Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 4
2. Обзор литературы 6
2.1 Систематическое положение трипаносоматид 6
2.2 Субклеточная локализация и организация кинетопластиой ДНК (кпДНК) 8
2.3 Общая характеристика кинетопластиой ДНК (кпДНК) 9
2.4 Организация миникольцевых молекул кпДНК 15
2.5 Организация максикольцевых молекул кпДНК 19
3. Материалы и методы 33
3.1 Объекты исследования 33
3.2 Среды 33
3.3 Ферменты и реактивы 34
3.4 Выделение тотальной ДНК 37
3.5 Выделение кинетопластной ДНК 38
3.6 Рестрикция кинетопластной ДНК 40
3.7 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 40
3.8 Метод long PCR в присутствии бетаина с целью получения полной ДО 47
3.9 Очистка ПЦР-продуктов 50
3.10 Электрофорез ДНК в агарозном геле 50
3.11 Клонирование рестрикционных фрагментов ДО максикольцевой ДНК 51
3.12 Определение последовательности ДНК по Сэнгеру 56
4. Результаты и обсуждения 58
4.1 Различия гена ND8 консервативной области (КО) максикольцевой кпДНК между Leptomonas seymouri и Leptomonas collosoma 58
4.2 Построение рестрикциошюй карты максикольцевой кпДНК исследованных, видов 60
4.2.1 Построение рестрикционной карты максикольцевой кпДНК Leptomonas seymouri 60
4.2.2 Построение рестрикционной карты максикольцевой кпДНК Leptomonas collosoma 67
4.3 Клонирование и секвенирование рестрнкционпых фрагменнтов ДО и ПЦР-продуктов 70
4.3.1 Клонирование и секвенирование рестрнкционпых фрагменнтов и ПЦР-продуктов ДО максикольцевой кпДНК Leptomonas seymouri 72
4.3.2 Клонирование и секвенирование рестрикционных фрагменнтов и ПЦР-продуктов ДО максикольцевой кпДНК Leptomonas collosoma 86
4.4 Сравнительный анализ CSB-блоков в дивергентной области максикольцевой и в консервативной области миникольцевой кпДНК 89
5. Выводы 92
6. Приложение 93
6.1 Последовательность нуклеотидов участков ДО максикольцевой кп ДН К L eptomonas seymouri и Leptomonas collosoma 93
6.2 Последовательность нуклеотидов консервативной области миникольцевой кпДНК Lep. seymouri, Lep. collosoma и других видов 100
Список литературы 102
- Субклеточная локализация и организация кинетопластиой ДНК (кпДНК)
- Организация максикольцевых молекул кпДНК
- Очистка ПЦР-продуктов
- Сравнительный анализ CSB-блоков в дивергентной области максикольцевой и в консервативной области миникольцевой кпДНК
Введение к работе
Изучение паразитических простейших, относящихся к семейству
Trypanosomatidae, ломимо фундаментального интереса имеет и социальную
значимость. Эти организмы являются возбудителями тяжелых заболеваний
человека (трнпаносомозов и лейшманиозов), животных и растений. Поэтому
исследование фундаментальных молекулярно-биологических,
биохимических и паразитологических аспектов жизнедеятельности трипаносоматид, а также их филогении имеет большое значение.
Более чем 30-ти летние экспериментальные молекулярные исследования кинетопластной ДНК (кпДНК) позволили сформулировать основные принципы её организации, понять многие аспекты её функциональной нагрузки в клетке, выявить ряд уникальных по сложности биологических процессов, таких как репликация многокомпонентной катенированной системы кольцевых молекул и феномен редактирования РНК. Вместе с тем, остается очень много до конца не выясненных вопросов. Чем определяется столь необычно большое количество кпДНК в клетке? Несут ли миникольцевые молекулы ещё какую-либо функциональную нагрузку, кроме кодирования молекул гидовых РНК, необходимых для процесса редактирааания РНК? Какова степень полиморфности индивидуальных компонентов ассоциата кинетопластной ДНК? Какие гены (или иные участки кпДНК) могут быть использованы для оценки произошедших эволюционных событий и какова степень и специфичность дивергирования (т.е. эволюции) индивидуальных генов как на уровне вида, так и в пределах семейства, отряда? Каковы общие черты организации дивергентной области (ДО) кпДНК? К сожалению;, многие из этих вопросов (сформулированных ещё 15-20 лет назад) до сих пор остаются без ответа.
ДО кпДНК мало изучена. Сейчас известна первичная структура ДО кпДНК только для Crithidia oncopelti, Trypanosoma bmccl и, частично, для Leishmania tarenloiae, L mexicana amazonensis и L. major. Анализ первичной структуры кпДНК - первый шаг на пути всестороннего исследования кпДНК. Целью настоящей работы являлось ответить на вопрос: имеются ли закономерности в организации ДО кпДНК у низших (моногенетических) трнпаносоматид. В связи с этим ставились следующие экспериментальные задачи:
построить рестрикционную карту максикольцевой кпДНК;
получить рекомбинантные плазмиды, содержающие участки ДО максикольцевой кпДНК;
установить первичную структуру участков ДО максикольцеоґі кпДНК;
провести сравнительный анализ первичной структуры ДО максикольцевой кпДНК.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Субклеточная локализация и организация кинетопластиой ДНК (кпДНК)
По современным представлениям группа Kinetoplastida относится к одной из самых ранних ветвей эукариот. Поэтому не удивительно, что кинетопластиды имеют целый ряд уникальных черт, как примитивных, так и высоко специализированных (Donelson et al., 1999; McDonagh et al., 2000). Геном трипаносоматид состоит из двух частей: ядерной и митохондриальной. Митохондриальный геном составляет 10-25% суммарной ДНК (Laurent et al, 1971; Simpson, 1973). Весь геном клетки составляет 10 -10 тпн, что в десять раз превышает геном E.coli и в 2-3 раза геном дрожжей. Клетки кинетопластид содержат единственную гигантскую митохондрию, образующую в районе базального тела жгута особую структуру -кинетопласт (Рис. 2). Кинетопласт был обнаружен еще в начале XX века с помощью светового микроскопа. Позднее электронномикроскопические исследования показали, что кинетопласт - это центр митохондриального ретикулума. Там находится плотный ассоциат множества молекул ДНК (митохондриальная ДНК, кинетопластная ДНК, кпДНК), имеющих кольцевую форму и сцепленных между собой, формируя плоский диск. Кольца расположены внутри диска перпендикулярно его поверхности (Рис. 3). Толщина диска видоспецифична (Borstetal, 1979). Обычно кпДНК представлена в виде сложного ассоциата, состоящего из молекул двух классов. Это миникольцевые и максикольцевые молекулы (Simpson, 1973; Kleisen et al, 1975; