Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы.
2.1 Общий план строения и особенности хлоропластных геномов д высших растений.
2.2 Закономерности эволюции хлоропластных геномов
2.3 Применение полных последовательностей хлоропластного генома для реконструкции филогении растений.
2.4 Некодирующие участки хлоропластного генома, особенности их структуры, эволюции и использование в филогенетическом анализе .
3. Материалы и методы. 40
3.1 Растительный материал. 40
3.2 Подбор праймеров для амплификации и секвенирования хлоропластного генома гречихи
3.3 Выделение ДНК, амплификация и секвенирование. 41
3.4 Сборка полной последовательности (контига) и аннотация 42
хлоропластного генома.
3.5 Выравнивание и филогенетический анализ. 43
3.6 Анализ случайных выборок и сравнение возможности использования генов для реконструкции филогении.
4 Результаты и обсуждение. 49
4.1 Опредение и анализ полной нуклеотидной последовательности хлоропластного генома гречихи. 49
4.1.1 Универсальные праймеры и возможность их использования для амплификации и секвенирования хлоропластных геномов цветковых растений.
4.1.2 Структурный и сравнительный анализ хлоропластного генома гречихи.
4.1.3 Границы инвертированного повтора хлоропластного генома гречихи и других представителей Polygonaceae.
4.2 Филогенетический анализ цветковых растений с использованием последовательностей хлоропластных генов .
4.2.1 Анализ объединенного набора из гена. "6
4.2.2 Редактирование РНК генов rpl2, ndhD и psbL и возможные пути его эволюции. 76
4.3 Анализ случайных выборок и оценка филогенетической значимости отдельных хлоропластных генов и групп генов. 79
4.4 Изучение полиморфизма некодирующих участков хлоропластной ДНК (на примере спейсера trnH-psbA) у близких видов и возможности их использования для реконструкции филогении на низком таксономическом уровне. 37
5 Заключение. 95
6 Выводы. 97
7 Список работ, опубликованных по теме диссертации. 98
8 Список литературы.
- Закономерности эволюции хлоропластных геномов
- Некодирующие участки хлоропластного генома, особенности их структуры, эволюции и использование в филогенетическом анализе
- Подбор праймеров для амплификации и секвенирования хлоропластного генома гречихи
- Филогенетический анализ цветковых растений с использованием последовательностей хлоропластных генов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Информация о последовательстях геномов хлоропластов широко применяется в самых различных областях биологии растений. Это прежде физиология и молекулярная генетика фотосинтеза -знание последовательностей генов, продукты которых участвуют в этом процессе, значительно расширяет возможности его изучения. Отдельные участки хлоропластного генома широко применяются в молекулярно-филогенетическом анализе и служат важным инструментом для выяснения происхождения и родственных связей растений. Изучение хлоропластных геномов имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение. Известно, что трансформация хлоропластов является перспективным методом биоинженерии растений. Она имеет ряд важных преимуществ перед внедрением чужеродных ДНК в геном ядра (Grevich, Daniell 2005). Одним из препятствий для распространения технологии генетической инженерии хлоропластов является отсутствие данных по последовательностям их геномов. Интеграция чужеродных генов в хлоропластный геном происходит сайт-специфически. Поэтому анализ последовательности генома - одна из необходимых стадий при конструкции эффективных векторов для трансформации хлоропластов (Maliga 2002).
В настоящее время секвенированы (определены нуклеотидные последовательности) более 100 хлоропластных геномов наземных растений, из которых более 80 видов относятся к покрытосеменным растениям. Прежде всего это некоторые экономически важные растения - соя, кукуруза, рис, томат, кофе, картофель, морковь, а также модельные объекты генетики и физилогии растений - арабидопсис, шпинат, табак. В последние годы стало возможным определять хлоропластные геномы растений, не имеющих практической значимости, но представляющих интерес для фундаментальной науки, прежде всего эволюционной биологии. Показано, что анализ полных последовательностей геномов органелл способен разрешить многие спорные вопросы филогении эукариот. Однако к настоящему моменту набор таксонов растений с полностью секвенированными хлоропластпыми геномами явно недостаточен, что может привести к существенным искажениям результатов. Как итог, исследователь сталкивается с необходимостью определять полные последовательности геномов хлоропластов у очень большого числа таксонов, что по многим (в том числе - техническим и финансовым) причинам не всегда возможно. Кроме этого, для филогенетического анализа данных по полным последовательностям геномов необходимо привлекать значительные вычислительные ресурсы, что также затруднительно. Альтернативой секвенированию и анализу полных последовательностей хлоропластных геномов может стать поиск и использование минимального количества генов, филогенетический анализ которых даёт те же результаты, что и анализ максимального числа хлоропластных генов. Схема вычислительного эксперимента, позволяющего сделать это, была предложена (Антонов 2006), но до настоящего времени не была осуществлена.
