Введение к работе
Актуальность проблемы
Расшифровка полной структуры іенома человека позволила выявить большое количество новых генов, функция которых неизвестна. В свяїіі с этим, задача определения их роли становится первостепенной.
Одним из направлений таких исследований является функциональное изучение генов, кодирующих митохонлриальные рибосомные белки (МРБ) Интерес к изучению МРБ связан с накопленными за последние 10 лет данными о том, что нарушения процесса окислительного фосфорилирования являются причиной таких наследственных, а также приобретенных заболеваний, как нейромускульные заболевания, диабег. апластическая анемия, глухота Предполагается, что мутации или полиморфизм белков, вовлеченных в процессинг и трансляцию митохондр паль ной РНК, моїуг являться причиной прогрессии данных заболеваний. Детальное исследование струкіурьі и функций митохондриальньсх рибосомньгх (читорибосочных) белков важно не только для изучения процесса биосинтеза митохондриальных белков, но и с точки зрения понимания молекулярных основ патогенеза, а также поиска методов лечения вышеописанных заболеваний
Около половины читорибосомных белков не имеет гомологов в рибосомах прокариот, и, соответственно, их функциональную роль и локализацию в рибосомах еще предсюит определить Некоторые из новых рибосочных белков могут ичеіь дополнительные функции, не связанные непосредственно с синтезом белков Примером таких дополнительных функций может, в частости служить участие в ггронессе апоптоза Па сегодняшний момеш известно два миторибосомных белка, принимающих участие в аігоптозс, это DAP3 (death associated protein) и PDCD9 (programmed cell death protein 9).
Изучение функций МРБ может привести как к идентификации іенов, продукты которых вовлечены в прогрессию заболеваний, ассоциированных с нарушениями биосинтеза митохондриальных белков, так и к характеризации новых медиаторов процесса апоптоза
Настоящая работа посвящена изучению функциональных свойств человеческого гена MRPL37, кодирующего компонент большой субчастицы миторибосомы.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА у, С.Петербург
«МфМС
Цели и задачи работы
Целью настоящей работы явилось изучение структуры и функциональных
особенностей гена MRPL37.
Были поставлены следующие задачи:
провести прямую кДНК селекцию на геномной ДНК YAC клона 131 Ft (СЕРН) с использованием кДНК библиотеки из активированных конканавалином А Т лимфоцитов человека.
исследовать структуру и функциональные особенности отселектированных іраяскриптов.
Научная новизна и практическая ценность работы
В результате кДНК селекции был изолирован клон, соответствующий транскрнпту гена MRPL37. Ранее человеческий ген MRPL37 был идентифицирован группой исследователей на основании гомологии полученной ими полной копии кДНК бычьего гена и кДНК человека, имеющейся в базе данных GenBank est,
В данной работе с помощью ряда экспериментов показано, что MRPL37, как и другие миторибосомные белки PDCD9 и DAP3, является медиатором процесса аиоптоза. Впервые обнаружен альтернативный трапскрипт гена - MRPL37a, который является потенциальным TFIlS-подобным фактором, благодаря наличию і омологнчного домена. Проведен функциональный анализ промоторной области гена MRPL37, в результате чего обнаружено, что MRPL37 принадлежит к Е2Г-респонсивным генам, причем E2F является репрессором экспрессии MRPL37. Используя метод дрожжевой двухгибрндной системы, выявлено Э партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно кислый риоосомный белок РО, РНК связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон.
Практическую ценность работы, в частности, может представлять обнаруженная дифференциальная экспрессия гена в нормальных и опухолевых клетках легкою человека. Детекцию увеличения уровпя экспрессии гена MRPL37 можно использовать при диагностике рака легкого.
Полученная информация определит дальнейшие направления в исследованиях функции этого гена и его возможной роли в контроле таких клеточных процессов как апоптоз и опухолевая прогрессия.
Структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на US страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, разделов «Материалы и Методы», «Результаты и обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 145 ссылок.
Основные иезульїаіьі работы.
Прямая селекция кДНК и предварительный анализ отселсктированных транскримтов. Метод прямой селекции кДНК является одним из наиболее эффективных способов идентификации генов, экспресс ирующихся в интересующей кДНК библиоіеке и локалиюванных в известной области генома В данном случае в качестве геномной ДНК был взят YAC клон 131F1 (СЕРН), содержащий ген RIL, расположенный на хромосоме 5 человека в области 5q31. Человеческий ген RIL был ранее изолирован с помощью прямой селекции кДНК на космидных клонах сотрудницей нашей группы к.б н. Башировой А.А. и локализован на YAC 13IFI Размер геномной вставки этого VAC клона составляет 850 т.по.. Учитывая тот факт, что гены встречаются в геноме человека в среднем каждые 10 т.п.о., можно предположить, что помимо гена RIL, YAC 131F1 содержит еще ген или гены кДНК библиотека была синтезирована из РНК Т лимфоциюв, активированных конкакавалином А, который является митогенным индуктором цигокиновых генов. Таким образом, предполагалось, что отселектированный ген(ы) либо сам будет принадлежать к семейству циюкннов, либо его регуляция может быть опосредована их активацией.
Результаты селекции представлены в Таблице ]. Из таблицы видно, что большой процент селектированных транскриптов составляют Alu-повторы а гакже гены, представители семейства которых часто встречаются в геноме Такой результат обусловлен сложностью геномной ДНК, взятой для селекции, чпосвшано прежде всего с большими размерами вставки YAC клона -850 т.п.о. Кроме Alu-повторов был отселектирован ген R1L, что явилось одним из подгаерждений успешно проведенной селекции Анализ отселектированного транскрипта кДНКІ, размер которого составил 147 п,о., показал наличие открытой рамки считывания с 2-ого по 147-ой нуклеотид. При сравнении фрагмента аминокислотной последовательности предполагаемого белка с базой данных Fasta33, была обнаружена 100% гомология с митохондриальным рибосомным белком MRPL37, а также -50% гомология с фрагментом другого митохондриального рибосомного
белка HDCD9 (programmed cell death 9, MRPS30), куриный гомолог которого р52, вызывает вдоптоэ мышиных фибробластов СЗН10Т1/2 (Рис.1).
І аблица I Клоны, полученные при кДНК селекции.
PDCD9 АЙУТЙ" Г75'Ж/1"Г''вТ? SirClfCi.,!TLAL""",Qi^Mn>ftKN3CVGTQSKPb1'ETIEDm)?
Рис I. Гомологичный у часток аминокислотной последовательности кДНКІ и проапоптотного белка PDCD9
Существование общего домена указывает на возможное функциональное сходство двух белков и позволяет предположить, что во-первых, отселектировакный ген с большой долей вероятности принадлежит к семейству митохондриальных рибоеомных белков, и во-вторых, он может быть вовлечен в процессе апоптоза.
Предварительный аналні экспрессии отсел юстированных транскриптов в тканях и клеточных линиях человека показал высокий уровень экспрессии кДНКІ в клетках В клеточной лимфомы Raji и Т клеточной лимфомы МТ4 (Рис.2), что может указывать на участие гена, соответствующего кДНКІ, в патогенезе данных иболеваний
MRPL37
ті ill ШкШНШШ ш^штш
ЧЯИг^І^^ НИВІ ЧНИРТИЧІР* ^Шт- ШКР- 4НРМ- *W
1SS рРНК
Рис 2. Нозерн-анализ экспрессии селектированной кДНКІ, 1 - В клеточная лимфома Raji, 2 - Т клеточная лимфома МТ4 , 3 В клеточная лимфома Daudi, 4 - тонкий кишечник, 5 -мозжечок, 6- печень, 7-тимус, 8 - сердце, 9- мозг, 10 - костный мозг. Для нормализации образцы РНК гибршшзовали также с 18S рРНК специфичным олигонуклеотидом
Полная копия кДНК отселектированного гена была nojr/чена с помощью методики RACF (rapid amplification ofcDNA ends) с использованием кДНК библиотеки схелетной -пышны человека. Полученную последовательность проанализировали на наличие открытой рамки считывания и обнаружили, что наиболее протяженная рамка содержит 1272 нуклеотида, что соответствует 423 аминокислотам Нуклеотидную и предполаїаемую аминокислотную последовательности сравнили с базами данных GenBank пг и Fasta33, в результате установили, что отселектированный ген полностью идентичен ієну MRPL37, в аминокислотной последовательности которого не обнаружено никаких новых гомологии за исключением выявленной ранее гомологии с проапоптозным белком PDCD9. Таким образом, можно сделать вывод, чю в результате прямой селекции кДНК HaYAC 131FI был отселсктирован ген MRPLS7.
Определение копийностн гена MRPL37 в геноме человека н мыши. Для
определения копийностн гема MRPL37 в геноме, был проведен анализ по Сарерну Иммобилизогашгую тотальную ДНК человека и мыши гибрндизовали с меченной Р32 пробой кДНКІ В результате радиоавтографни был обнаружен сигнал, соответствующий 9 т.п.о EcoRI-фрагменту геномной ДНК мыши и 6 т.п.о. EgoRI-фрагменту ДНК человека (Рис, ЗА), Таким образом, проведенный анализ показал, что отселектированый ген уникален, а также эволюционно консервативен
9 там».
6 т.п.о.
Рис З А. Гибридизация селектированной гробы кДНКІ с геномной ДНК человека и мыши 1-
тотальная ДНК мыши, гидролтованная EcoRl, 2 - тотальная ДНК человека, гндролизоеанная
EcoRl
Б.ГибридизациякДИКІ-спеинфичногоолигонуклеотида с ДНКУАС 131F1 недрожжевой
ДНКАВШО 1- ДНКУАС 131Р^гчдролизованнаяЕсоЮ,2-ДНК АВШО,
тндролнзованная EcoRl.
Чтобы подтвердить локализацию MRPL37 на YAC 131F1, меченый Р31 кДНКІ-специфичный олигонуклеотнд гнбридизовали с иммобилизованной ДНК YAC 131FI. В качестве отрицательного контроля использовали ДНК дрожжевой линии АВ1380 (Рис. ЗБ). В результате радиоавтографии был обнаружен сигнал только на ДНК YAC 131F1, что позволило утверждать, что отселектированкый ген локализован на ДНК YAC 131F1 н не имеет гомологии с дрожжевой ДНК.
Картирование MRPL37 в геноме человека. Чтобы подтвердить хромосомную локализацию отселектпрованного гена, использовали панель ДНК из соматических клеточных гибридов (человек - хомяк), любезно предоставленную к.б.н Копанцевым Е.П. ДНК из соматических клеточных гибридов использовалась в качестве матрицы для ПЦР с праймерами на кДНКІ. Анализ результатов ПЦР показал, что отселектированный ген локализован на первой хромосоме человека. Однако известно, что ген RIL, ранее картированный на YAC 131F1, локализован на 5-ой хромосоме человека в районе 5q31.1, и предполагалось, что YAC 131F1 является полностью 5q3]-специфичным. Таким образом, в результате данного эксперимента, помимо картирования гена MRPL3? на первой хромосоме человека, было также установлено.
что YAC 131F1 является химерным, то есть содержит ДНК не только хромосомы 5, но и хромосомы 1.
Комплексный анализ экспрессии гена MRPL37. Изучение уровня экспрессии гена в различных тканях человека и мыши проводилось с помощью нозерн-анализа а также ОТ-ПЦР-анализа, Нозерн-блот анализ экспрессии гена MRPL37 в клетках тканей человека, как уже было сказано выше, выявил высокий уровень экспрессии в клетках Raji В клеточной лимфомы и в клетках МТ4 Т клеточной лимфомы (Рис 2), что указывает на возможную связь селектированного геиа с прогрессией данных заболеваний.
Для изучения экспрессии гена в различных тканях параллельно с нозерн-анализом проводился ОТ-ПЦР на РНК из тканей человека. Быта использована РНК, выделенная из 10 различных тканей и трех типов клеточных линий человека В результате подтвердились данные, полученные с помощью ноэерн-аналиэа, а именно, что наибольший уровень экспрессии гена наблюдается в клетках Т клеточной лимфомы МТ4, тогда как в костном мозге экспрессия практически отсутствует (Рис.4). Кроме того, был выявлен еще ряд тканей и клеточных линий человека с высоким уровнем экспрессии гена MRPL37, в частности, поджелудочная железа и легочные фнбробласгы.
Был также проведен анализ тканеспецифичиости экспрессии мышиного гена, в результате которого были выявлены ткани, в клетках которых наблюдается наибольший уровень мРНК мышиного гомолога гена MRPL37, это сердце, скелетная мышца, а также органы репродуктивной системы - яичник, матка и яичко (Рис.5).
Анализируя полученные данные, можно сделать следующие выводы: мышипый гомолог MRPL37 высоко представлен именно в тех тканях, где митохондрии несут повышенную функциональную нагрузку, и, соответственно, наблюдается высокий уровень экспрессии большинства митохондриальных генов, это мышечные ткани -сердие и скелетная мышца, а также органы репродуктивной системы. Тогда как у человека наблюдается иная картина экспрессии гена MRPL37, гораздо выше уровень его мРНК в легочных фибробластах LEH (lung embrionic fibroblasts), тимусе и печени по сравнению с клетками сердца и скелетной мышцы. Такие различия в экспрессии мышиного и человеческого гена могут быть связаны во-первых, с различной представленностью мРНК гена MRPL3 7 в клетках эмбриональных тканей (человека) и в клетках взрослого организма (мыши), и во-вторых, с возможной дополнительной функциональной нагрузкой человеческого гена, приобретенной в процессе эволюции
« I I
ё .;
I В з
2 = Ч І
'is5
і I 1 J hi \ I a
MRPL37
ill n * Д«НІМЬ*І»«»
^ мамі -i* «a^ itf ШїііІІЬШіій .дм
GAPDH
Рис 4 ОТ-ГЩР анализ репрессии ієна MRPU7 ъ тканях и клеточных линиях человека Нормализация образцов проводилась по экспрессии GAPD1I (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
- І і Ь ! ft і f г і 1 П НІ
їа^ЗЇуРсй еду S* « 2 «
MRPL37
18S рРНК
Рис, 5 Ноіерн-анализ экспрессии гена AWij7 втканях мыши. Для нормализации образцы РІЖ гибрндиэовали с 18$ рРНК специфичным олигокуклеотшюм
Детекция одинаково высокого уровня экспрессии гена MRPL37 во всех проверенных опухолевых клеточных линиях позволила предположить, что ген MRPL37 активируется в трансформированных клетках и участвует в прогрессии опухолевого роста клеток. Дополнительным подтверждением 1310)01 предположения послужили результаты ОТ-ПЦР анализа уровня экспрессии MRPL37 в нормальных и опухолевых клетках легкого человека. Как видно нз Рнс.6, из четырех образцов тканей, взятых от
разных больных, в трех обнаружено увеличение уровня мРНК исследуемого гена в опухолевых клетках по сравнению с клетками здоровых тканей.
< -150 и.о. MRPL37
-250 п.о. GAPDH
Рис 6 Результат ОТ-11ЦР анализа экспрессии гена MRPLS7 в нормальных и опухолевых клепках леї кою человека М -ДНК маркер, HI-114 — клетки гдоро&ых тканей,СИ-СИ-опухолевые клетки, одинаковые номера соответствуют образцам, взяїьіч у одного и того же пациента Нормализация образцов проводилась по экспрессии GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)
Чтобы выяснить, является ли активация MRPL3 7 характерной для большинства опухолевых клеюк, или он индуцируеіся только в клетках определенного типа, был проведен ОТ-ПЦР анализ экспрессии MRPL37 на напели 22-ух опухолевых клеточных линий, представляющих различные ікани и отличающихся статусом гена р53
Анализ результатов ОТ-ПЦР показал, что MRPL37 дифференциально экспрессаруется в различных опухолевых линиях, причем максимум экспрессии ириходиіся на кііетки ПТ-29 адснокарциномы ободочной кишки, тогда км полное отсутствие траискрипга наблюдается в клетках меланоми SK-MEL-5 и в клетках остеогенной саркомы U-2 OS. Интересно, что в другой клеточной линии меланомы SK-MEI.-28 наблюдается довольно высокий уровень мРНК гена MRPL37. Возможно, это связано с различные статусом гена р53 в клеточных линиях SK-MEL-5 и SK-MEL-28. где в первом случае ирису ге і вует дикий тип р53, а во втором мутантный по 145-ому колону, то есіь, возможно. р53 способен подавлять экспрессию MRPL37
Так как сравнительный анализ аминокислотной последовательности MRPL37 с белками, представленными в базах данных GenBank pdb и Fasta33, выявил гомологичный участок с проапоптозным белком PDCD9, который также является компонентом миторнбосомы, то можно предположить, что оба белка наделены сходными функциональными особенностями, связанными либо с участием в синтезе митохондриальных белков, либо с ролью в процессе апоптоза. Чтобы проверить возможное участие гена MRPL17 в процессе апоптоза, были проведены следующие эксперименты.
