Содержание к диссертации
Введение
"Механизмы бактериальных плазмид" 11
Глава I. Участие клетки-хозяина в репликации плазмидной ДНК II
1.1. Роль ДНК-полимераз 11
1.2. Роль синтеза белка и РНК 14
1.3. Участие продуктов генов 16
Глава 2. Механизмы регуляции репликации плазмиды CoEI И других плазмид СоЕ1-типа 24
2.1. Инициация синтеза " leading " нити ДНК Co^EI 29
2.2. Инициация репликации нити ДНК СоЕ1 35
2.3. РНК I- основной негативно-контролирующий фактор инициации репликации и несовместимости плазмид СоЕІ-типа 40
2.4. Белок Вор - негативно контролирующий элемент инициации репликации плазмид СоЕ1-типа 47
Глава 3. Структура решшкативного аппарата и контроль шициации репликации плазмид не СоЕ1-типа 52
3.1. Оридшшы и направление репликации 52
3.2. Структура репликативных участков и плазмидоспенифические белки, позитивно-регулирующие репликацию плазмидной ДНК 54
3.3. Регуляция инициации репликации и несовместимости 57
3.4. Заключение 65
Материалы и методы бэ
Результаты исследований 89
Глава I. Анализ мультзшлазмидных колициногенных штаммов Е. cole. 89
Глава 2. Регуляция функционирования генов, ответственных за синтез колипинов А и К 95
Глава 3. Репликация колициногенных плазмид в условиях подавления синтеза белка 96
Глава 4. Потребность в ДНК-полимеразе I для репликации колициногенных плазмид 100
Глава 5. Репликация колициногенных плазмид в мутантах 100
Глава 6. Совместимость плазмид Со и Coto 107
Глава 7. Рестрикционное картирование плазмид 108
Глава 8. Молекулярное сравнение малых колици ногенных плазмид ИЗ
Глава 9, Клонирование фрагмента ДНК плазмиды ответственного за ее автономную репликацию 117
Глава 10. Нуклеотидная последовательность участков плазмид Со/А и Соб ответственных за их автономную репликацию 118
Глава 11.Локализация промоторов для РНК I и праймерной РНК 128
Глава 12. Вторичная структура праймерной РНК и РНК I 128
Глава 13.Нуклеотидная последовательность прилегающих к ом> участков плазмид 130
Обсуждение результатов 133
Выводы 152
Список литературы 154
- РНК I- основной негативно-контролирующий фактор инициации репликации и несовместимости плазмид СоЕІ-типа
- Структура репликативных участков и плазмидоспенифические белки, позитивно-регулирующие репликацию плазмидной ДНК
- Репликация колициногенных плазмид в условиях подавления синтеза белка
- Нуклеотидная последовательность участков плазмид Со/А и Соб ответственных за их автономную репликацию
Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время изучение внехромосом-ной наследственности бактерий представляет широкий теоретический и практический интерес. Обнаружение в клетках бактерий плазмид, сообщающих им ряд новых свойств и дополняющшощих стабильную систему хромосомного наследования, дало начало новому этапу в развитии генетики и биохимии бактерий. Плазмиды определяют такие важные свойства бактерий, как способность к передаче генетического материала от клетки к клетке, синтез специфических антибактериальных веществ, устойчивость к различным лекарственным препаратам и ряд других свойств.
Клетки, несущие плазмиды, могут служить моделью для изучения взаимоотношений хромосомной и внехромосомной наследственности. Кроме того, небольшие размеры плазмид, позволяющие выделять их в неповрежденном виде, делают их удобными объектами для изучения различных клеточных процессов, таких как репликация, транскрипция, репарация, рекомбинация.
Одной из наиболее важных проблем биологии является изучение механизмов регуляции клеточного деления. Эта проблема неразрывно связана с изучением репликации ДНК, так как эти два процесса взаимозависимы. Однако, изучать регуляцию репликации ДНК в клетке на молекулярном уровне очень трудно, так как даже небольшие нарушения этого процесса вызывают гибель клетки. Поэтому бактериальные плазмиды, существование которых не обязательно для клетки, обладающие независимым репликоном, очень удобны и популярны как модельные системы для изучения механизмов синтеза ДНК. Именно благодаря успешному использованию плазмид в последние годы достигнуты столь значительные успехи в понимании механизмов репликации
ДНК.
