Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 7
2.1 Традиционная систематика мохообразных 7
2.2 Традиционная систематика бокоплодных мхов 9
2.3 Развитие молекулярных методов в систематике растений и результаты молекулярно-филогенетических исследований мохообразных. 15
2.3.1 Исследования хлоропластного генома 21
2.3.2 Исследования ядерного генома 30
2.3.3 Исследования митохондриальной ДНК. 34
2.3.4 Изучение микросистематики мохообразных 36
3. Материалы и методы 40
3.1 Исходный материал 40
3.2 Выделение ДНК 40
3.3 Амплификация ДНК 42
3.4 Агарозный гель-электрофорез 43
3.5 Элгоция и очистка ПЦР продукта из агарозных гелей и секвенирование 44
3.6 Методы филогенетического анализа 44
3.7 Анализ вторичной структуры 45
4. Результаты и обсуждение 46
4.1 Характеристика исследованных в работе участков генома 46
4.2 Филогенетические связи рода Hygrohypnum 53
4.3 Филогения семейства Нурпасеае 56
4.4 Филогения семейств Leskeaceae и Thuidiaceae 58
4.5 Филогенетические связи и систематическое положение вида Myrinia rotundifolia 63
4.6 Филогенетические связи и систематическое положение рода Habrodon 65
4.7 О роли морфологических признаков в систематике бокоплодных мхов в свете молекулярно-эволюционных данных 68
4.8 Анализ вторичной структуры интрона гена trnL хпДНК 70
4.9 Анализ вторичной структуры ITS2 яд-рДНК 77
5. Выводы 85
6. Список литературы 86
7. Приложение 1 111
8. Приложение II 117
- Традиционная систематика бокоплодных мхов
- Выделение ДНК
- Филогенетические связи рода Hygrohypnum
- О роли морфологических признаков в систематике бокоплодных мхов в свете молекулярно-эволюционных данных
Введение к работе
Отдел листостебельные мхи (Bryophyta, Musci) представляет собой группу древнейших бессосудистых наземных растений, представители которой распространены на всех континентах и являются важной: составляющей фитоценозов. Имея общего с сосудистыми растениями предка, существовавшего около 400 миллионов лет назад, мхи сформировали обособленную группу растений, отличительной чертой которых является преобладание в жизненном цикле развития гаплоидной фазы (гаметофита) над диплоидной (спорофитом). Самым многочисленным классом отдела является класс Bryopsida, включающий до 10000 видов. Еще в 1819 году Bridel предложил деление этого класса по характеру ветвления стебля и расположению гаметангиев на верхоплодные и бокоплодные мхи. Сложившиеся с тех пор системы бокоплодных мхов, основанные на результатах сравнительно-морфологического анализа признаков гаметофита и спорофита (Brotherus 1924, 1925; Vitt 1984; Buck &Vitt 1986; Buck & Goffinet 2000), обнаруживают много противоречий, касающихся как взаимоотношений порядков, так и таксонов более низкого ранга. Неразрешенными остаются вопросы филогенетических связей и таксономических границ многих семейств и родов бокоплодных мхов. Причины обнаруживающихся разногласий в разных классификациях кроются в нескольких особенностях строения мхов, Наряду с небольшими размерами мхи характеризуются однотипным планом строения гаметофита и спорофита, слабой дифференцировкой тканей. Поэтому число морфологических признаков, которые могут быть положены в основу системы, невелико. Так, до последнего времени многие классификации строились на основании признаков перистома, - аппарата спорофита, участвующего в рассеивании спор. Однако среди бокоплодных мхов часто происходит редукция перистома, в частности при переходе мхов в экстремальные для них условия местообитания (эпифитные или в водоемах), что ставит под сомнение весомость признаков перистома при построении филогенетической системы.
В ряде работ последних лет по филогении бокоплодных мхов показана перспективность использования методов геносистематики, в. первую очередь сравнение нуклеотидных последовательностей разных участков генома (Buck et al. 2000а, 2000b; Buck & Goffinet 2000 и проч.). Данные этих исследований позволяют не только усовершенствовать систему и проверить существующие филогенетические гипотезы, но и провести переоценку значимости отдельных морфологических признаков, традиционно считающихся ключевыми при построении системы.
Нами проведен анализ филогенетических связей некоторых проблематичных и ранее не изучавшихся таксонов бокоплодных мхов на основании сравнения как ядерной, так и хлоропластной ДНК, причем не только их первичных, но и вторичных структур.