Как известно, существует множество стрессовых воздействий, способных вызвать апоптоз клеток, среди них УФ облучение, тепловой шок, удаление сыворотки из среды для культивирования клеток, а также обработка химическими реагентами, способными вызывать различные повреждения и модификации в клетке, которые в свою очередь являются сигналами для развития программируемой клеточной смерти. Было взято 4 клеточных линии - SK-MEL-5, SK-MEL-28, U-20S, DU-14S, включающих в себя клетки с низким и высоким уровнем экспрессии гена MRPL37. Чтобы индуцировать шюптоз, клетки культивировались в следующих условиях 1) в отсутстаии фетальиой сыворотки, 2) были подвергнуты УФ-облучению, 3} тепловому шоку. Затем из клеток была выделена тотальная РНК и осуществлен нозерн-анализ, результат которого приведен на Рисунке 7.
SK-M(I-S SK-Mtl-28
к -fcs uv hs MRPLJ7 К FCS UV
К -FCS UV I
18S pPHK
J& ЩЯР ЩР 4^
12-OS DU-I4S
)SS pPHK
Рис.7. Нозерн-анализ экспрессии гена MRPL37 в опухолевых клеточнык линиям подвергнутых стрессовым воздействиям, индуцирующим алоптоз' К - контроль (нет воздействий), -FCS -удаление фетальиой сыворотки из среды для культивирования клеток, UV - облучение ультрафиолетом, HS-тешіовоЙ шок.
Можно заметить, что в клетках меланомы SK-MEL-5 и остеосаркомы U-20S,
где, как бьио показано выше, экспрессия гена Ш&Ц7 практически отсутствует, при
индуцировании апоптоза стрессовыми воздействиями наблюдается активация MRPL37,
причем в SK.-MEL-5 экспрессию MRPL37 индуцируют все три воздействия, тогда как в клетках U-20S только удаление фегальной сыворотки,
В клеточных, линиях SK-MEL-28 и DU-I45 наблюдается совершенно иная каріива экспрессии MRPL37, а именно: никакие воздействия практически не влияют на уровень его мРНК, за исключением облучения УФ, которое приводит к ингибированию экспрессии ієна. Противоположный эффект от одного и того же воздействия, приводящий к активации либо ингибированию экспрессии MRPT.37 в разных опухолевых клеточных линиях можио объяснить тем фактом, что в опухолевых клетках происходят различного рода генетические нарушения, чуіашш, активация ряда онкогенов, именно эти особенности, помимо тканеспецифичности, отличают опухолевые клеточные линии друг от друга. При этом во всех четырех клеточных линиях удаление фстаїїьной сыворотки из среды для культивирования клеток приводит к активации экспрессии MRPL37 в той или иной степени.
Увеличение уровня MRPL37 было также выявлено в клетках Hef р5Э-/- (human embryonic fibroblasts), культивированных без фегальной сыворотки (FCS) в течение разных периодов времени. Уровень экспрессии гена детектировали с помощью реакции ОТ-ПЦР, результат которой показан на Рис.».
М0ч24ч 48ч 72ч 96ч К- Оч 24ч 48ч 72ч 96ч К-
Рис К Сравнение уровня экспрессии MRPL37 в клетках Hef р53-/-, культивируемых в полной среде, содержащей 10% FCS (эта точка сост ветствует Оч на рисунке) с его экспрессией в клетках, культивируемых в среде без FCS в течении 24 часов (24ч), 48 часов (48ч), 72 часов (72ч) и 96 часов (96ч) соответственно. Параллельно проводили нормализацию обрашов по экспрессии GAPDH
Уровень экспрессии MRPL37 тем больше, чем больше время культивирования клеток без FCS, то есть при индукции апоптоза путем удаления фегальной сыворотки уровень мРНК MRPL37 в клетках растет. Таким образом, можио предположить, что активация MRPL37 связана с его участием в процессе программируемой клеточной смерти, вьгаванной удалением FCS из среды культивирования клеток. При этом можно
утверждать, что MR/7J 7 задействован вр53 независимом пути аполтоза, так как в данном эксперименте использовались клегки, в которых отсутствует р53, то есть индукция апоптоза осуществляется в них по альтернативному пути
Влияние суперэкспрессии гена MRPL37 на выживаемость клеток мышиных эмбриональных фибробластов Mef р53-/-, подвергнутых УФ облучению. В результате экспериментов, описанных выше, было показано, что экспрессия MRPL37 увеличивалась при индукции апоптоза в клетках путем различных стрессовых воздействий, что явилось подтверждением возможного участия MRPL37 в процессе программируемой клеточной смерти Чтобы выяснить, как будет влиять суперэкспрессия гена MRPI.37 на выживаемость клеток, была использована тетрациклин-зависимая векторная система "tet-off", которая позволяет ингибировать экспрессию введенного гена посредством добавления тетрациклина Полная копия кДНК гена MRPL37 была проклонирована в самой н активирующийся ретровирусный вектор pSib, содержащий тетрациклин-зависимый промотор Клеточная линия Mef р53-/-, содержащая плазмиду pPS с введенным элементом tTA, а также вектор pSib были любезно предоставлены д б н Чумаковым ТТ М Нами были получены стабильные клоны клеток Mef р53-/-, экспрессирующие MRPIJ7 в отсутствии тетрациклина Полученные стабильные клоны бьгли подвергнуты УФ облучению (Зббпт, VETTER GMBH) в течение 5, 10, 15, 20, 30 и 60 секунд Результат эксперимента приведен на Рис 9, который демонстрирует, что выживаемость клеток, экс премирующих MRPL37 {график IV), значительно уменьшается по сравнению с клетками, не содержащими конструкт pSib + MRPL37
Тот факт, что выживаемость клеток существенно падает При суперэкспрессии MRPL37 в клетках, где отсутствует ген р53, говорит о том, что MRPL37 вовлечен в р53-независимый путь программируемой клеточной смерти, что является подтверждением эксперимента, описанного выше, который показал увеличение экспрессии MRPL37 в апоптирующих клетках Hef р53-/-
% живых клеток 1 И
100ч
5 10 15 20 30 60 время
облучения УФ, сек
Рис 9. Выживаемость клеіок Mcf р53-/-, подвергнутых УФ облучению в течение разных периодов времени при суперэкспрессии MRPL17 Графики I и II показывают изменение выживаемости клеток, не содержащих экснрессирутоншй коногрукт, в оісутствии и в присуїствнн тетрациклина соответственно Графики Ш н IV демонстрируют повеление клеток, содержащих конструкт pStb-4-MRPL37 в присутствии и в отсутствии тетрациклина соответственно
Идентификация альтернативного транскрипта гена МКРЫУа Помимо
конструктов, позволяющих получать стабильные клоны, были созданы
экспрессирующие конструкты для тратиторного (временного) введения MRPLi7 в
клетки. Для этого использовали вектор PCI-neo (Promega). При этом для удобства
клонирования полную копню кДИК гена MRPL37 получали с помощью ОТ-ГЩР с
лраймерами, содержащими необходимые сайты рестрикции. В качестве матрицы
испольтовалн ОТ-смесь, полученную ич РНК клеток НТ-29, в которых, как было
описано выше, мРНК гена MRPL37 высоко представлена. При проверке
рекомбинантных клонов, был обнаружен один клон с размером вставки примерно на
200 п.о. меньше ожидаемого. Анализ первичной структуры вставки покачал, что она
соответствует альтернагивному траискрипту гена MRPU7, в котором отсутствуют
второй и третий "жчоны Так как к настоящему моменту структура генома человека уже
известна, в базе данных GenBank имеется Рас клон AL357673, содержащий ген MRPL37, что поіволяєг установить геномную организацию гена, который, как выяснялось, состоит из семи экзонов и шести нитронов. Обнаруженный альтернативный транскрипт, соответственно, состоит из пяти экзонов и четырех нитронов (Рис 10). Причем в результате делении двух экзонов происходит сдвиг рамки, в результате чего первые 86 аминокислотных остатков предполагаемого белка MRPL37a не обнаруживают никакой гомологии с белком MRPL37. Сравнеігае предполагаемой аминокислотной последовательности MRPl,37a с базами данных ГаьсаЗЗ и GenBank также не дало положительного результата. Чтобы выяснить, не содержит ли данная последовательность какого-либо белкового домена, был проведен поиск с помощью программ SMART и PFSCAN, в результате чего обнаружилось, что с 3-его по 46-ой аминокислотный остаток расположен ДНК связывающий "2n ribbon" домен транскрипционного фактора TFIIS На Рисунке 11 показано сравнение аналогичных мотивов ряда белков с соответствующим участком MRPL37a, па котором хорошо видно, что поспело вате, і ыюсть MRPr,37a имеет высокую степень гомологии с данным доменом. Транскрипционный фактор TF11S необходим для зффекіивной элонгации транскрипции посредством РНК полимеразы Н (РНКполП), он широко распространен среди различных организмов, включая млекопитающих, дрожжи и археобактерии Транскрипционный фактор TFIIS задействован в процессе элонгации транскрипции, он расщепляет транскрипты, образованные РНКполП, способствуя транскрипции на участках ДНК, «закрытых» ДНК связывающими белками. Можно предположить, что белок MRPL37a относится к семейству TFOS-подобных факторов транскрипции и либо задейс івован в процессе транскрипции митохондриальных генов, либо он, в отличие от MRPL37, локализован в ядре и координирует транскрипцию ядерной ДНК.
Для выяснения функциональной роли альтернативных траискриптов гена MRPL17 был проведен эксперимент, изучающий изменение выживаемой и клеток неме-ікоклеточною рака легкого Н1299 и клеток рака шейки матки HeLa при еуперэкспрессии данных генов. Кроме того, клетки с транзиторно введенными конструктами подвергали стрессовым воздействиям, таким как УФ-облучение, удаление сыворотки из культивационной среды, а также обработка химиотерапевта чески ми реаіентами, вызывающими апоптоз клеток, после чего детектировали степень их выживаемости.
MRPL37
MRPL37a
\y=:\r=v
Рис. (О Эюон-интронная структура альтернативных транскригггов гена MRPLi?, цифрами обозначены эюоны
MRPL37A/3-46 Q&8202/155-193 RP05_VARV/157-195 RPCMjSULAC/161-199 TFS2_ASFB7/204-242 Q84444/141-179 TFS2JTEAST/269-307 TCE1 HUMAH/261-299
Gl.APRWmiJ#»CTKSL33P5Pj(l(Ga,T3',eR^|
tp :pnckshittp^qtp|ajEFF LfeHi:RDCKQH?K 15:Р2сон:Е17Щйтр5А:>ЕРАтигтк;ткс5етй1
YK:PNCKQRICTYREftQTF|L:»EPST|rCT.:KKLGHE|I LQCGKCKSRKtg'flEiQTRS ЮЕМП|Г AKCHSC ОВЩЧ. FT:GKCE!^K^^Q|QTR3A:>EPLT?FCTCEAC(ailiK FrGKCnbCTTT3cfnai3EPIOWC«ECGwiK
Рис. 11 Сравнение ДНК связывающих доменов транскрипционных факторов семейства TF1IS с MRPL37a. Цифрами обозначены аминокислотные остатки
При суперэкспрессии альтернативные транскрипты продемонстрировали противоположный эффект влияния на выживаемость клеток, а именно суперэкспрессия MRPLJ7 способствовала клеточной смерти, тогда как присутствие URPLila препятствовало гибели клеток (Рис 12а-е) Таким образом, можно сделать вывод, что функциональные свойства альтернативных транскриптов ієна MRL17 сильно отличаются. При этом альтернативный сплайсинг выступает либо как механизм регуляции экспрессии функционально значимого транскриггта, либо образуются две альтернативные формы гена, продукты которых несут различную функциональную нагрузку.
A.
HELA
llBjUrUirL- ^
H1299
Б.
Рис 12 A - На рисунке показано изменение выживаемости клеток при суперэкспрессии MRPL37 и MRPL37a, облученных ультрафиолетом в течение разных периодов времени Ось ординат соответствует огносительной величине степени выживаемости клеток, ось абсцис - времени облучения, где ] - контроль (нет облучения). 2-20 секунд, 1-30 секунд, 4-60 секунд Здесь и далее Q контроль (PCJneo), - MRPL37, ЕЯ . MRP[,37a Б - изменение выживаемости клеток при суперэкспрессии MRPL37 и MRPL37a приуменьшении содержания фетаїьной сыворотки в среде культивирования клеток от 10% (1) до 0 (8), стрелкой показано направление уменьшения концентрации FCS В - изменение выживаемости кісток при добавлении доксорубиннна, направление увеличения концентрации показано стрелкой
HELA
д.
1 2 3 4 5 Є 7 8
Рис 12 (продолжение). Г - изменение выживаемости клеток при добавлении іельданомишша, Д-изменение выживаемости клеток при добавлении деферроксзмина, Е - изменение выживаемости клеток лри добавлении 5-фторурацнла, стрелкой показано направление увеличения концентрации добавляемых вешеств.
Функциональное изучение промотора гена MRPL37. Регуляция экспрессии гена
может осуществляется различными способами: на стадии транскрипции, трансляции,
посредством альтернативного сплайсинга, при этом транскрипционная регуляция играет
ключевую роль в механизме экспрессии гена. Идентификация транскрипционных
факторов, участвующих в активации или репрессии гена, вносит вклад в понимание его *
функциональных особенностей. Проанализировав 2 т.п.о. из 5'-прилегающей области гена MRPL37, взятой из последовательности РАС клона AL357673, с помощью программы TRANS FAC, было обнаружено около 80-ти потенциальных сайтов связывания с различными транскрипционными факторами, среди них такие как Spl, АР-!, NF-kappaB, N-Myc, С/ЕВР, E2F.
Наибольшее внимание привлекли к себе 2 потенциальных сайта связывания с E2F, так как обнаружили 100% гомологию с консенсусний последовательностью (TTTSSCGC, где S =G или С). Гены-мишени E2F кодируют белки, участвующие в регуляции клеточного цикла, среди них с-Мус, п-Мус, b-Myb, E2F1, ииклин А, циклин Е, р107. pRb, CDC2) Как было обнаружено для клеток SK.-MEL-5, экспрессия MRPL37 изменяется на протяжении клеточного цикла (данные не покатаны), такнм образом, предположение о регуляции MRPL37 посредством E2F является вполне оправданным
Необходимо заметить, что помимо активации, E2F может оказывать ннгибируюшее воздействие, это происходит в том случае, если pRb, основной модулятор функционирования Ь2Р, остается в гипофосфорилированном состоянии, в результате чего E2F не высвобождается из комплекса E2F-pRb, то есть не активируется, но при этом не теряет возможности связывания с ДНК, таким образом осуществляется репрессия транскрипции.