В настоящее время широкое развитие получила генная инженерия - новая область молекулярной биологии, которая занимается проблемами конструирования организмов с заранее заданными свой-
Т?у$но переоценить
ствами. Значение плазмид в этих работах по генной инженерии^""" Большой интерес в этом плане представляют прежде всего малые мультикопийные плазмиды. К этой группе плазмид относятся малые колициногенные плазмиды, представитель которых плазмида СоЕ1 достаточно хорошо изучена и одной из первых была использована в качестве вектора для клонирования бактериальных генов ( НргзА-fie^ et а. t 1974). Очевидно, что успешное использование плазмид в теоретических исследованиях и прикладных работах возможно только при активном изучении их молекулярной природы и механизмов, контролирующих специфические синтезы, которые определяются этими плазмидами.
Состояние вопроса. Малые колициногенные плазмиды - большая и разнообразная группа плазмид кишечных бактерий. Все они могут стабильно существовать в клетках В. сос . Это плазмиды с небольшой молекулярной массой (до 5,0 Щ). Они кодируют колицины-специфические белки-антибиотики узкого спектра действия, ингиби-рующие рост близкородственных организмов ( Hardy , 1975; Ни$е4 ei о/. , 1978).
Большое внимание, особенно в последние годы, к этой группе бактериальных плазмид объясняется несколькими причинами. Коли-цины, наиболее изученный класс бактериоцинов, вызывают значительный теоретический и практический интерес как узкоспецифические ингибиторы различных макромолекулярных синтезов бактериальной клетки, а сами колициногенные плазмиды являются удобной моделью для изучения репликации и транскрипции ДНК, а также перспективными векторами для молекулярного клонирования в работах по генной
инженерии.
Большой интерес представляет тот факт, что синтез различных колицинов определяется исключительно плазмидными генами. Происхождение колициногенных плазмид, обеспечивающих существенные селективные преимущества клеткам бактерий, несущим их, в настоящее время неясно. Поэтому изучение колициногенных плазмид имеет значение также для понимания процесса эволюции микроорганизмов. Исследуемые в настоящей работе малые колициногенные плазмиды Со&, Co/j}, Со&!2 и Со^К кодируют колицины с молекулярной массой 60.000; 90.000; 60.000 и 45.000, соответственно. Из этих колицинов лучше всего изучено действие колицина Е2. Показано, что этот белок является ДНКазой и деградирует клеточную ДНК до олигонук-леотидов. Механизм действия остальных колицинов изучен хуже. Колицины А и К относятся к группе колицинов, изменяющих мембранный потенциал и нарушающих проницаемость мембран, а колицин D специфически ингибирует белковый синтез ( Uo/гсб/си f 1982).
Репликация плазмид Со&, Со^К, Со/# и СоЕ2 к началу настоящей работы практически не была изучена. Имелись лишь данные, что для репликации плазмид СоЙС и СоЕ2 необходима ДНК полимера-за I ( kingsiury, Me/i»s6it 1970; Tkcc & a.^. , 1981) и что репликация плазмиды Со&С может происходить в присутствии хлорамфеникола ( Та сон & а. , 1981).
Цель "работы - изучение генетического контроля и механизмов регуляции репликации малых колициногенных плазмид. Конкретными задачами были:
выделить и охарактеризовать малые колициногенные плазмиды из мультиплазмидных штаммов коллекции Фредерика;
изучить особенности репликации группы малых колициногенных плазмид, сравнительно с репликацией Со&1 и хромосомной ДНК;
выделить участки ДНК колициногенных плазмид, ответствен-
ных за их автономную репликацию, провести сравнительный анализ их структуры.