Традиционная систематика бокоплодных мхов
Группа бокоплодных мхов включает почти половину видового разнообразия отдела Bryophyta и насчитывает до 50 различных семейств и около 5000 видов (Buck & Vitt 1986). Бокоплодные мхи оказались одной из самых сложных для систематиков группой, что связано с несколькими причинами. Эти растения характеризуются однотипным планом строения перистома, отличия в строении которого носят приспособительный характер и нередко происходят в разных группах при переходе в сходные условия обитания, в частности при переходе к эпифитизму (Huttunen et al. 2004). Кроме того, у целого ряда бокоплодных мхов спорофиты образуются крайне редко, а в ряде групп они вообще неизвестны. Так как в основе традиционных классификаций мхов лежали признаки спорофита, ив первую очередь перистома, то в эти системах можно обнаружить противоречивые трактовки взаимоотношений как между порядками бокоплодных мхов, так и таксонами более низкого ранга. До сих пор остаются дискуссионными вопросы объема и границ многих семейств (Leskeaceae, Thuidiaceae, Hypnaceae, Hylocomiaceae и др.), систематическое положение ряда проблемных родов и видов (Habrodon, Pterigynandrum, Conardia, Neodolicomitra и проч.). Неустойчивость системы бокоплодных мхов показывает сравнение систем, предложенных Brotherus (1924, 1925), Buck & Vitt (1986) и Hedenas (1995, 1997, 1999) (таблица 1). Бротерус (Brotherus 1924,1925) разделял бокоплодные мхи на четыре порядка, при этом в Eubryales были включены и ряд групп верхоплодных мхов. Порядок Hookeriales представлен в основном тропическими видами, а различия Isobryales и Hypnobryales только в характере ветвления стеблей, с тенденцией в пределах Isobryales к формированию дендровидных стеблей и более частым распространением у таксонов Isobryales специализированных спорофитов. В 1986 году Бак и Витт (Buck & Vitt 1986) предприняли попытку ревизии системы Бротеруса, положив в основу классификации наряду с морфологическими данными, результаты микроструктурного анализа. Особое значение при выделении крупных таксонов имело строение перистома, а надсемейства, семейства и таксономические единицы более низкого ранга выделялись на основании признаков гаметофита.
Семейства бокоплодных мхов авторы объединили в четыре порядка (таблица 1). Общим признаком порядков Hypnales (=Hypnobryales согласно системе Бротеруса), Leucodontales (=Isobryales согласно системе Бротеруса) и Hookeriales являегся наличие псевдопарафиллий, защищающих молодые «почки» при формировании латеральных ветвей. Порядок Bryales (=Eubryales по Бротерусу) включает главным образом верхоплодные мхи, а также ряд бокоплодных, отличительными признаками которых являются отсутствие псевдопарафиллий и субтерминальное ветвление стебля. Представители порядков Hookeriales и Leucodontales распространены главным образом в тропических широтах и формируют сходные спорофиты, характеризующиеся симметричной и прямостоячей коробочкой, хорошо развитым экзостомом и редуцированным эндостомом, а отличает порядки Hookeriales и Leucodontales ряд деталей в строении гаметофита. Так как объектами нашего исследования, являются, главным образом, семейства порядка Hypnales, рассмотрим более подробно филогенетическую концепцию этого порядка, предложенную Баком и Виттом (Buck & Vitt 1986). Бокоплодные мхи порядка Hypnales широко распространены в умеренных широтах северного полушария и характеризуются длинными клетками листьев, наличием горизонтальной и асимметричной коробочки спорофита, характерным узором экзостома, а также рядом других морфологических признаков. Авторы разделили порядок на три подпорядка: Нуршпеае, Fontinalineae, Hypnodendnneae (рис. 4). К Hypnodendrineae были отнесены бокоплодные мхи с дендровидными гаметофитами и шероховатыми зазубренными листьями, распространенные преимущественно в южном полушарии. В порядок Hypnales Бак и Витт перенесли Fontinalineae, хотя традиционно, следуя Бротерусу, его относили к Leucodontales. Отличительные морфологические признаки мхов этой группы трактовались как изменения, связанные с переходом в водную среду обитания. Hypnineae - самая многочисленная группа, обладающая, так называемым, гипноидным типом перистома, состоящим из экзо-и эндостома и обеспечивающим эффективное рассеивание спор. Надсемейства Leskeacanae, Brachytheciacanae и Hypnacanae выделены на основании признаков гаметофита. Признана амостоятельность ряда семейств, а именно Pterigynandraceae (Buck 1980а), Stereophyllaceae (Buck & Ireland 1985), Myriniaceae (Buck & Crum 1978; Buck 1980b). Представители надсемсйства Leskeacanae имеют короткие клетки листьев, что, по мнению авторов, является результатом приспособления- к ксерофитным условиям обитания. Семейства Leskeaceae и Pterigynandraceae сближаются из-за наличия таких общих признаков, как слабая жилка листа, прямостоячая коробочка и; редуцированный перистом. Thuidiaceae и: близкие к нему семейства, напротив, имеют сильную жилку, простирающуюся до вершины листа. Надсемейства Brachytheciacanae и Нурпасапае объединяет наличие линейных клеток листьев, отличаются же эти таксоны типами жилок. Так, Brachytheciacanae обладает короткой, сильной жилкой, а Нурпасапае имеет короткую, но двойную жилку,
