Гомологическая рекомбинация у эукариот Шалгуев Валерий Иванович

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1, Обзор литературы -14 -

1.1. Введение - 14 -

1.2. Гомологическая рекомбинация у прокариот - 14 -

1.2.1. Схема гомологической рекомбинации - 15 -

1.2.2. Биохимические свойства белка RecA у бактерий - 17 -

1.2.3. Пространственная структура белка RecA -20 -

1.3. Гомологическая рекомбинация у эукариот - 22 -

1.3.1. Схема гомологической рекомбинации у дрожжей S. cerevisiae - 23 -

1.3.2. Три субсемейства белков ГР у дрожжей S. cerevisiae -23 -

1.3.3. Биохимические свойства белка Rad51Sc -25 -

1.3.4. Схема гомологической рекомбинации у Я sapiens -28 -

1.3.5. Консервативность нуклеопротеиновых филаментов RecAEc, Rad51Hs HRad51sc -32 -

1.4. Дрожжи P. angusta как объект исследований -33 -

1.5. Водоросли С, reinhardtii как объект исследований - 34 -

1.6. Задачи данного исследования - 34 -

Глава 2. Материалы и методы - 36 -

2.1. Бактериальные и дрожжевые штаммы - 36 -

2.2. Приборы и оборудование -36 -

2.3. Ферменты и реактивы - 36 -

2.3.1. Ферменты - 36 -

2.3.2. Среды -37-

2.4. Плазмиды -37-

2.4.1. Выделение плазмидной ДНК -37-

2.4.2. Клонирование и секвестрование гена&4>5/ из .P. angusta - 38 -

2.4.3. Конструирование и секвемирование плазмид - 38 -

2.5. Олигонуклеотиды - 40 -

2.6. Выделение, визуализация и определение концентрации белков - 42 -

2.6.1. Выделение белка Rad51 р:, из P. angusta - 42 -

2.6.2. Выделение белка Rad51CCr из С. reinhardtii - 44 -

2.6.3. Выделение белкаRad51CCr-His6 из С. reinhardtii - 46 -

2.6.4. Выделение белков RPA и Rad51Sc из S. cerevisiae -46-

2.6.5. Выделение белка RecAEc из. colt -46 -

2.6.6. Визуализация белков методом иммуноблотинга - 46 -

2.6.7. Определение концентрации белков - 46 -

2.7. Тестирование нуклеазной активности в препаратах белков - 47 -

2.7.1. ОнДНК-экзоиуклеазный тест - 47 -

2.7.2. ДнДНК-экзонуклеазный тест -47 -

2.7.3. ДнДНК-эндонуклеазный тест -47-

2.7.4. Геликазный тест -48 -

2.8. Анализ кинетических параметров реакции гидролиза АТФ, катализируемого

белками Rad51 и RecA - 48 -

2.8.1. Гидролиз АТФ -48-

2.8.2. Кинетические параметры гидролиза АТФ - 48 -

2.8.3. Термодинамические параметры активации гидролиза АТФ -49 -

2.8.4. Термодинамические параметры инактивации гидролиза АТФ - 49 -

2.9. Тестирование связывания белка Rad51CcrHis6 с онДНК {молекулярным битном)- 50-

2.10. Рекомбинационный перенос нитей ДНК in vitro -52 -

2.10.1. Реакция переноса нитей с радиоактавномеченной ДНК - 52 -

2.10.2. Реакция переноса нитей с субстратом на основе фагафХ174 - 52 -

2.10.3. Реакция замещения нити с флуоресцентномеченной ДНК - 53 -

2.10.4. Анализ кинетических параметров реакции замещения нити ДНК - 54 -

2.11. Тестирование функциональной компенсации дефекта гена RAD51 в S. cerevisiae - 54 -

2.12. Статистическая обработка результатов -55 -

Глава 3. Исследование рекомбинационных и термодинамических характеристик белков Rad51 из дрожжей P. angusta и S. cerevisiae - 56 -