Для функционального анализа 600 по. нз 5'-прилегающей области были
изолированы с помощью ПЦР на тотальной геномной ДНК человека (Clontech) с
использованием праймеров, синтезированных исходя из структуры А/ЯРО 7-солержашеі о
РАС ктона AL357673 Чтобы выявить функциональный сайт E2F, были созданы
делеционные конструкты, содержащие два и один потенциальный сайт E2F
соответственно, которые были проклонированы в вектор рСАТ-ТК.0 так, чтобы
активность репортерного гена CAT {хлорамфеникол-ацетилтрансферазы) находилась под
регуляцией промотора MRPL37 Полученными конструктами транзиторно
трансфецировали клетки HeLa и Н1299, в качестве положительного контроля *
использовали плазмиду pCAT-E2F-bs, несущую 10 консенсусних последовательностей E2F, в результате чего экспрессия CAT зависела от уровня E2F в клетках.
A.
1800_ 1799
-&
SPI SPl
E2F (її)
1^
E2F (і)
MRPL37
5* -область MRPL37
(662;+J) pCAT2
(-618;+!) pCATl
H1299
HeLa
Рис.13 A, Cxeva создания делсиионных конструктов промоюра генаЛДО..37, 1797,1798, 1800 -соответствуют праймерам, использованным дія ПЦР с целью получения промоторнык участков иі геномной ДНК человека Б, CAT активность делецнонных конструктов, а также изменение CAT
п актавносипослсобработкиТСТ-й ]-pCAT-E2Fbs,2-рСАТ2, J-pCATI,
У -TGF& | + TGF0
Чтобы проследить динамику изменения активности CAT при подавлении E2F, был использован TGF-0 (Transforming Growth Factor - beta) как модулятор экспрессии E2F. TGF-|3 индуцирует CDK1 - ингибиторы циклин зависимых киназ, в результате чего pRb остается в активном, то есть гипофосфорилированном состоянии, и связывает E2F, который теряет возможность активировать экспрессию генов-мишеней
Для детекции активности CAT использовали хлорамфеникол-С14, полученные радиоавтографы анализировали с помощью программы Gel-Pro Analyzer 3.1, рассчитывая относительный уровень активности CAT Результат представлен на Рис !3, из которого видно, что промотор, содержащий два потенциальных сайта E2F (рСАТ2), обладает меньшей активностью, при этом его активность еще больше падает при обработке клеток TGF-& что коррелирует с результатом, полученным для конструкта, несущего E2F-респонсивные элементы, из чего можно заключить, что потенциальный сайт E2F (II) действительно является участком связывания с E2F, который в данном случае выступает как репрессор транскрипции і єна Соответственно, экспрессия гена будет активироваться при диссоциации комплекса E2F/pRb от ДНК, что должно происходить, когда pRb не активен, то есть гиперфосфорилирован, в результате E2F отделяется от pRb, что дестабилизирует ингябирующий комплекс Делеционный конструкт, содержащий только один сайт связывания E2F (I) (pCATt) демонстрирует увеличение активности CAT по сравнению с рСАТ2, что подтверждает ингибирование экспрессии гена посредством связывания E2F с сайтом П При обработке TGF*|3 клеток, трансфецированных pCATl, наблюдается существенное увеличение активности CAT, из чего можно заключить, что сайт E2F I функционально не активен Индукцию экспрессии гена посредством TGF-)3 можно объяснить, если принять во внимание наличие в промоторной области двух сайтов связывания Spl с матриксной гомологией 0,87 Обнаружено, что TGF-0 активирует белки SMAD, которые способны связываться с SPI-SP3 факторами, индуцируя их транскрипционную активность.
Таким образом, в результате функционального анализа промоторной области гена MRPL37 установили, что сайт связывания с E2F (II) является функционально активным н служит для ингибирования экспрессии гена MRPL37, тогда как консенсусная последовательность I не является E2F связывающим сайтом При этом наиболее вероігтно, что экспрессия гена регулируется посредством транскрипционных факторов SP1-SP3, которые помимо связывания с характерными консенсусными последовательностями, обладают способностью узнавать сайты E2F, поэтому консенсус E2F (I) может служить для связывания с SP факторами.