В группе Brachytheciacanae семейство Rbytidiaceae считается самым древним. При характеристике семейств учитьгаался характер распространения таксонов и приуроченность к определенным местам обитания. Бак и Витт признали, что во многих случаях из-за вариабельности морфологических признаков определить границы семейств и их филогенетические связи достаточно сложно. Это касается, в частности, Fabroniaceae и Stereophyllaceae. В надсемействе Нурпасапае обнаруживается не меньше противоречий. Семейства Hypnaceae, Sematophyllaceae и Hygropogonaceae признаются, как, скорее всего парафилетичные таксоны. Монофилетичными Бак и Витт считают Plagiotheciaceae и Hylocomiaceae, включая в последнее семейство роды Hylocomium, Neodolicomitra, Pieurozium, Rhytidiopsis, Rkytidiadelphus и ряд других. В свою очередь, на основании кладистического анализа морфологических признаков гаметофита и спорофита Хеденас (Hedenas 1995, 1997, 1999) указал на необходимость пересмотреть объем, а также самостоятельность порядков и многих семейств бокоплодных мхов. Согласно Hedenas, порядки Bryales, Hypnales и Isobryales парафилетичны. Он выделили пять град бокоплодных: мхов. Так, монофилетичной,. по Hedenas, является группа, сформированная семействами Amblystegiaceae, Plagiotheciaceae, Rbytidiaceae, Thuidiaceae (за исключением Heterocladiodeae) и европейскими видами Hypnaceae. Отметим, что эти семейства у Buck и Vitt (1986) принадлежат разным подпорядкам. Тропические представители бокоплодных мхов формируют обособленные от видов умеренных широт грады (таблица 1). Ключевое влияние на современную систематику бокоплодных мхов и мохообразных в целом оказывают результаты молекулярно-филогенетических исследований, которые позволяют прояснить первые этапы эволюции мохообразных и изучить филогенетические отношения на разных таксономических уровнях. Данные геносистематиков позволяют не только проверять существующие филогенетические гипотезы, но и предлагать новые.
Выделение ДНК
Препараты суммарной ДНК получали с использование двух, методов: стандартной методики выделения ДНК с применением цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) (Doyle & Doyle 1987) или с помощью набора для экстракции растительной ДНК - Nucleospin Plant Extraction Kit ("Machery-Nagel", Германия). При наличии гербарного материала в количестве около 30-60 мг препараты ДНК получали ЦТАБ-методом (Doyle & Doyle 1987) с небольшими модификациями. Взвешенный растительный материал в горячей ступке растирали с предварительно нагретым до 60С ЦТАБ-буфером (2% ЦТАБ, 1,4 М NaCI, 100 мМ трис-HCl, рН 8,0, 20 мМ ЭДТА, 0,2% 2-меркаптоэтанола, 1% поливинилпирролидона, 1% Na SC ) около 1 мл на образец, далее суспензию переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорф. Содержимое пробирок ресуспензировали на вортексе, после чего смесь инкубировали в водном термостате 30-60 минут при 55-60сС, периодически встряхивая. К охлажденной до комнатной температуры суспензии добавляли 2/3 объема смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и встряхивали в течение 3 минут. Эмульсию расслаивали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5-10 мин. Верхнюю фазу аккуратно переносили в чистую пробирку, стараясь не захватить интерфазу, содержащую клеточный дебрис, и повторяли обработку суспензии смесью хлороформа и изоамилового спирта. После повторной обработки водную фазу отбирали в чистую пробирку Эппендорф, добавляли 2/3 объема холодного изопропанола, аккуратно перемешивали и оставляли на 1-3 часа при -20С.
Осадок ДНК собирали центрифугированием в течение 5-10 мин. при 13000 об/мин, далее осадок промывали 80% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в минимальном объеме стерильной дистиллированной воды или ТЕ-буфера с уменьшенным в 10 раз содержанием ЭДТА (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), Для эффективного удаления полисахаридов, присутствующих в готовых препаратах ДНК, мы применяли дополнительный метод очистки с использованием адсорбирующих ДНК частиц из набора реагентов GeneClean Bio 101. К препарату суммарной ДНК добавляли три объема Nal (6 М Nal из GeneClean Bio 101) и 2-3 мкл суспензии адсорбирующих ДНК частиц ("glass milk" из GeneClean Bio 101). Смесь перемешивали и оставляли во льду на 10 мин., встряхивая каждые 2-3 мин. Далее адсорбирующие частицы, связанные с ДНК, осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 1 мин., водную фазу удаляли. Осадок промывали три раза 500 мкл раствора New Wash (GeneClean ВІо 101) или в 80% охлажденном до -20С этаноле, каждый раз осторожно перемешивая пипетированием и центрифугируя 30 секунд. Осадок, состоящий из связанных с ДНК адсорбирующих частиц, ресуспензировали в 20-50 мкл стерильной дистиллированной воды, далее смесь инкубировали 10 мин. при 55-60С в водяном термостате, при этом происходит высвобождение ДНК в раствор. Частицы "glass milk" осаждались центрифугированием в течение 1 мин. при 13000 об/мин, водную фазу, содержащую ДНК, аккуратно переносили. в чистый Эппендорф. Данный метод позволяет эффективно избавиться от полисахаридов и вторичных соединений, ингибирующих работу Taq ДНК-полимеразы в ходе полимеразной цепной реакции.