Научная новизна диссертации состоит в следующем:
- из мультикопийных штаммов В. coii выделены и охарактеризованы
колициногенные плазмида Со^А, Co
ства;
- показано влияние продуктов генов dna J, dna В и d^a С,
участвующих в репликации хромосомы, на репликацию малых колицино-
генных плазмид;
показано, что плазмида Со/а, Со^Ф и Со^К содержат в своем геноме участки ДНК, гомологичные репликативному району плазмида СоЙЗІ, что говорит об эволюционном родстве этих плазмид;
показано, что репликация плазмида Co определена нуклеотидная последовательность участков ДНК, ответственных за автономную репликацию плазмид Со А и Go%) . Определены участки инициации транскрипции двух РНК, участвующих в регуляции репликации плазмид CoiA и Сое ^). Показано, что, несмотря на невысокую степень гомологии нуклеотидных последовательностей этих РНК у плазмид Со&, Со^Я) и Co^EI, они могут иметь одинаковую вторичную структуру. В целом, работа расширяет представления о механизмах репликации ДНК бактериальных плазмид. Результаты, представленные в работе, имеют также значение и для понимания процесса эволюции бактерий. Практическое значение полученных в работе данных связано с возможностью использования изученных плазмид в качестве векторов при молекулярном клонировании в работах по генной инженерии. - II - В 1979 году Колтер и Хелински, изучая репликацию плазмиды СОЕІ, высказали предположение, что регуляция всего процесса репликации этой плазмиды осуществляется на уровне инициации и что механизм инициации репликации определяет число копий плазмид-ной ДНК и явление несовместимости {lCol&er , HeL nskt ,1979). В настоящее время известны два механизма регуляции инициации репликации плазмиды Coftll и некоторых других плазмид этого типа. Морита и Ока, изучая репликацию плазмиды СО/ЕІ С vicr-o t показали, что в репликативной области, кроме праймерной РНК (РНК Ш, синтезируется маленькая РНК величиной в 108 нуклеотидов, названная РНК I ( Hor-іісь- % Ока, , 1979). Транскрипция этой РНК начинается с -445 нуклеотида плазмидной ДНК в направлении, обратном транскрипции РНК П, и терминируется за несколько нуклеотидов от точки инициации транскрипции праймерной РНК. Таким образом, РНК I полностью комплементарна 5 -концу РНК П (рис. 2). Морита и Ока предположили, что РНК I может негативно контролировать число копий плазмиды СоЙЗІ ( Mor-cca t Ojta. , 1979). Томизава с соавторами показали, что добавление РЖ І в систему синтеза ДНК плазмиды Co EI т ыг-о ингибирует образование праймер&и, соответственно, инициацию репликации плазмиды CofEI ( Tomiza- a etat.t 1981). Этими же авторами было показано, что РНК I не подавляет синтез праймерной РНК и не нарушает процессинг в области огі РНКазой Н; отсвда был сделан вывод, что РНК I ингибирует образование РНК-ДНК гибрида. Оказалось, что РНК I ингибирует в системе i vct o инициацию репликации ДНК не только плазмиды СоЙВІ, но и других плазмид Со І-типа, несовместимых с плазмидой Cota, и не ингибирует образование прай-мера у плазмид Со ЕІ-типа, совместимых с плазмидой CO/ЕІ. ТО есть, РНК I является негативным регулятором не только числа копий плазмидной ДНК, но и определяет несовместимость плазмид СооЕІ-типа. Как показал анализ нуклеотидной последовательности РНК I, она не кодирует каих-либо белков, которые могли бы негативно регулировать инициацию репликации. В ее последовательности нет инициаторных кодонов и много терминирующих кодонов. Поэтому было выдвинуто предположение, что в реализации негативно-контролирующей функции РНК I критическую роль играет ее вторичная структура ( MueUk et лі. ,1981; TorrUzcziva., Jio& 1981,1982). Действительно, нуклеотидная последовательность РНК I предполагает возможность существования трех палиндромов с петлями по 7 нуклеотидов, названных структурами I, П, Ш. 5 -конец РНК П может образовывать такие же, но только комплементарные структуры (рис. 3) ( Moritrtz , Оба , IW9; Lacafe/ia,Cesarnt ,1981; TorrtizcLwa , Jio-h , 1981). Кроме того, нуклеотидная последовательность РНК П, входящая в состав структуры Ш у плазмиды Со$31, может образовывать палиндром с последовательностью, удаленной от нее на 82 нуклеотида в сторону OP-L . Этот палиндром, альтернативный структуре Ш, получил название структуры ІУ ( TomizcL\krA. % feo&s , 1981). Он состоит из стебля величиной в 21 нуклеотид и петли величиной 82 нуклеотида (рис. 26 ). Существует предположение, что эта структура необходима для образования РНК-ДНК гибрида между РНК П и матричной ДНК и для узнавания этого гибрида РНКазой Н ( Tor UzA»rat rtoJi , 1981; Ъалп &оп 1984). В пользу этого предположения говорит тот факт, что точечные мутации в стебле, изменяющие структуру этого палиндрома, влияют на копийность плазмидной ДНК ( a-iri n- , 1984, для ссылок). Тошзава и Ито предполагают, что регуляция инициации репликации плазмид СОЕІ типа происходит следующим образом. Синтезированная праймерная РНК образует структуру ІУ, связывается с комплементарной нитью ДНК, в результате формируется РНК-ДНК гибрид, который узнается в области or РНКазой Н, процесси-руется и с полученного в результате процессинга праймера ДНК-полимеразой I начинается синтез новой нити ДНК. Если же РНК П связывается с РНК I, то вместо структуры ІУ образуется структура Ш. Препраймерная РНК с такой структурой не способна формировать РНК-ДНК гибрид, и праймер для синтеза новой нити ДНК не образуется ( ToryUzawa , J{o& , 1981, 1982). Необходимо отметить, что маленькие РНК, подобные РЖ I (от 107 до 119 нуклеотидов) обнаружены и у других плазмид Co/EI-типа {&$FfO30 , pI5A, F&Z2Z и UoBP/3 )ф РЖ I, так же, как и РЖ П перечисленных выше плазмид, может формировать палиндромные структуры, аналогичные структурам РЖ I и РЖ П плазмиды CofeL. Хотя по сравнению с Со ЕІ в петлях и стеблях структур у этих плазмид имеются нуклеотидные замены, характер и локализация палиндромов у всех перечисленных выше плазмид одинаковы. Поэтому есть все основания считать, что механизмы регуляции их репликации одинаковы и связаны с РЖ I. Механизм взаимодействия РЖ П и РЖ І в настоящее время интенсивно изучается. Получен и охарактеризован целый ряд точечных мутантов плазмиды Co EI в области ДЖ, определяющей синтез прай-мерной РЖ и РЖ I, влияющих на копийность плазмиды и несовместимость и изменяющих структуру палиндромов этих РЖ и нуклеотид-ный состав петель. Лакатена и Цезарени, изучая точечные мутанты плазмиды Со ЕІ-типа pMBI в области синтеза РНК I и РНК П, показали, что взаимодействие РНК П и РНК I происходит за счет связывания нук-леотидов, заключенных в петлях структур її и Ш РНК її, с комплементарной последовательностью РНК I. Они нашли, что в этом взаимодействии участвует всего 7 нуклеотидов ( 6a.catena. , Ck&ezr esu., 1983). Два из них были локализованы в петле структуры Ш (2 и 3 от б -конца петли) и 5 нуклеотидов - в петле структуры її (первые 5 нуклеотидов от 5 -конца петли). При этом, как показали авторы, нуклеотидный состав семи взаимодействующих оснований может быть любым и влияет только на силу и специфичность связывания. Регуляция инициации репликации и контроль несовместимости у плазмид группы Р її и плазмид Со&Е-типа во многом сходны. Репликативный фрагмент плазмид группы Р Ц , кроме