Отдельные участки хлоропластного генома, преимущественно некодирующие, широко используются для филогенетического анализа на низком таксономическом уровне (Kelchner 2000, 2002), для популяционно-генетических исследований (Powell et al., 1995, Mohanty et al., 2002). В последние годы было предложено применять их для ДНК-штрихкодирования (то есть идентификации видов по последовательностям ДНК) растений (Kress et al., 2005, Lahaye et al., 2008). Однако закономерности эволюции некодирующей ДНК хлоропластов достаточно сложны и требуют особого внимания к процедурам выравнивания и построения филогенетического древа (Kelchner 2000; Borsch et al., 2003; Lohne, Borsch 2005); кроме того, ввиду известного явления неэквивалентности таксонов растений (Antonov et al., 1988) эти закономерности могут отличаться в разных группах растений. Цель и задачи исследования. Первой целью работы явилось определение полной последовательности хлоропластного генома гречихи, его структурный анализ и филогенетический анализ цветковых растений с привлечением этой новой последовательности. Второй целью явилось проведение оценки филогенетической значимости отдельных хлоропластных генов - для поиска маркера, наилучшим образом согласующегося с результатами анализа полного генома, а также изучение особенностей структуры некодирующих участков хлоропластной ДНК у близких видов цветковых растений в контексте ДНК-штрихкодирования.
В рамках поставленных целей решались следующие задачи:
1. Разработать набор универсальных праймеров для амплификации и секвенирования хлоропластного генома, провести подбор условий для работы этих праймеров.
2. Провести определение и аннотацию полной последовательности хлоропластного генома гречихи Fagopyrum esculentum ssp. ancestrale, а также сравнение его с хлоропластными геномами других цветковых растений.
3. Провести филогенетический анализ цветковых растений (включая Fagopyrwn) на основе мультигенного набора 61 хлоропластного белок-кодирующего гена.
4. Проанализировать филогенетическую значимость белок-кодирующих хлоропластных генов, общих для цветковых и голосеменных растений.
5. Изучить полиморфизм некодирующего участка хлоропластного генома trnH-psbA у группы близких видов цветковых растений и особенности его структуры и оценить возможность применения его для филогенетического анализа и для идентификации видов. Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые была определена последовательность хлоропластного генома гречихи (Fagopyrum esculentum ssp. ancestrale), проведена её аннотация и структурный анализ. Аннотированная последовательность занесена в международную базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank (номер записи EU254477). Это вторая полная последовательность хлоропластного генома крупной группы цветковых растений (включает более 11 000 видов) - порядка Caryophyllales и вторая полная последовательность хлоропластного генома, определенного в России. Секвенирование хлоропластного генома гречихи позволит совершенствование методов биотехнологии в применении к этому объекту, а именно разработку векторов для получения трансгенных растений.
Создан набор универсальных праймеров, которые могут использоваться для амплификации и секвенирования участков уникальных областей хлоропластного генома у широкого круга цветковых растений. Проверена применимость созданного ранее (Dhingra, Folta, 2005) подобного набора для участков инвертированного повтора. Помимо этого, создан набор таксон-специфичных праймеров для амплификации и секвенирования хлоропластной ДНК гречихи, который может быть использован для изучения генетического полиморфизма видов и сортов гречихи.
Проведен филогенетический мультигенного набора из 61 хлоропластного гена, который позволил прояснить положение порядка Caryophyllales в системе цветковых. Изучена зависимость уровня разрешенности филогенетического дерева от длины последовательности и филогенетическая значимость отдельных хлоропластных генов и групп генов. Выявлена группа генов, дающих наилучшие (сравнимые с результатом анализа набора из 61 гена) результаты филогенетического анализа.