При минимальном количестве исходного гербарного материала (менее 20 мкг), препараты ДНК получали с использованием набора для экстракции растительной ДНК - Nucleospin Plant Extraction Kit ("Machery-Nagel" Германия), следуя стандартному протоколу производителя. Предварительно, растительный материал с помощью микропестика растирали в 1,5 мл пробирке Эппендорф с жидким азотом до состояния мелкой пудры. Заключительную элюцию ДНК проводили в 50 мкл ТЕ буфера с 1мМ ЭДТА. Образцы ДНК хранили при -20С. Выход ДНК составил от 5 до 100 мкг на 0,1 г растительного материала. Для амплификации внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона ядДНК использовали пару внешних праймеров L и 4 (White et al. 1990). Получали амплификат, состоящий из 5 последних нуклеотидоз гена 18S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1), гена 5,8S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) и 10 - 15 первых нуклеотидов гена 26S рРНК. При секвенировании ITS 1 и ITS2 использовали наряду с внешними праймерами пару внутренних праймеров: 2 и 3 (White et al. 1990) (рисунок 10). Полимеразную цепную реакцию проводили в стерильных 0,5 мл микроцентрифужных пробирках Эппендорф в 25 мкл смеси, содержащей около 20 нг ДНК, 60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритон Х-100, 200 мкМ каждого dNTP, 12,5 пМ каждого праймера и 2,5 ед. Taq ДНК - полимеразы ("Сибэнзим"). На реакционную смесь наслаивали 50 мкл стерильного минерального масла. Амплификацию проводили в приборе "Терцик МС-П" ("ДНК-технология", Россия) по следующей схеме: Начальная денатурация - 94С, 3 минуты; денатурация - 94С 50 секунд; 30 циклов заключительный цикл отжиг праймеров - 58С 40 секунд; элонгация - 72С 1 минута; денатурация - 94С 50 секунд; отжиг праймеров - 58С 40 секунд; элонгация - 72С 3 минуты.
Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК и ПЦР-продуктов осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 0,8 - 1,5 % -ные агарозные гели в трис-ацетатном буфере с ЭДТА {Sambrook et al. 1989). Для слежения за ходом электрофореза к образцам добавляли бромфеноловый синий и ксиленцианол. Маркерами размеров ДНК служили фрагменты ДНК фага X после расщепления рестриктазами Hindlll и Pstl. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и просматривали при УФ- освещении на трансллюминаторе. применяли препаративный гель-электрофорез. Для препаративного электрофореза использовали агарозу SeaKem GTG. Просматривая окрашенный бромистым этидием агарозный гель в ультрафиолете, аккуратно вырезали участок геля, содержащий искомый фрагмент ДНК и помещали его в микропробирку. Элюцию ДНК осуществляли плавлением агарозного матрикса, для чего пробирку с фрагментом геля помещали на 10 - 20 минут в водяной термостат, нагретый до 60С. Для очистки - амплификата использовали набор GFX PCR Purification Kit ("Amersham Pharmacia", США), следуя протоколу производителя. Амплификат элюировали в 30 — 60 мкл стерильной дистиллированной воды. Концентрацию очищенного ПЦР-продукта оценивали визуально по яркости флуоресценции бромистого этидия после электрофореза в горизонтальном 1%-ном агарозном геле.
Для секвенирования искомых фрагментов концентрация матрицы побиралась в пределах 20-50 нг.. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit в Центре общего пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В, А Энгельгарда). Там же. осуществлялся электрофорез полученных фрагментов на автоматическом секвенаторе Avant 3100 automated DNA sequencer (Applied Biosystems). Выравнивание последовательностей осуществлялось вручную с помощью программы SED из пакета «Восторг» (Zharkikh et al. 1990). Филогенетические деревья были построенные несколькими методами. Для построения филогенетических деревьев методом ближайшего связывания (neighbour-joining, NJ) использовалась программа TREECON 1.3b (Van de Peer & De Wachter 1997). При построении матрицы различий использовали р-расстояния и двухпараметрическую модель фиксации нуклеотидных замен (Kimura 1980).
В качестве статистической поддержки индивидуальных узлов при построении филогенетических деревьев применялся метод бутстрепа (Felsenstein 1985; Вейр 1995). Рассчитываемые согласно этому методу значения индекса бутстрепа соответствуют доле деревьев (в процентах) в серии процедур (реплик) бутстрепа, в которых данная группа видов образует монофилетический кластер. В нашей работе значимость реконструкций оценивалась методом бутстрепа с использованием 2000 реплик. Байесовская реконструкция филогении (MB) с использованием в качестве критерия функции максимального правдоподобия была проведена с помощью программы MrBayes ver. 3.0В4 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). При байесовской реконструкции филогении использовалась GTR+I+Г модель нуклеотидных замен, было задано 2000000 генераций, деревья сохранялись каждые 10 генераций, первые. 65000 деревьев при анализе были опущены. Анализ методом максимальной экономии (maxinrum parsimony, MP), реализованный с помощью программы POY (Gladstein & Wheeler 2001), использующей метод прямой оптимизации без предварительного выравнивания, был проведен S. Huttunen на восьмипроцессорном компьютере «Silicon Graphics Origin 2000/128» в научно-вычислительном центе «Espoo», Финляндия. Использовалась опция эвристического поиска, ни один из признаков не был исключен, все признаки были одинаково взвешены. Полученное с помощью программы POY выравнивание было также использовано для анализа методом MP с помощью программ NONA (Goloboff 1994) и WINCLADA (Nixon 1999).