Использование дрожжевой двуїгпбрндной системы (2HS) дли поиска белков-партнеров по взаимодействию с MRPL37. Применение 2HS позволяет детектировать белки, физически взаимодействующие с белком - продуктом гена с неизвестной функпией. Метод 2HS базируется на том факте, что многие эукариотические транскрипционные факторы состоят из двух физически разделимых и функционально независимых доменов- ДНК связывающего (DB) и ДНК активирующего (DA), которые необходимы, 1?гобы инициировать транскрипцию генов. Мы использовали Matchmaker 2HS систему-2 (Cloniech), где DA и DB выделены из дрожжевого белка GAL4 Полные копии кДНК, кодирующие белки, потенциально взаимодействующие друг с другом, клонируют в два различных экспресшруюпшх вектора, один из которых содержит DA домен, а другой, соответственно, DB, при этом образуются химерные белки DA + белок] и DB + белок2 При совместной экспрессии полученных конструктов в дрожжах, когда химерные белки оказываются в непосредственной близости друг от друга, они взаимодействуют, обеспечивая таким образом и взаимодействие DA и DB доменов, в результате чего образуется транскрипционный фактор, обладающий сродством к GAL4 активирующему сайту Данный транскрипционный фактор в свою очередь инициирует транскрипцию репортериых генов LacZ или His3, что позволяет детектировать взаимодействие белков (Рис. 14)
транскрипция
GA1 связывающий г лит
г '.-' .;'.'. f -- ; '.*.V>, '+ .і
Рис 14 Схема, иллюстрирующая принцип технологии 2HS
Таким путем можно подтвердить предполагаемое взаимодействие двух извесі ных белков либо провести скрининг кДНК библиотеки с новым белком, чтобы идентифицировать его партнеров по взаимодействию В нашем случае был осуществлен скрининг -жспрсссирующейся в дрожжах полпоразмерной кДНК библиотеки клеточной линии эритроидкой лейкемии К562 (Clontech), любезно предоставленной д б.н. Липкиньш В М
В результате было отобрано три кДНК клона, продукты которых провзаимодействовали с белком MRPL37 Определив их первичную структуру и сравнив полученные последовательности с генами, представленными в GenBank, было установлено, что они кодируют кислый рибосомный белок РО, РНК-связываюпщй белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон Hb,
Известно, что рибосомный белок РО образует комплекс с белками большой субчастицы рибосомы Р1 И Р2 и участвует в процессе элонгации полипептидяой цепи Но помимо этого, в последнее время появились публикации, в которых обсуждаются дополнительные функции РО, не связанные с синтезом белка. В частности, в одной из работ детектировали ряд белков, вовлеченных в апоптоз лимфоцитов, индуцированный IgM, среди них был и РО В другой публикации обсуждалось наличие внерибосомных функций РО, связанных с репарацией ДНК. Данный факт был косвенно подтвержден группой исследователей, которые детектировали РО не только в цитоплазме, но и в ядре клетки Ута данные коррелируют с возможной функциональной ролью обнаруженного нами альтернативного транскрипта MRPL37a. аминокислотная последовательность которого содержит ДНК связывающий домен транскрипционно о фактора TFIIS, что служит указанием па возможную ядерную локализацию MRPL37a Интересно, что высокий уровень экспрессии РО наблюдается в клетках В клеточной лимфомы (Burkiti lymphoma cell line), что характерно и для MRPL37, Кроме того, увеличение экспрессии РО наблюдалось в клетках карциномы печени по сравнению с уровнем его мРНК в нормальных клетках Таким образом, функции РО значительно шире, чем участие в процессе трансляции, поэтому на какой именно стадии взаимодействуют РО и MRPL37 еще предстоит выяснить.
Что касается белка TAR-BP (TAR RNA binding protein), то о нем известно, что это клеточный белок, который был обнаружен благодаря взаимодействию с TAR элементом РНК вируса иммунодефицита человека 1. TAR-BP, также как РО, является много функционалы [ым белком, в частности, он регулирует транскрипцию и трансляцию генов С одной стороны, имеются данные о ядерной локализации TAR-BP, а с друюй, установлено, ч го TAR-BP участвует в постгрансляционной рефляции протамина Недавно было показано, что TAR-BP, также как по нашим данным MRPL37, взаимодействует с НЬ-е, что явилось косвенным подгверждением полученных нами результатов Можно предположить, что белки TAR-BP, Hb-e и MRPL37 (вероягно MRPL37a) образуют тройной комплекс, который, по всей видимости, регулирует экспрессию Hb-t
*
Взаимодействие MRPL37 с Hb-t может также указывать на роль MRPL37 в процессе биосинтеза гемоглобина, большинство стадий которого протекает в митохондриях.
Таким образом, с помощью метода дрожжевой двухгибридной системы идентифицировано три партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно: кислый рибосомный белок РО, РНК-связьгаающий белок TAR-BP, а также гемоглобин эпсилон НЬ-. Кроме того, полученные результаты послужили косвенным доказательством функциональной значимости обнаруженного нами альтернативного транскрипта гена MRPL37a.
выводы
Метолом прямой селекции из кДНК библиотеки активированных лимфоцитов на ДНК YAC клона 131F1 был изолирован гранскрипт размером 147 гг о Получена полная копия кДНК отселектированного гена, размер которой составил 1430 п.о. Обнаружена 100% гомология отселектированного гена с генпм MRPI.37, кодирующим компонент большой субчастнцы миторибосомы С помошьго панели из соматических клеточных гибридов (человек - хомяк), ген MRPL37 был локализован на хромосоме 1 человека.
Проведенный комплексный анализ экспрессии гена MRPL37 в различных тканях человека и мьппи, а также в ряде опухолевых клеточных линий человека обнаружил дифференциальный характер экспрессии гена.
С помощью ряда экспериментов показано, что MRPL37, наряду с DAP3 и PDCD9, является медиатором процесса апопотоза. причем MRPL37 предположительно вовлечен в р53-неивисимый путь апоптоза
В клеточной линии аденокарциноми ободочной кишки НТ-29 обнаружен альтернативный гранскрипт гена MRPL37a, который является потенциальным TFI1S - подобным фактором, благодаря наличию гомологичного ломена. Показано, что продукты альтернативных транскриптов несут противоположную функциональную нагрузку: MRPL37n способствует гибечи клеток, a MRPL37a способствует выживаемости клеток при стрессовых воздействиях, индуцирующих алоптоз
Проведенный функциональный анализ промоторной области ієна MRPL37 показал, что MRPL37 принадлежит к F2F-pecnoHCHBHbiM генам, причем E2F является репрессором экспрессии MRPL37.
Используя метод дрожжевой двухгибрилной системы, выявлено 3 партнера по взаимодействию белка MRPL37, а именно; кислый рибосомный белок Р0, РНК связывающий белок TAR-BP, а также гемоглобин зпеилон НЬ-е.