Изучен внутривидовой и межвидовой полиморфизм некодирующего участка хлоропластной ДНК - спейсера trnH-psbA, выявлены консервативные элементы его первичной и вторичной структуры. Все полученные последовательности занесены в базу данных GenBank. Изучение этого участка особенно актуально в свете того, что он был предложен в качестве универсального ДНК-штрихкода (участка генома, позволяющего идентификацию видов) для высших растений.
Закономерности эволюции хлоропластных геномов
Хлоропласты - это полуавтономные органеллы прокариотического происхождения, свойственные всем фотосинтезирующим эукариотам (рис. №1). Они обладают собственным геномом (пластомом), кодирующим в основном компоненты аппарата транскрипции и трансляции, а также некоторые белки фотосинтетического аппарата. У высших растений структура хлоропластного генома достаточно консервативна (Palmer, 1985). В большинстве случаев он представляет собой кольцевую молекулу ДНК длиной от 120 до 217 тпн. Исключение составляют геномы пластид нефотосинтезирующих растений, для многих из которых характерна потеря части генов, кодирующих белки фотосинтетического аппарата. В отдельных случаях их длина может уменьшаться до 70-80 тпн. Характерная черта подавляющего большинства пластомов высших растений - наличие инвертированных повторов (их называют инвертированный повтор A (IRa) и инвертированный повтор В (IRb)) - участков средней длиной 20-30 тпн делящих хлоропластный геном на две неравные части большую (LSC) и малую (SSC) уникальные области. Инвертированный повтор отсутствует у голосеменных и некоторых бобовых (Strauss et al., 1988, Kato et al., 2000).
Ещё одна общая черта всех хлоропластных геномов - высокий уровень АТ-оснований - до 75% (Ravi et al., 2008). Одно из объяснений этого факта связано с предположением о происхождении хлоропластов от прокариот с АТ-богатым геномом. Однако, более вероятным представляется другое объяснение, состоящее в том, что пластидные геномы обогатились АТ-основаниями уже после эндосимбиоза (Howe et al., 2003). Косвенно в пользу этого говорит то, что геном цианобактерии Synechocystis (цианобактерии -фотосинтезирующие прокариоты, наиболее близкие к пластидам) имеет около 52% АТ-оснований (Nakamura et al., 1998), а геномы митохондрий - органелл, таюке произошедших птуем эндосимбиоза, и геномы некоторых облигатно паразитных бактерий также АТ-богаты. Содержание АТ-оснований несколько различается в разных частях генома - в инвертированном повторе оно минимально и составляет порядка 55-59% за счет более GC-богатых генов рРНК. Особенно сильный сдвиг в сторону АТ-оснований (AT-bias) наблюдается в межгенных спейсерах, а в кодирующих участках - в третьем положении кодона (Kusumi, Tachida 2005). Для пластидных геномов некоторых водорослей характерно сильное уменьшение доли GC-богатых кодонов. Гены пластидного происхождения, перенесенные в ядро, не показывают такого эффекта (Barbrook et al., 1998).
К настоящему времени определены полные нуклеотидные последовательности более 100 хлоропластных геномов высших растений (в основном цветковых). Первым был полностью секвенирован хлоропластный геном табака Nicotiana tabacum (Shinozaki et al., 1986, рис. 1); большинство хлоропластных геномов других цветковых сходны с ним по составу и по порядку генов. Как уже упоминалось, хлоропластный геном содержит набор генов, продукты которых необходимы для фотосинтеза, а также для работы аппарата транскрипции и трансляции.
К первым, прежде всего, относится ген rbcL, кодирующий большую субъединицу рибулозо-бисфосфат-карбоксилазы (Рубиско) — ключевого фермента фотосинтеза. У высших растений малая субъединица Рубиско кодируется расположенным в ядерном геноме геном rbcS. У водорослей rbcS также находится в геноме хлоропластов, причем rbcL и rbcS составляют единый оперон, как у цианобактерий. Отличается у них и структура гена rbcL - у высших растений он не имеет интронов, а у некоторых групп водорослей в этом гене есть интроны. Число и тип их у разных групп варьирует; интроны могут содержать открытые рамки считывания (Nozaki et al., 1998). Ген rbcL кукурузы - первый хлоропластный ген, последовательность которого была определена и опубликована (Mcintosh et al., 1980).