Филогенетические связи рода Hygrohypnum
Препараты суммарной ДНК получали с использование двух, методов: стандартной методики выделения ДНК с применением цетилтриметиламмонийбромида (ЦТАБ) (Doyle & Doyle 1987) или с помощью набора для экстракции растительной ДНК - Nucleospin Plant Extraction Kit ("Machery-Nagel", Германия). При наличии гербарного материала в количестве около 30-60 мг препараты ДНК получали ЦТАБ-методом (Doyle & Doyle 1987) с небольшими модификациями.
Взвешенный растительный материал в горячей ступке растирали с предварительно нагретым до 60С ЦТАБ-буфером (2% ЦТАБ, 1,4 М NaCI, 100 мМ трис-HCl, рН 8,0, 20 мМ ЭДТА, 0,2% 2-меркаптоэтанола, 1% поливинилпирролидона, 1% Na SC ) около 1 мл на образец, далее суспензию переносили в 1,5 мл пробирку Эппендорф. Содержимое пробирок ресуспензировали на вортексе, после чего смесь инкубировали в водном термостате 30-60 минут при 55-60сС, периодически встряхивая. К охлажденной до комнатной температуры суспензии добавляли 2/3 объема смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1) и встряхивали в течение 3 минут. Эмульсию расслаивали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 5-10 мин. Верхнюю фазу аккуратно переносили в чистую пробирку, стараясь не захватить интерфазу, содержащую клеточный дебрис, и повторяли обработку суспензии смесью хлороформа и изоамилового спирта. После повторной обработки водную фазу отбирали в чистую пробирку Эппендорф, добавляли 2/3 объема холодного изопропанола, аккуратно перемешивали и оставляли на 1-3 часа при -20С. Осадок ДНК собирали центрифугированием в течение 5-10 мин. при 13000 об/мин, далее осадок промывали 80% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в минимальном объеме стерильной дистиллированной воды или ТЕ-буфера с уменьшенным в 10 раз содержанием ЭДТА (10 мМ трис-НС1, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), Для эффективного удаления полисахаридов, присутствующих в готовых препаратах ДНК, мы применяли дополнительный метод очистки с использованием адсорбирующих ДНК частиц из набора реагентов GeneClean Bio 101. К препарату суммарной ДНК добавляли три объема Nal (6 М Nal из GeneClean Bio 101) и 2-3 мкл суспензии адсорбирующих ДНК частиц ("glass milk" из GeneClean Bio 101). Смесь перемешивали и оставляли во льду на 10 мин., встряхивая каждые 2-3 мин. Далее адсорбирующие частицы, связанные с ДНК, осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 1 мин., водную фазу удаляли. Осадок промывали три раза 500 мкл раствора New Wash (GeneClean ВІо 101) или в 80% охлажденном до -20С этаноле, каждый раз осторожно перемешивая пипетированием и центрифугируя 30 секунд.
Осадок, состоящий из связанных с ДНК адсорбирующих частиц, ресуспензировали в 20-50 мкл стерильной дистиллированной воды, далее смесь инкубировали 10 мин. при 55-60С в водяном термостате, при этом происходит высвобождение ДНК в раствор. Частицы "glass milk" осаждались центрифугированием в течение 1 мин. при 13000 об/мин, водную фазу, содержащую ДНК, аккуратно переносили. в чистый Эппендорф. Данный метод позволяет эффективно избавиться от полисахаридов и вторичных соединений, ингибирующих работу Taq ДНК-полимеразы в ходе полимеразной цепной реакции. При минимальном количестве исходного гербарного материала (менее 20 мкг), препараты ДНК получали с использованием набора для экстракции растительной ДНК - Nucleospin Plant Extraction Kit ("Machery-Nagel" Германия), следуя стандартному протоколу производителя. Предварительно, растительный материал с помощью микропестика растирали в 1,5 мл пробирке Эппендорф с жидким азотом до состояния мелкой пудры. Заключительную элюцию ДНК проводили в 50 мкл ТЕ буфера с 1мМ ЭДТА. Образцы ДНК хранили при -20С. Выход ДНК составил от 5 до 100 мкг на 0,1 г растительного материала. Для амплификации внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона ядДНК использовали пару внешних праймеров L и 4 (White et al. 1990). Получали амплификат, состоящий из 5 последних нуклеотидоз гена 18S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 1 (ITS1), гена 5,8S рРНК, внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) и 10 - 15 первых нуклеотидов гена 26S рРНК. При секвенировании ITS 1 и ITS2 использовали наряду с внешними праймерами пару внутренних праймеров: 2 и 3 (White et al. 1990) (рисунок 10). Полимеразную цепную реакцию проводили в стерильных 0,5 мл микроцентрифужных пробирках Эппендорф в 25 мкл смеси, содержащей около 20 нг ДНК, 60 мМ трис-HCl (рН 8,5), 25 мМ КС1, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритон Х-100, 200 мкМ каждого dNTP, 12,5 пМ каждого праймера и 2,5 ед. Taq ДНК - полимеразы ("Сибэнзим"). На реакционную смесь наслаивали 50 мкл стерильного минерального масла. Амплификацию проводили в приборе "Терцик МС-П" ("ДНК-технология", Россия) по следующей схеме: Начальная денатурация - 94С, 3 минуты; денатурация - 94С 50 секунд; 30 циклов заключительный цикл отжиг праймеров - 58С 40 секунд; элонгация - 72С 1 минута; денатурация - 94С 50 секунд; отжиг праймеров - 58С 40 секунд; элонгация - 72С 3 минуты. Процесс электрофоретического фракционирования препаратов ДНК и ПЦР-продуктов осуществляли в зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК и требуемого разрешения, используя 0,8 - 1,5 % -ные агарозные гели в трис-ацетатном буфере с ЭДТА {Sambrook et al. 1989). Для слежения за ходом электрофореза к образцам добавляли бромфеноловый синий и ксиленцианол.