3.1. Клонирование и первичная структура гена A4Z)5i из P. angusta - 56 -

3.2, Экспрессия и выделение белка Rad51Pa из P. angusta - 61 -

3.3. Гидролиз АТФ, катализируемый белком Rad51Pa -62-

3.3.1. ДНК-зависимая скорость гидролиза АТФ - 62 -

3.3.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность - 63 -

3.3.3. Стехиометрия связывания белкаКагі51рЕісонДНК - 63 -

3.3.4. Стимуляция онДНК-зависимой АТФазной активности белка Rad51Pa белками SSBHRPA -64-

3.3.5. Сравнение термостабильности белков Rad51Pan Rad51st: -65 -

3.3.6. Термозависимость нуклеации - 69 -

3.3.7. Кинетические параметры гидролиза АТФ -69 -

3.3.8. Кооперативность гидролиза АТФ - 70 -

3.3.9. Зависимость гидролиза АТФ от рН - 71 -

3.4, Рекомбинационный перенос онДНК, активируемый [Rad51Pa::ATP::oH,irHK] - 73 -

3.4.1, Реакция замещения нити ДНК - 73 -

3.4.2. Реакция переноса нитей ДНК - 75 -

3.5. Анализ функциональной компенсации дефекта генаRAD51 в дрожжах . cerevisiae..- 77 -Глава 4. Изучение рекомбинационных свойств и кинетических параметров белка RadSIC из микроводоросли Chlamydomonas reinhardtii - 79 -

4.1. Выделение белков Rad51CCr и Rad51Ccr-HiS6H3 С. reinhardtii - 79 -

4.2. Гидролиз АТФ, катализируемый белками Rad51CCtH Rad51 Co-His^- 82 -

4.2.1. Температурная зависимость скорости гидролиза АТФ - 82 -

4.2.2. Влияние различных субстратов ДНК на АТФазную активность - 83 -

4.2.3. Зависимость скорости гидролиза АТФ от рН - 86 -

4.2.4. Стехиометрия взаимодействия белка Rad5 lCcrHis6 и пoлиdT) в пресинаптическом комплексе - 89 -

4.2.5. Стабильность пресинаптического комплекса - 89 -

4.3. Анализ кинетики связывания белка Rad51 CCr-His6 с онДНК (молекулярным биконом) -90-

4.4. Рекомбинационный перенос онДНК in vitro, катализируемый [Rad51CCr Hisu::ATP::oHflHK] -92-

4.4.1. Реакция замещения нити ДІЖ -92 -

4.4.2, Реакция переноса нитей ДНК - 95 -

Глава 5. Обсуждение - 98 -

5.1. Термальная адаптационная гипотеза -98 -

5.2. Анализ термостабильности белков -100 -

5.3. Связь скорости гидролиза, катализируемого RecA-подобным белком, со сложностью генома и длиной клеточного цикла -103 -

5.4. Биохимические и рекомбинациониые характеристики белка Rad51ра из P. angusta.,.-104 -

5.5. Биохимические я рекомбинациониые характеристики белка Rad51С из С. reinhardtii-104 -

Глава 6. Выводы -106 -

Список публикаций по теме диссертации - 107 -

Список литературы - 109 -

• Схема гомологической рекомбинации
• Конструирование и секвемирование плазмид
• Клонирование и первичная структура гена A4Z)5i из P. angusta
• Выделение белков Rad51CCr и Rad51Ccr-HiS6H3 С. reinhardtii
• Термальная адаптационная гипотеза

Введение к работе

Актуальность проблемы

Рекомбинация ДНК - один из фундаментальных процессов, происходящих в живой клетке. К настоящему времени наиболее детально исследована гомологическая рекомбинация (ГР) у прокариот. Основой процесса ГР у прокариот является способность белка RecA катализировать клеточную реакцию синапсиса и обмена нитей ДНК. Белок RecA играет центральную роль в гомологической рекомбинации и участвует в процессах: рекомбинационной репарации, репликации, мутагенеза, клеточного деления, регуляции экспрессии многих репарационных генов и индукции SOS-ответа клетки у бактерий [1-3].