елка fcepirt , позитивно-контролирующего инициацию репликации, содержит также два гена, продукты которых участвуют в негативном контроле репликации - copJ- и Сор (или rtpJ}2 ) - рис. 6а ( R.O i&rt & ж , 1980). Продукт гена сор 3 , белок с молекулярной массой 9,7 Кд (84 аминокислоты), отличается по своим характеристикам у взаимно несовместимых плазмид d , /в /о о и В С -5 , из чего был сделан вывод, что он не участвует в определении свойств несовместимости плазмид этой группы 1980). Кроме того, было показано, что, несмотря на мутацию в этом гене, плазмида ЦІ определяет несовместимость, то есть ген сор В не является необходимым для этой функции плазмиды ( cotl , 1984). Продукт гена сер Я - РИК размером -99 т.п.н., называемая РНК Е или РНК I. В репликативной области плазмид уб d и В -{00 локализованы три промотора ( Lur-& & & , 1981), с которых синтезируется три вида РНК: I) транскрипт РНК-С — мРНК для белков Сор В и &.e.pjfd (1380 нуклеотидов); 2) транскрипт РНК А или РНК П - мРНК для белка ер Лі (1150 нуклеотидов); 3) транскрипт РНК Е или РНК I (99 нуклеотидов) ( \ХґОт&& cta 1984) (рис. 6а). Показано, что белок CopS ингибирует транскрипцию гена f &pJM . Мишень для этого белка находится внутри района в 60 нуклеотидных пар, содержащего промотор РНК П ( I/ t Af, MoU sv , 1981, 1982). Продукт гена Сор J РНК I кодируется внутри гена ъерЛ; она считывается с противоположной нити ДНК и таким образом комп - 58 лементарна 5 концу мРНК для белка к р Л1 . Нуклеотидная последовательность этой РНК предполагает существование двух палинд-ромных структур с петлями по 4 и 6 нуклеотидов ( &ote t ел ау 1980,1981; Brady d al t 1983). Показано, что мутации, изменяющие ингибиторную активность РНК I и несовместимость плаз-мид группы Р я , локализуются в петле из 6 нуклеотидов одного из двух палиндромов { &(" х.ау & а f 1983). РНК I проявляет свою ингибиторную активность, связываясь с транскриптами мРНК для белка Яьр 31 ( Х/от4е & f 1984). Существует предположение, что РНК I, гибридизуясь с комплементарной последовательностью РНК П или РЖ-Сх, изменяет ее вторичную структуру подобно аттенюаторному механизму регуляции многих оперонов. Основываясь на нуклеотидной последовательности, Вомбл с соавторами построили вторичную структуру для РЖ-Сх, в которой сайт связывания рибосом однонитевой. Однако, когда РЖ I связывается с РЖ-Сх, последовательность, необходимая для связывания рибосом, вовлекается во взаимодействие с основаниями петли одного из палиндромов РЖ I; таким образом, она уже не существует в однонитевой форме. Связывания мРЖ для белка &pJJ с рибосомой не происходит, и kifJli белок не синтезируется ( У(/ог«&е. -с-їа, 1984). Общий механизм регуляции репликации плазмид Hi , 4о о ж Ь э можно представить следующим образом. В норме промотор РЖ-Сх (промотор I) более активен, чем промотор РЖ П (2), то есть преобладает РНК-Сх транскрипт. Обе РЖ П и РЖ-Сх кодируют ВерМ белок. Промотор I экспрессируется конститутивно, а промотор 2 репрессируется белком Серб , который транслируется с РЖ-Сх. Если число копий плазмидной ДЖ падает ниже двух на хромосому, уровень Р & белка, который пропорционален дозе гена, снижается. Это дерепрессирует транскрипцию РЖ П, увеличивается количества белка И&рЛІ , вследствие чего усиливается репликация, В результате транскрипции с промотора гена c pj синтезируется РНК I, которая, связываясь с РНК-Сх и РНК П, препятствует синтезу белка Ве.р$ ( Scoit f 1984; orn te- &t a, 1984). Аналогично регулируется инициация репликации плазмиды pTI8I из Sta-p toc ccA л .реПликативный аппарат этой небольшой (4,5 т.п.н.), мультикопийной (20 копий на клетку) плазмиды содержит «?лб , с которого идет однонаправленная репликация и который находится внутри рамки считывания для белка 2 ер С (37,5 Д), необходимого для инициации репликации ( к"как, fcovibk , 1983, Моъььк г А/ % 1984). Внутри длинной ли-дерной последовательности мРНК белка t p С кодируются две маленькие РНК. На основе анализа мутаций, изменяющих структуру этих РНК, показано, что они отвечают за несовместимость и контроль числа копий ( МотгСск е а % 1982). Предполагается, что эти маленькие РЖ, связываясь с мишенью на лидерной последовательности мРНК белка 2&р С изменяют ее вторичную структуру, запрещая трансляцию белка ер С , аналогично регуляции инициации репликации плазмид группы F Е ( Sc z , 1984). Выделение колицинов проводилось по следующей методике. Клетки колипиногенного штамма растили при температуре 37с с аэрацией на среде М9 с Хоттингером (3:1) от начальной оптической плотности 0,05 при 536 нм по спектрофотометру СФ-26 до плотности 0,6-0,8. Затем добавляли митомицин С до конечной концентрации 100 мкг/мл или хлорамфеникол до конечной концентрации 100 мкг/мл. Клетки растили 4 часа, собирали центрифугированием при 5.000 об/мин, 10 мин, промывали несколько раз физиологическим раствором, ресуспендирова-ли в небольшом количестве (5-7 мл) физиологического раствора и озвучивали на дезинтеграторе (21 КГц, 6 мкм, диаметр насадки 3 мм, время 10 мин). Активность колицина определяли по методу "пятен" ( Нег&с& я-п, He&rtd-kc t 1967). Метод основан на способности колицина убивать чувствительные клетки и вследствие этого образовывать пятна задержки роста клеток индикаторного штамма. Проба колицина объемом 5 мкл из соответствующего разведения (обычно делались серии 10-ти или 5-ти кратных разведений от I до 6) наносилась на поверхность газона чувствительных клеток. При дора-щивании газона в течение 12 часов при температуре 37С возникали зоны задержки роста диаметром 5-15 мм. То наибольшее разведение колицина, которое сохраняло убивающую активность, принималось за титр колицина. Для этой цели нами был разработан метод одновременного перевода нуклеазой сверхскрученной ДНК плазмид с различными молекулярными массами (от I до 70 мегадальтон) в открытую форму с последующим электрофоретическим и электронномикроскопическим анализом. Гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазой S і проводили следующим образом: к раствору ДНК добавляли раствор разбавленного фермента так, чтобы на I мкг ДНК приходилось 20-100 единиц активности фермента. Через I, 15 и 30 мин после инкубации при 37С реакцию останавливали охлаждением до 0С и добавлением двойного объема холодного раствора, содержащего Трис ЯСС (Ю мМ, рН 10,5) и ЛЛь3 -- соль ЭДТА (5 мМ, рН 8,0). Метод описан в работе (Дрыгин, Зверев, 1982). Клетки штамма, содержащего плазмиду, выращивали в присутствии %-тимидина (I мкКюри/мл) и дезоксиаденозина (250 мкг/мл) при 37С с аэрацией, В середине логарифмической фазы (оптическая плотность 1,6-1,8 по СФ, 536 нм) отбирали 50 мл культуры для определения числа копий, 5 мл для определения общего количества ДНК в клетке и I мл для просчета числа клеток под микроскопом в камере Горяева. Клетки, используемые для определения числа копий плазмидной ДНК и общего содержания ДНК, центрифугировали при 5,000 об/мин, 20 мин и отмывали TBS буфером. Клетки лизировали по методу, предложенному ранее {Ва.