Маркерами размеров ДНК служили фрагменты ДНК фага X после расщепления рестриктазами Hindlll и Pstl. Гели окрашивали в растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и просматривали при УФ- освещении на трансллюминаторе. применяли препаративный гель-электрофорез. Для препаративного электрофореза использовали агарозу SeaKem GTG. Просматривая окрашенный бромистым этидием агарозный гель в ультрафиолете, аккуратно вырезали участок геля, содержащий искомый фрагмент ДНК и помещали его в микропробирку. Элюцию ДНК осуществляли плавлением агарозного матрикса, для чего пробирку с фрагментом геля помещали на 10 - 20 минут в водяной термостат, нагретый до 60С. Для очистки - амплификата использовали набор GFX PCR Purification Kit ("Amersham Pharmacia", США), следуя протоколу производителя. Амплификат элюировали в 30 — 60 мкл стерильной дистиллированной воды. Концентрацию очищенного ПЦР-продукта оценивали визуально по яркости флуоресценции бромистого этидия после электрофореза в горизонтальном 1%-ном агарозном геле. Для секвенирования искомых фрагментов концентрация матрицы побиралась в пределах 20-50 нг.. Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось методом циклического секвенирования с использованием набора реагентов ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit в Центре общего пользования «Геном» (Институт молекулярной биологии РАН им. В, А Энгельгарда). Там же. осуществлялся электрофорез полученных фрагментов на автоматическом секвенаторе Avant 3100 automated DNA sequencer (Applied Biosystems).
Выравнивание последовательностей осуществлялось вручную с помощью программы SED из пакета «Восторг» (Zharkikh et al. 1990). Филогенетические деревья были построенные несколькими методами. Для построения филогенетических деревьев методом ближайшего связывания (neighbour-joining, NJ) использовалась программа TREECON 1.3b (Van de Peer & De Wachter 1997). При построении матрицы различий использовали р-расстояния и двухпараметрическую модель фиксации нуклеотидных замен (Kimura 1980). В качестве статистической поддержки индивидуальных узлов при построении филогенетических деревьев применялся метод бутстрепа (Felsenstein 1985; Вейр 1995). Рассчитываемые согласно этому методу значения индекса бутстрепа соответствуют доле деревьев (в процентах) в серии процедур (реплик) бутстрепа, в которых данная группа видов образует монофилетический кластер. В нашей работе значимость реконструкций оценивалась методом бутстрепа с использованием 2000 реплик. Байесовская реконструкция филогении (MB) с использованием в качестве критерия функции максимального правдоподобия была проведена с помощью программы MrBayes ver. 3.0В4 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). При байесовской реконструкции филогении использовалась GTR+I+Г модель нуклеотидных замен, было задано 2000000 генераций, деревья сохранялись каждые 10 генераций, первые. 65000 деревьев при анализе были опущены. Анализ методом максимальной экономии (maxinrum parsimony, MP), реализованный с помощью программы POY (Gladstein & Wheeler 2001), использующей метод прямой оптимизации без предварительного выравнивания, был проведен S. Huttunen на восьмипроцессорном компьютере «Silicon Graphics Origin 2000/128» в научно-вычислительном центе «Espoo», Финляндия. Использовалась опция эвристического поиска, ни один из признаков не был исключен, все признаки были одинаково взвешены. Полученное с помощью программы POY выравнивание было также использовано для анализа методом MP с помощью программ NONA (Goloboff 1994) и WINCLADA (Nixon 1999).