Некодирующие участки хлоропластного генома, особенности их структуры, эволюции и использование в филогенетическом анализе
Некодирующие участки хпДНК, ввиду их универсальности, относительной легкости получения последовательностей (фланкированы высококонсервативными кодирующими последовательностями, поэтому легко подобрать праймеры для амплификации и секвенирования) нашли широкое применение в качестве филогенетических маркеров, особенно на низком таксономическом уровне.
Это прежде всего интрон гена trnL и спейсер trnLrnF, иногда также и trnLmT. Размер интрона trnL варьирует от 350 до 600 п.н., спейсера trnLrnF - 120-350 п.н., a trnLmT - 500 - 1100 п.н. Эти участки чаще всего используются для филогенетических исследований на уровне рода и групп родов (например, Pardo et al., 2004, Bohs 2004), но иногда и на более высоком - семейств (Kyndt et al., 2005) и даже порядков (Borsch et al., 2003, Muller et al., 20066). В последнем случае требуется особое внимание к процедуре выравнивания и к методам построения филогенетических деревьев, что будет подробно обсуждено позднее. Показана также перспективность использования на низком таксономическом уровне спейсеров, разделяющих гены rbcL и atpB (Manen, Natali 1995, Chiang, Schaal, 2000), rbcL и accD (Yasui, Ohnishi 1998), trnH и psbA (Peterson et al., 2004, Namoff et al., 2007). Последний участок trnH-psbA - в последние годы привлек особенное внимание в связи с проектом ДНК-штрихкодирования - идентификации биологических образцов по последовательностям их ДНК. Для этого используется короткий вариабельный участок генома, последовательность которого может быть легко определена у широкого круга объектов и который обладает достаточной изменчивостью.
Для поиска такого участка у растений было проведено сравнение хлоропластных геномов близкородственных растений Nicotiana и Atropa (Solanaceae) и показано, что наибольешей вариабельностью отличается именно trnH-psbA (Kress et al., 2005). Этот участок, в сочетании с другим хлоропластным локусом - matK — был предложен как универсальный штрихкод для растений (Lahaye et al., 2008). Однако к настоящему времени появились данные о том, что у некоторых групп растений этот участок очень консервативен и что изменения в его последовательностях характеризуются высоким уровнем гомоплазии (Clark et al, 2006).
Меньшей вариабельностью отличаются некодирующие участки, находящиеся в инвертированном повторе и некоторые из них нашли свое применение в филогенетическом анализе на высоком таксономическом уровне. Это касается прежде всего внутренних транскрибируемых спейсеров хлоропластного рибосомного оперона (Goremykin et al.,1996).
Не менее, чем спейсеры, востребованы в филогенетическом анализе растений интроны хлоропластных генов: интрон грі 16 использовался для изучения родственных связей видов Chusquea (Poaceae) (Kelchner, Clark; 1997) и Gleditsia (Leguminosae) (Schnabel, Wendel; 1998), интрон rpsl6 - семейства Apiaceae (Downie, Katz-Downie, 1999), Rubiaceae (Smedmark et al., 2008) и многих других. Также иногда применяются интроны генов rpoCl (Petersen et al., 2001, Downie et al., 2000), petD (Lohne, Borsch 2005).
Однако особенности эволюции некодирующих участков хлоропластного генома, о которых было сказано выше (более быстрая и/или неравномерная скорость эволюции, структурные изменения и т.д. см. пункт 2.2), делают более сложным построение множественных выравниваний и собственно филогенетических деревьев, чем в случае кодирующих участков. Большинство ныне существующих алгоритмов были разработаны с расчётом на кодирующие участки генома, для которых более характерны замены, нежели структурные изменения. Поэтому такие изменения необходимо рассматривать отдельно и либо исключать из выравнивания, либо кодировать как отдельные признаки. Может быть также необходима значительная ручная коррекция выравнивания, полученного автоматически или полностью ручное выравнивание. Были сформулированы определенные правила для выравнивания некодирующих последовательностей хпДНК (Golenberg et al., 1993; Kelchner, 2000; Borsch et al., 2003; Lohne, Borsch, 2005).