г&г а/, // pltn Mt t 1968). Клетки суспендировали в 5 мл смеси, содержащей 100 мг сахарозы, I мг лизоцима и 500 мкг РНКазы в TBS буфере. РНКазу предварительно прогревали при 70С 10 мин. Суспензию клеток инкубировали 10 мин при 37С, затем охлаждали 5 мин в ледяной бане и добавляли 2,5 мл 2% раствора саркозила. Полученный лизат пропускали 3-4 раза через пипетку, добавляли 5 мл буфера и пропускали через пипетку 20 раз со скоростью 0,3 мл/сек. В полученный грубый лизат клеток добавляли Cs С д0 конечной концентрации 0,963 г/мл и бромистый этидий 250 мкг/мл. Центрифугирование проводили в условиях, описанных выше. После центрифугирования содержимое пробирок раскапывали на фракции по 0,25 мл. Затем из каждой пробирки отбирали аликвоты, добавляли по 2 мл дистиллированной воды, 2 капли 0,2 раствора альбумина и 2,5 мл 10$ ТХУ, выдерживали 30 мин на холоду и фильтровали через мембранные фильтры марки HLl FS . Фильтры просушивали и просчитывали в газопроточном счетчике. Строили графики распределения радиоактивности и рассчитывали площади пиков плазмидной и хромосомной ДНК. Площади пиков определяли взвешиванием на аналитических весах. Общее содержание суммарной ДНК определяли с дифениламином по методу Бартона ( Barton- , 1956). Клетки (из 5 мл культуры) суспендировали в I мл дистиллированной воды, добавляли I мл 10$ ТХ7 и выдерживали на холоду I час. Затем клетки центрифугировали, отмывали I раз 5% ТХУ и осадок гидролизовали в 0,5 мл Ъ% хлорной кислоты при 70С 20 мин. Осадок центрифугировали при 4.000 об/мин, 15 мин, на холоду, супернатант сливали. К осадку добавляли 0,4 мл Ъ% хлорной кислоты и еще раз проводили гидролиз. Объем гидролизата доводили до одного мл. На определение ДНК брали 0,4 мл гидролизата, доводили до I мл Ъ% хлорной кислотой и добавляли 2 мл реактива с дифениламином. Реактив готовили следующим образом: 1,25 г дифениламина, 0,75 мл H SO (проба Саваля) и 50 мл ледяной уксусной кислоты смешивали, отбирали 50 мл смеси и добавляли 0,25 мл ацетальдегида. В качестве контроля брали I мл 5% хлорной кислоты и 2 мл реактива. Пробы инкубировали 18 часов при 37С. Измерения проводили на спектрофотометре при длине волны 600 нм против контроля. Расчет количества ДНК проводили по калибровочной кривой, приготовленной с использованием чистого препарата ДНК. Зная число клеток и общее количество ДНК, определяли количество ДНК на клетку по формуле: Было определено число копий плазмид Со II , Colb и Col к. после 10 часов роста в присутствии хлорамфеникола. Эти данные представлены в табл. 4. Число копий плазмиды GoCk в этих условиях возросло в 10 раз; Col Ъ - в 16 раз; й 1 К. - в 8 раз. Относительно репликации плазмиды С&1 Е 2. в присутствии хлорамфеникола в работе Такона и Шерратта ( Тасоп t S-farral, 1976) имелось указание на то, что эта плазмида не амплифицирует-ся хлорамфениколом. Однако никаких фактических данных приведено не было и ничего не было известно о кинетике ее синтеза в этих условиях. В нашей работе репликация плазмиды СоЕ2 В присутствии хлорамфеникола, как и репликация хромосомной ДНК, резко подавляется. Таким образом для репликации плазмид Col Л , & ІЮ и й 1 С не требуется синтез белка dc novo , как и для репликации плазмиды СоДзі; для репликации СоЕ2 синтез белка необходим. Такое различие в репликации малых колициногенных плазмид может говорить о том, что в регуляции репликации плазмид СоЛ, Col & » & и Col /С , с одной стороны, и плазмиды Col 2 , с другой, имеются существенные отличия. Представляло интерес выяснить существуют ли еще какие-нибудь отличия в генетическом контроле репликации этой группы плазмид. Для этого мы попытались изучить зависимость репликации малых колициногенных плазмид от ряда генов, продукты которых участвуют в репликации хромосомной ДНК. Известно, что для репликации плазмиды Col Ei необходима ДНК-полимераза І. В клетках с нарушенной активностью этого фермента репликация этой плазмиды не происходит ( Мсп% Ь -гу, HeUnhki 9 1973). В настоящей работе было показано, что для репликации плазмид ColJ, СоСЪ и Colic также необходим этот фермент. При трансформации клеток Е. cole / 5 роСМ Colic- %нк мы не обнаружили ни одной колонии, синтезирующей колицин К, в то время как трансформация изогенного poLJ штамма \&344о происходила с высокой частотой. При трансформации температурочуветви-тельного мутанта по ДНК-полимеразе 7 Е cole KL 4os Х ию плазмид Col Л и Col Э при пермиссивной температуре (30С) были получены клоны, синтезирующие колицины J и 2) . При переносе клеток в непермиссивные условия (42С) в течение нескольких генераций плазмиды элиминировались и признак колициногенности терялся. Ранее были получены данные о том, что плазмида &?1 В 2. , хотя и в меньшей степени, чем плазмида Col El , нуждается для своей решшкации в этом ферменте ( f bnq Lkccr y/ tfe&ntkl, 1973). Таким образом, все исследуемые в этой работе плазмиды нуждаются для своей репликации в ДНК-полимеразе I. Зависимость репликации плазмиды СоІЕІ от продуктов генов cl ajit ctna-& , dna-C и di Cr исследовалась несколькими экспериментаторами. Однако, в работах разных авторов исследовались различные мутанты по этим генам, что возможно определяло противоречивость полученных результатов (см. раздел Литературный обзор ) Поэтому при изучении репликации плазмид Соі$ Col X), Cot 2. и CoL fc в dna мутантах параллельно исследовалась в этих мутантах и репликация плазмиды СоіЄІ # Кроме того, почти во всех работах по изучению репликации Col F и других малых плазмид в dn & мутантах, эти плазмиды вводили в мутант-ные штаммы конъюгацией, используя для мобилизации различные большие трансмиссивные плазмиды,внося таким образом в клетку мутантов дополнительную генетическую информацию (о способностях конъюгативных плазмид супрессировать различные «- мутации говорилось в литературном обзоре ). Мы передавали исследуемые нами плазмиды в мутантные штаммы только трансформацией, что исключало возможность побочного влияния трансмиссивных плазмид. Как правило, все исследователи при изучении репликации плазмид в температурочувствительных etna, мутантах оценивали уровень синтеза плазмидной ДНК по количеству ее в ССС форме. Чтобы убедиться, не происходит ли при этом искажения реальной картины репликации за счет накопления какой-либо другой формы плазмидной ДНК, было определено процентное соотношение различных форм плазмидной ДНК, синтезированной во всех используемых в работе мутантах при пермиссивной (30С) и непермиссивной (43С) температурах. Это соотношение оказалось практически одинаковым для всех плазмид при 30С и 43С во всех мутантах и составляло в среднем: ССС формы - 80$, ОС формы - 15$, линейные молекулы -4,5-5$, димеры и про.- 0,5-1$. Кривые синтеза ДНК плазмид CoL J , Col 7) t Col ?t Col A: ж Col В І в dne-J , cLuL S и etyi C мутантах приведены на рис. II, 12, ІЗ. Расчет количества синтезированной ДНК приведен в разделе Материалы и методы.РНК I- основной негативно-контролирующий фактор инициации репликации и несовместимости плазмид СоЕІ-типа
Структура репликативных участков и плазмидоспенифические белки, позитивно-регулирующие репликацию плазмидной ДНК
Репликация колициногенных плазмид в условиях подавления синтеза белка
Нуклеотидная последовательность участков плазмид Со/А и Соб ответственных за их автономную репликацию
Похожие диссертации на Особенности репликации и структуры ДНК малых колициногенных плазмид