О роли морфологических признаков в систематике бокоплодных мхов в свете молекулярно-эволюционных данных
Рассмотрение некоторых морфологических признаков бокоплодных мхов подводит нас к анализу полученных в исследовании данных с точки зрения традиционной систематики. Нами уже отмечалось, что на протяжении долгого времени в систематике господствующей: являлась концепция первостепенной значимости признаков перистома при классификации мхов. Выделенные на этом основании таксономические группы верхоплодных мхов во многом совпали с результатами, полученными в молекулярно-филогенетических исследованиях этой группы (Goffinet et al. 2001). Обратная картина сложилась при исследовании бокоплодных мхов молекулярными методами. Будучи эволюционно молодой группой, бокоплодные мхи морфологически довольно однообразны, в большинстве классификаций определяющими систематическое положение таксона признаками являются особенности строения спорофита и перистома. Многие изученные нами семейства бокоплодных мхов порядка Hypnales включают таксоны с двойным перистомом, однако в зависимости от условий произрастания вида часто наблюдаются отклонения от полно развитого типа строения перистома. Так, при обитании на стволах деревьев (мхи-эпифиты) или при обитании в водоемах часто происходит редукция или модификация эндостома вплоть до полной редукции перистома (Игнатов & Игнатова 2004).
Многие семейства бокоплодных мхов включают таксоны с разной степенью редукции перистома (Fabroniaceae, Leskeaceae, Pterigynandraceae, Anomodontaceae, Myriniaceae и др.). Кроме того, для некоторых семейств наличие редуцированного перистома служило основным признаком для объединения его родов, как в случае, например, с семейством Pterigynandraceae (Buck & Crum 1990).. Оказалось, что выделенные в рамках традиционной систематики группы бокоплодных мхов часто являются на основании анализа последовательностей ДНК поли- или парафилетичными таксонами. Как пример этому, полученные нами данные о полифилетичности семейств Pterigynandraceae, Leskeaceae, Hypnaceae и др., а также полученные Vanderpoorten et al. (2002а) данные о полифилетичности Amblystegiaceae, Tsubota et aL (2002) о полифилетичности Hypnaceae и т.д. Выводы о филогенетическом родстве и систематическом положении бокоплодных мхов, сделанные на основании признаков перистома, часто противоречивы и проводят к различным трактовкам филогении той или иной группы. Например, случай с родами Habrodon и Anomodon, относимыми в разные семейства: бокоплодных мхов из-за наличия редуцированного перистома. Значимость других морфологических признаков, например наличие и характер псевдопарафиллий, систематиками явно недооценивалось. Например, как в случае с Brachytheciaceae, объем семейства по структуре псевдопарафиллий и по данным анализа последовательностей ДНК оказались идентичными (Huttunen & Ignatov 2004). Полученные в нашем исследовании новые данные о филогенетических взаимоотношениях ряда крупных семейств бокоплодных мхов свидетельствуют не только о необходимости ревизии этих таксонов, но и необходимости пересмотреть значение признаков перистома при классификации бокоплодных мхов. Например, крупное семейство Hypnaceae, включающее таксоны с гипноидным типом перистома, оказывается полифилетичным.
Семейство распалось на несколько монофилетичных клад, которые в рамках традиционной систематики могут трактоваться как самостоятельные семейства. Аналогичная ситуация — дробление крупного семейства не несколько мелких монофилетичных групп, сложилась и с Leskeaceae. Интересно отметить, что обособление таких мелких семейств является в ряде случаев не открытием геносистематики, а возвратом к описанным первоначально монотипным или олиготипным семействам. Семейства Habrodontaceae (Schimper 1860), Pseudoleskeaceae (Schimper 1860), Leskeaceae (включающее род Leskea) (Schimper 1855), Pylaisiaceae (Schimper 1860) были описаны ранее и впоследствии в результате ревизий разными исследователями объединены в более крупные семейства. Дополнительными маркерами той или иной эволюционной линии организмов могут служить признаки вторичной структуры макромолекул (Петров, Алешин 2002). Для поиска синапоморфных маркеров выявленных нами в результате филогенетического анализа монофилетичных групп бокоплодных мхов мы проанализировали вторичную структуру интрона гена тРНК лейцина хпДНК и внутреннего транскрибируемого спейсера 2 (ITS2) яд-рДНК. Рисунок. 24. Вторичная структура гена тРНК лейцина хпДНК вида Anthoceros angustus (Anthocerotophyta) (Stech et al. 2003). Стрелкой указано положение интрона trnL в антикодоне между нуклеотидами U и А. Интрон гена trnLuAA является интроном первой группы и обнаруживает характерные для интронов этой группы черты (рис. 25): интронам этой группы (табл. 7). Последовательности Р, Q, R, S, выделенные в таблице 7 жирным шрифтом, обнаружены у большинства исследованных видов мхов. У ряда видов были найдены нуклеотидные замены в этих последовательностях (нуклеотиды, выделенные наклонным шрифтом, табл. 7). Нуклеотидные мотивы (подчеркнутые в табл. 7), которые участвуют в формировании комплементарных пар во вторичной: структуре, сохраняются неизменными. Средняя длина интрона trnLVAA бокоплодных мхов порядка Hypnales составила 275 п.н,, интрон наибольшей длины был отмечен у вида Rauielli jujisana (сем. Thuidiaceae), его длина 282 п.н. Интрон наименьшей длины (242 п.н.) обнаружен у вида Leskea gracilescens (сем. Leskeaceae). Представители других порядков бокоплодных мхов (Hookeriales и Leucodontales) характеризуются большей длиной интрона, - это 308 п.н у Hookeria lucens (порядок Hookeriales) и 328 п.н. у Distichophyllum pulchellum (порядок Leucodontales). Увеличение длины интрона у этих видов в первую очередь связано с наличием вставок в домене Р8 размером 43 п.н. у Hookeria lucens и 58 п.н. у Distichophyllum pulchellum. Мы сравнили полученные нами данные о размерах интрона с литературными. Так, Stech et.al. (2003а) показал, что средняя длина интрона мохообразных отдела Anthocerotophyta равна 671 п.н., максимальные размеры интрона (841 п.н.) были обнаружены у вида Dendroceros validus. Размеры интрона рассмотренных видов близки к размерам интрона TILUAA печеночников (263-377 п.н.) и папоротников (253-588 п.н.) (Stech et al. 2003а). Анализ нуклеотидного состава последовательностей интрона показал, что интрон богат AT нуклеотидамй.