Структурные и функциональные аналоги белка RecA обнаружены во всех организмах: от бактерий до эукариот, включая человека [4, 5]. Хотя многие принципиальные механизмы являются общими у прокариот и эукариот, ГР у высших организмов отличается наибольшей сложностью. Поэтому поиск аналогов белка RecA и исследование механизма ГР у эукариот является актуальной задачей молекулярной биологии.

Дрожжи Pichia angusta - один из видов таксономического комплекса метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha - являются интересным объектом, привлекающим внимание в качестве продуцентов для получения рекомбинантных белков. Уникальность дрожжей P. angusta состоит в их термотолерантности, т.е. в способности расти при высоких температурах вплоть до 50 С. Сравнение генома P. angusta с геномом Saccharomyces cerevisiae показало, что среди 2500 идентифицированных генов P. angusta 94% обладают гомологией с S. cerevisiae, тогда как 6% не обладают гомологией. До настоящего времени в литературе не было сообщений об обнаружении в геноме P. angusta генов, ответственных за гомологическую рекомбинацию и рекомбинационную репарацию.

В настоящей работе клонирован гена RAD51 из термотолерантного штамма Р. angusta, и приведены основные рекомбинационные характеристики белка Rad51Pa, кодируемого этим геном. Белок Rad51p_a является ДНК-зависимой АТФазой и проявляет типичные свойства семейства белков Rad51. В контексте белковой термостабильности биохимические и рекомбинационные свойства белка Rad51p_a сравнивали с Rad51s_c [6].

Вторым модельным объектом биохимических исследований была одноклеточная зеленая микроводоросль Chlamydomonas reinhardtii. К моменту начала наших исследований ее система гомологической рекомбинации (ГР), лежащая в основе рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, была очень слабо изучена. В последние годы реализуется программа секвенирования ядерного генома С. reinhardtii. В

геноме были выявлены разнообразные нуклеотидные повторы. И было получено объяснение низкого уровня ядерной ГР относительно негомологичной рекомбинации. Анализ геномной и EST библиотек (EST - маркеры экспрессированных последовательностей) у микроводорослей С. reinhardtii позволил клонировать последовательность кДНК гена RAD51C. В настоящей работе ген RAD51C был экспрессирован, выделен и очищен его продукт. Были также изучены основные рекомбинационные и биохимические активности белка Rad51 Ссг [7]. Цели и задачи исследования

Целями данной работы являлось демонстрация и анализ основ термотолерантности дрожжевого белка Rad51 из P. angusta и выявление рекомбинационных активностей белка Rad51C из микроводорослей С. reinhardtii. Для достижения этих целей были решены следующие задачи:

1. Клонирован ген RAD51 из термотолерантных дрожжей P. angusta.

2. Выделен белок Rad51_Pa.

3. Исследованы рекомбинационные и термодинамические характеристики белков Rad51 из дрожжей P. angusta Rad5 ls_c и S. cerevisiae.

4. Выделен белок Rad51C-His6 и Rad51C из С. reinhardtii.

5. Исследованы рекомбинационные характеристики белка Rad51C-His6.
Основные положения, выносимые на защиту

5. Белок Rad51p_a обладает основными биохимическими активностями, необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса.

6. При температуре 40-42С (оптимальной для роста клетки-хозяина) по сравнению контролем при 37С изменяются три характеристики пресинаптического комплекса, образуемого белком Rad51_Pa, АТФ и онДНК:

уменьшается время образования комплекса [Rad51_Pa::oHflHK:: АТФ];

уменьшается энергия активации АТФазной активности комплекса

|Т<ж151р_а::онДНК];

появляется способность пресинаптического комплекса [Т<ж151р_а::онДНК:: АТФ]

катализировать реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

3. Белок Rad51 Со- обладает следующими биохимическими активностями,
необходимыми для образования рекомбинационного пресинаптического комплекса
у водорослей С. reinhardtii:

ДНК-зависимая АТФазная активность;

способность к образованию нуклеопротеинового филамента на он- и днДНК;

ДНК-трансферазная активность.

Научная новизна

Впервые клонирован ген RAD51 из метилотрофных термотолерантных дрожжей Pichia angusta, способных к выживанию при температуре 50С.

Впервые показано, что белок Rad51 из P. angusta обладает термозависимыми характеристиками. При температуре выше оптимальной для роста клетки-хозяина (~40С) по сравнению с 37С: (1) уменьшается время образования и энергия активации АТФазной активности комплекса белка Rad51 и онДНК; (2) появляется способность комплекса катализировать ключевую реакцию ГР -реакцию обмена протяженных молекул ДНК.

Впервые показано, что белок Rad51C из водорослей С. reinhardtii способен: (1) образовывать нуклеопротеиновый филамент на онДНК; (2) катализировать реакцию замещения и обмена нитей ДНК.

Впервые получены доказательства консервативности функций белков семейства Rad51 из разных царств эукариот на примере термотолерантных дрожжей P. angusta и водорослей С. reinhardtii. Теоретическое и практическое значение работы

Результаты работы показывают сходство механизма ГР у низших и высших эукариот. Полученные данные могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов гомологической рекомбинации у различных эукариотических организмов. Теоретические результаты работы могут быть использованы в учебных спецкурсах по молекулярной биологии, читаемых на биолого-медицинских факультетах высших учебных заведений. Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на ежегодных конференциях молодых ученых Петербургского института ядерной физики (Гатчина, 2000-2005); VIII, IX и X Международных школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004, 2005, 2006 г.); Международной конференции "Chlamy 2004" Abstracts of 11th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Kobe, Japan, 2004 г.), Политехническом Симпозиуме "Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона" (Санкт-Петербург, Россия, 2004 г.), Международной конференции "The N.W. Timofeeff-Ressovsky conference" (Ереван, Армения, 2005 г), Международной конференции "Chlamy 2006" Abstracts of 12th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas (Portland, Oregon, USA, 2006).

Структура и объем диссертации

class1 Обзор литературы - class1 -

Схема гомологической рекомбинации

Биохимический механизм ГР у прокариот можно упрощенно представить в виде следующих последовательных стадий: инициация, гомологическое спаривание, обмен нитей ДНК с последующей миграцией ветви, образование продуктов рекомбинации (Рис. 1-2).

Инициация. На первой стадии появляется двунитевой разрыв (ДНР) в ДНК. Это событие происходит в клетке вследствие запрограммированного процесса или под воздействием окружающей среды. ДНР подвергается воздействию геликаз и/или нуклеаз, что приводит к образованию выступающего 3 -конца.

Гомологическое спаривание. На выступающем 3 -конце ДНК RecA-подобный белок образует нуклеопротеиновый филамент. НФ катализирует спаривание гомологичной последовательности ДНК, что приводит к появлению сцепленной молекулы ДНК (JM). После образования JM происходит процесс спаривания комплементарных нитей ДНК с образованием характерного интермедиата (промежуточного продукта), широко известного, как соединение Холидея (СХ).

Конструирование и секвемирование плазмид

Манипуляции с конструированием и секвенированием плазмидной ДНК проводили стандартными методами [150]. Плазмиды, использованные в работе, показаны (Рис. 2-І).

Нуклеотидиую последовательность гена RAD51 из термотолерантных дрожжей P. angusta депонировали в базу данных DDBJ/EMBL/GenBank с кодом доступа AY307358 (Рис. 2-2). Плазмиду pET21-PaRad51 получили клонированием фрагмента ДНК, несущего ген RAD51 из Р. angusta, в вектор рЕТ21 b по сайтам рестрикции Ndel и Xhol под промотор Т7.

Плазмидную конструкцию pYES2-PaRad51 создали клонированием фрагмента ДНК, несущего ген RAD51 из P. angusta, по сайтам рестрикции EcoRI и Xhol в экспрессионный челночный S. cerevisiae IE. coli вектор pYES2 под промотор GAL1 (Рис. 2-5).

Строение плазмид, использованных в работе. Обозначения: R-iactamase - ген, кодирующий (3 -лактамазу; PaRADSl- геи, кодирующий белок Rad51 из P. angusta; RAB51C - ген, кодирующий белок Rad51 из С. reinhardtii; RAD51C-Hke- ген, кодирующий белок Rad51C из С. reinhardtii с 6 гистидинамм иаС-конце белка.

Анализ баз данных EST последовательностей кДНК микроводоросли С. reinhardtii выявил две последовательности (A V6295S3 и BG848251), кодирующие белок сходный с белком Rad51С из Arabidopsis. Используя ПЦР с праймерами, специфичными к AV629583 и BG848251, кДНК белка Rad51Co амплифицировали на основе библиотеки кДНК из С. reinhardtii. Амплификат іоюнировали в плазмиду pBIuescriptRS+ и секвенировали. Обнаружили открытую рамку считывания длиной 1059 нп, кодирующую белок длиной 352 аа и молекулярной массой 37.6 кДа (AY058913). Аминокислотная последовательность имела достоверное сходство с белками Rad51C из Arabidopsis и Japanese rice (идентичность составила 41 и 43% соответственно), а также человека и домовой мыши (идентичность около 39%) (Таблица 4-1; 4-2). Кодирующую кДНК белка Rad51C (со стоп-кодоном и без него) клонировали в вектор pBluescriptKS+ с образованием плазмид pKSrad51 C-stop и pKSrad51C-Hisfi соответственно. Плазмиды pET21-Rad51C и рЕТ21 -Rad51 CsE (содержащие ген Rad51C с полигистидиновым (6 аа) трактом на С-крнце и ген Rad51C дикого типа соответственно) получены клонированием фрагмента кДНК, несущего ген RAD51C из С. reinhardtii в вектор рЕТ21Ь по сайтам рестрикции Ndel и Xhol под промотор Т7 (Рис. 2-1). Нуклеотидную последовательность гена RAD51C водорослей С reinhardtii депонировали в базу данных DDBJ/EMBL/GenBank с кодом доступа АУ058913 (Рис. 2-3).

Клонирование и первичная структура гена A4Z)5i из P. angusta

В качестве матрицы ПЦР использовали геномную ДНК термотолерантиых дрожжей Р. angusta. Этот фрагмент клонировали в плазмиду pUC19 по сайтам рестрикции EcoRI и секвенировали. Сравнение полученой аминокислотной последовательности, которая кодируется фрагментом (#15), с аминокислотной последовательностью белка Rad51Sc выявило, что данный фрагмент принадлежал гену, кодирующему участок белка Rad51Pil (более 80% идентичных аминокислот). Была создана библиотека геномной ДНК P. angusta по рестриктазам Xhol и ВатШ на базе плазмиды pUC19. Гибридизация по Саузерну показала, что клонированный ранее фрагмент гена находился на участке размером 2400 пн в библиотеке по рестриктазам Xhol и ВатШ. В качестве зонда использовали радиоактивномеченный продукт однопраймерной амплификации (#15). Однако скрининг геномной библиотеки не дал положительных результатов из-за недостаточной клоновой представительности библиотеки и/или из-за токсичности рекомбинантного белка Rad51Pa для клеток Е. coli, и пониженной выживаемости клеток, содержащих ген RAD51 P. angusta.

Для клонирования полноразмерного гена RAD51 сконструировали библиотеку кДЫК дрожжей P. angusta в векторной системе Uni-ZAP XR (Stratagene). Библиотека содержала около ЗхЮ"1 клонов со вставками кДНК размером более 1000 нп. Скрининг библиотеки провели зондом #19 (продукт однопраймерной реамплификации), который получили из фрагмента гена RAD51 (552 нп), кодирующего "N-конец белка. Этот фрагмент получили с помощью ПЦР с праймерами #17 и #1S (в качестве матрицы служила библиотека кДНК из P. angusta).

