосоме 21 курицы и показано, что маркер LEI0345 не может быть использован в качестве маркера для определения соответствия группы сцепления Е26С13 и хромосомы курицы. Осуществлена локализация пяти новых генов-ортологов (maf, aldhlal, pno, fzf, cwOl) и трех микросателлитов (ADL0254, LEI0342 и MCW0330) в геноме перепела. Впервые осуществлена совместная локализация в митотических хромосомах курицы и перепела следующих пар маркеров: maf-mclr, aldhlal-igvps, pno-acaca, fzf-bmp7, cw01-ubap2w, ADL0254-insr, LEI0342-hspa5, MCW0330-hspa5. Проведен сравнительный анализ локализации этих маркеров в хромосомах курицы, перепела и человека. Впервые применен метод ПЦР для локализации генов и маркеров с использованием хромосомоспецифичных ВАС-клонов. Показана необходимость применения для локализации маркеров нескольких методов картирования.
Теоретическая и практическая ценность работы. Домашняя курица и японский перепел являются ценными сельскохозяйственными видами и модельными объектами. Полученные данные могут быть использованы в селекции, в позиционном клонировании, в медицинской генетике. Они полезны для решения фундаментальных проблем эмбриологии, иммунологии, вирусологии, онкологии, для определения консервативной синтении в геномах птиц, человека, мыши, а также для построения карт генома общего предка позвоночных животных и животных в целом. Данные по эволюционному консерватизму районов хромосом человека и домашней курицы могут быть использованы для моделирования хромосомных болезней человека. Сравнительное картирование геномов японского перепела и курицы помогут лучше разобраться в происхождении и эволюции этих видов. Результаты, полученные в работе, используются при чтении курсов лекций по генетике животных и при проведении практических занятий на кафедре генетики и селекции СПбГУ.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 18-м Международном Коллоквиуме по Цитогенетике Животных и Картированию Генов (18th-ICACGM, Bucharest, Romania, 2008), 17-й Международной хромосомной конференции (17th ICC, Boone, NC, 2009), на V съезде ВОГиС (Москва, МГУ, 2009), 2-й Московской Международной Конференции «Молекулярная Филогенетика MolPhy-2», (Москва, МГУ, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ: 3 статьи и 4 тезисов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, состоящего из 189 источников. Работа изложена на 138 страницах и содержит 21 рисунок, 11 схем и 9 таблиц.