Среднее содержание GC нуклеотидов у бокоплодных мхов составляет 27%, что является близким к соответствующим значениям у антоцеротовых мохообразных (28,3%) и печеночников (26,4%), в то время как зеленые водоросли (34,1%), папоротники (33,8%) и семенные растения (36,0%)) характеризуются более высоким содержанием GC (Stech et. al. 2003а) (диаграмма 1). Самым вариабельным участком интрона J/TZLUAA У бокоплодных мхов является домен Р8 (рис. 26), его длина варьирует от 41 п.н. у Leskea gracilescens (сем. Leskeaceae) до 107 п.н. у Hookeria lucens (сем. Hookeriaceae) и 127 п.н. у Distichophyllum pulchellum. Некоторые виды имеют позиционно гомологичные вставки разной длины в участке Р8, это виды Hookeria lucens (43 п.н.), Anomodon longifolius (19 п.н.), Distichophyllum pulchellum (58 п.н.), Fontinalis welchiana (18 п.н.). Среднее содержание GC в домене Р8 (16,4 % ) значительно ниже среднего показателя GC для целого интрона (27%), в то время как содержание GC в интроне при исключении Р8 повышается до 30,4%. Другой, достаточно вариабельный участок интрона у бокоплодных мхов - это шпилька Рб (рис. 27). Здесь нами отмечена высокая консервативность первых трех нуклеотидных пар шпильки наряду с частыми заменами нуклеотидов во внутренней петле и терминальной части дуплекса. Особенностью Р6 бокоплодных мхов является наличие большой внутренней петли в центральной части шпильки. Все замены нуклеотидов, формирующих стебель шпильки, носят консервативный характер, так в парах G-U гуанин часто заменяется аденином. Длина Р6 варьирует в зависимости от числа повторов урадила в терминальной петле. Нами показано, что размер терминальной петли может служить маркером, характеризующим выделенные нами группы бокоплодных мхов. Так, все представители семейства Amblystegiaceae (роды Amblystegiumy Pseudo-calliergon, Drepanocladus, Palustriella falcate, Anacamptodon splachnoides, Cratoneuron filicinum), а также примкнувшие в результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей trriL— trnF и ITS1, ITS2 к этому семейству виды Campylidium sommerfeltii, Campylium stellatum, Serpoleskea confervoides, Hygrohypnum luridum и Hypnum bambergeri характеризуются длиной терминальной петли от 9 до 12 нуклеотидов. Примечательно, что такими же размерами концевой петли (9 н.) характеризуется представитель монотипного семейства Rhytidiaceae, Rhytidium rugosum.
Остальные исследованные группы бокоплодных мхов (Leskeaceae, Thuidiaceae, Hypnaceae и Анализ нуклеотидных последовательностей интрона показал, что стабильность вторичной структуры интрона в участках, где были отмечены наиболее частые мутации, сохраняется. В первую очередь, это объясняется консервативным характером найденных нуклеотидных замен в стеблях шпилек. Анализ точечных мутаций позволил нам обнаружить ряд синапоморфных замен, характеризующих отдельные эволюционные линии мхов. Так, полученные нами данные о полифилетичности семейства Leskeaceae подтверждаются характером распределения ряда уникальных замен в доменах Р8, Р5, Р9. Виды рода Lescuraea (L. incurvata, L. saxicola, L. patent и др.), Ptychodium plicatulum и Rigodiadelphus robustus обладают общей консервативной заменой аденина на гуанин в домене Р8 (рис. 29). Близость же Leskea к представителям рода Haplocladium и семейству Thuidiaceae (Thuidium delicatulum, Т. tamariscinum, Abietinella abietina, Rauielli fujisana, Helodium blandowii) подтверждается общими уникальными заменами нуклеотидов в шпильках Р5 и Р9 (рис. 28). Однако, следует отметить, что отмеченная для этой группы видов замена в Р5 была найдена и у далеких от клады Haplocladium+Leskea+ ТЬиійіжсяо видов, таких как Ptilium crista-castrensis и Hylocomium splendens.