Как и в отношении кодирующих последовательностей, корректное использование того или иного участка в филогенетическом анализе невозможно без учета особенностей его эволюции и функциональной нагрузки. Первоначально некодирующая ДНК считалась лишенной каких-либо функций и ненужной организму, так называемой «мусорной» Gunk) ДНК и предполагалось, что эволюция её полностью нейтральна. Однако на современном уровне развития науки становится очевидным, что некодирующие участки ДНК имеют важные функции, прежде всего структурные и регуляторные (Beaton, Cavalier-Smith, 1999; Shabalina, Spiridonov, 2004). Это во многом верно и для хлоропластной некодирующей ДНК. Так, многие межгенные спейсеры содержат промоторы и другие регуляторные элементы. Эти участки, в связи с их функциональной значимостью, находятся под давлением отбора и, как правило, отличаются консервативностью первичной и/или вторичной структуры. Так, в спейсере psbArnK (в части его, прилегающей к стартовому кодону psbA) был обнаружен участок, имеющий сходное строение у всех высших растений. Этот участок имеет вид обращенного повтора, и, вероятно, участвует в формировании вторичной структуры (шпильки), имеющей регуляторное значение.
Подбор праймеров для амплификации и секвенирования хлоропластного генома гречихи
Сборка полной последовательности хлоропластного генома гречихи проводилась в несколько стадий. Прежде всего были получены последовательности отдельных ампликонов путем парного выравнивания результатов секвенирования с прямого и с обратного праймеров и построения консенсусной последовательности с помощью программы BioEdit 7.0.9.0 (Hall, 1999). Затем находились участки перекрывания между соседними ампликонами - с помощью программ DotHelix (Leontovich et al., 1993) и Blast2seq (Tatusova, Madden, 1999) и последовательности их объединялись.
Для аннотации последовательности использовалась программа DOGMA - Dual Organellar GenoMe Annotator (Wyman, 2004). Эта программа осуществляет в автоматическом режиме поиск с помощью алгоритма BLAST по полным последовательностям хлоропластных геномов и предсказывает рамки считывания генов в заданной пользователем последовательности. Однако во многих случаях - если консервативность гена невысока или в случае коротких экзонов программа не всегда может правильно определить границы генов и их экзон-интронную структуру. Поэтому после первичной аннотации, проведенной с помощью DOGMA, нами проводилось уточнение аннотации. Оно включало сравнение отдельных участков последовательности с имеющимися в базе данных GenBank с помощью программы BLAST (Altshul et al., 1990), трансляцию in silico участков, в которых предполагалось наличие белок-кодирующих генов и поиск тРНК с помощью программы tRNAscan-SE (Lowe, Eddy, 1997).
После аннотации последовательность была подготовлена для подачи в международную базу данных GenBank с помощью программы Sequin 7.77 и после подачи ей был присвоен номер EU254477.
Моделирование вторичной структуры участков psbArnH проводилось с помощью с помощью интерактивной программы MFOLD (Zuker 2003), доступной на сервере The Rensselaer bioinformatics web server (http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/).
Для филогенетического анализа были выбраны гены, общие для хлоропластных геномов всех проанализированных к настоящему времени цветковых и голосеменных растений (см. таблицу Ш, приложение 1). Общее число их составляет 61 ген (см. таблицу П2, приложение 1). За основу было взято множественное выравнивание из последней на момент проведения анализа работы по филогении цветковых по последовательностям хлоропластного генома (Hansen et al., 2007), доступное из базы данных Chloroplast DB (Cui et al., 2006). К нему были добавлены соответствующие гены секвенированного нами хлоропластного генома Fagopyrum escidentum, а также секвенированных ранее хлоропластных геномов Lemna minor (Mardanov et al., 2008), Nandina domestica и Platanus occidentalis (Moore et al., 2006), которые не вошли в набор таксонов из работы Hansen с соавт. После добавления последовательностей набор был снова выравнен - в автоматическом режиме с помощью программы MUSCLE (Edgar 2004) с последующей ручной коррекцией с помощью программы BioEdit (коррекция выравнивания и часть филогенетического анализа была выполнена Самигулиным Т.Х.). Полная длина выравниваний составляет 42504 для набора нуклеотидных последовательностей и 14168 для набора аминокислотных последовательностей.
Филогенетический анализ проводили с применением метода максимальной экономии (maximum parsimony, MP) и метода Байеса (Bayesian inference, BI).
Филогенетический анализ методом MP проводили с помощью программы PAUP 4.08 (Swofford, 2003) со следующими установками. Алгоритм поиска максимально экономного дерева — эвристический, процедуру обмена ветвями осуществляли с помощью алгоритма реассоциации деревьев (tree bisection - reconnection, TBR). Все признаки рассматривались как неупорядоченные и равновесные. Проводили 100 поисков со случайным порядком добавления таксонов, делеции рассматривались как неопределенное состояние признака.
Филогенетический анализ цветковых растений с использованием последовательностей хлоропластных генов
Нами был проведен филогенетический анализ набора, включающего 44 вида семенных растений (42 цветковых и 2 голосеменных). Этот набор - один из наиболее полно представляющих разнообразие цветковых растений, хлоропластные геномы которых изучены к настоящему времени (для сравнения - набор из работы Hansen et al., 2007 составляет 39 таксонов, из работы Moore et al., 2007 - 45 таксонов). Полная длина набора нуклеотидных последовательностей после удаления неоднозначно выравниваемых позиций составила 42504 п. н., а аминокислотных - 14168 аминокислотных остатка. Некоторые характеристики выравнивания приведены в табл. 2.
Результатом анализа методом максимальной экономии набора нуклеотидных последовательностей стало единственное дерево (рис. 10). Топология дерева сходна с полученными в предыдущих работах по филогенетическому анализу полных хлоропластных геномов и в общих чертах сходна с результатами изучения небольшого числа генов. Первыми от общего ствола эволюции цветковых отходит ветвь, ведущая к Amborella, затем группа Nymphaea + Nuphar (оба растения - представители семейства Nymphaeaceae), затем Illicium (Illiciaceae). Все эти растения - представители упомянутой в обзоре группы ANITA. Следующим отходит Chloranthus (Chloranthaceae). Chloranthaceae -группа растений, обладающая уникальным сочетанием морфологических признаков, что позволяет выделить его в особый порядок, имеющая черты сходства как с растениями группы ANITA (особенно с семействами Trimeniaceae и Amborellaceae), так и порядком Piperales. Согласно палеоботаническим данным, хлорантовые - одно из самых древних семейств цветковых (Friis et al. 1986). Результаты молекулярно-филогенетического анализа согласуются в отношении того, что это семейство - одно из наиболее рано дивергировавших среди цветковых, но его точное положение на настоящий момент достаточно противоречиво, причём секвенирование и анализ полного хлоропластного генома Chloranthus не позволило полностью прояснить эти противоречия (Hansen et al., 2007).
Ещё одна из наиболее рано дивергировавших групп цветковых - группа, объединяющая Calycanthus, Liriodendron, Piper и Drimys. Эти растения отнесены в системе APG II к порядкам Magnoliales {Liriodendron), Canellales {Drimys), Laurales {Calycanthus) и Piperales {Piper), близкородственным как по морфологическим, так и по молекулярным (APGII, Qiu et al., 2007) данным. Анализ аминокислотных последовательностей говорит в пользу того, что этой группе принадлежит также и Chloranthus, хотя узел, объединяющий их, не имеет высокой поддержки.
Следующая крупная монофилетическая группа объединяет все представленные в наборе однодольные растения. Среди них сестринскую группу по отношению ко всем прочим однодольным составляет Acorus. Это согласуется с результатами предыдущих молекулярно-филогенетических работ, как основанных на малом числе генов, но большом числе видов (Soltis et al. 2000, Tamura et al. 2004), так и включающих анализ полных хлоропластных геномов (Leebens-Mack et al., 2005).
Другую крупную группу составляют так называемые eudicots - высшие двудольные. Среди них базальное положение занимают растения из порядка Ranunculales - Ranunculus и Nandina, а также Platanus. В системах, основанных на морфологии, Ranunculus и Nandina относят к классу Ranunculidae, который, как считается, занимает промежуточное положение между группой наиболее архаичных покрытосеменных и группой «типичных двудольных» (eudicots) (Takhtajan, 1997). В дереве, построенном по аминокислотным последовательностям, Ranunculus + Nandina формируют с Platanus монофилетическую группу (рис П.). Однако это объединение не имеет высокой поддержки и не выявляется при анализе других типов данных.(рис. 10, 12, 13)