В результате скрининга библиотеки выявили клон, содержащий открытую рамку считывания длиной 1107 нп, что соответствовало белку Rad51pa длиной 369 аа (Рис. 2-2; 3-1; 3-2; 3-3; 3-4). Аминокислотная последовательность белка Rad51Pa оказалась гомологичной белку RecA[EC (26% идентичных аминокислот), а также дрожжевому белку Rad51Sc (71% идентичных аминокислот) (Рис. 3-1; 3-2). Область строгой аминокислотной гомологии включала область от 154 до 374 аа для дрожжевых белков Rad51, и область от 33 до 240 аа - для RecAEc- Эта область соответствовала центральному домену белка RecA, где локализованы консервативные АТФ-связующие последовательности, мотивы Волкера (Таблица 3-1): типа A (G/AXXXXGKT/S), где X - любая аминокислота; типа В (LLVVD).

Наибольшее расхождение в аминокислотных последовательностях белков Rad51 Ра и Rad51sc выявлено в их N-концевых аминокислотных последовательностях (Рис, 3-1; 3-2; 3-3; 3-4).

Выделение белков Rad51CCr и Rad51Ccr-HiS6H3 С. reinhardtii

Свойство нерастворимости белка, использовалось в процедуре очистки для удаления ДНК и сопутствующих белков. Тельца включения, содержащие белок Rad51Ccr, растворяли в растворе 8М мочевины. После заключительной стадии очистки белок Rad51Ccr ренатурировали в состоянии близком к гомогенности. Анализ процесса ренатурации белка Rad51Ccr в процессе диализа с последовательным уменьшением концентрации мочевины проводили с помощью измерения поглощения образца при Я-згонм- Быстрое увеличение поглощения диализуемого образца белка при З20нм наблюдалось при уменьшении концентрации мочевины менее 1.5 М. Увеличение поглощения образца коррелировало с агрегацией белка Rad51C в растворе. Более 90% белка в процессе диализа образовывало агрегированную форму (которая удалялась центрифугированием) вследствие неправильной ассоциации частично ренатурированных мономеров белка Rad51Co Оставшуюся ренатурированную водорастворимую фракцию белка Rad51Ccr использовали в \ биохимических тестах. На (Рис. 4-3; 4-4) представлены результаты выделения обоих белков, полученные согласно процедуре, описанной в разделе "Материалы и методы". Как видно (Рис. 4-3), молекулярная масса белков Rad51Ccr и Rad51CCr-His6 (37 и 38 кДа соответственно) оказалась близкой расчетной (37.6 и 38.4 кДа соответственно).

Термальная адаптационная гипотеза

Пространственная структура нуклеиновых кислот, так же как и белков, поддерживается слабыми связями. Косвенным критерием информационной гибкости ДНК может служить температура их денатурации или плавления. Силы, стабилизирующие молекул нуклеиновой кислоты, должны находиться в соответствии с температурными условиями существования вида. Корреляция между температурой плавления ДНК и температурным оптимумом жизни вида может обнаруживаться, если сравнивать виды родственные, принадлежащие к одному роду (Таблица 5-1). Дезаминирование цитозинов и аденинов, гидролитическая депуринизация и разрыв нитей ДНК [196] - это процессы, характерные для организмов с высокой температурой оптимума роста (Tupi), приближающейся к точке кипения воды и выше. Из термальной адаптационной гипотезы, предложенной ранее [197, 19S], следует взаимосвязь между GC-составом генома и температурой существования вида, GC-пары являются более термально стабильными, чем пары AT, так как GC-шры связаны тремя водородными связями, а АТ-пары - двумя водородными связями [199]. Однако после анализа большого числа микроорганизмов другие авторы [200-202] отказались от адаптационной гипотезы. Бернарди предположил [203], что не существует ярко выраженной корреляции между GC-составом и оптимальной температурой роста (Тор(), если анализ проводится с генами отдаленно родственных организмов. Возможно, что связь между геномным GC-составом и Topt может существовать только для близкородственных видов [204, 205].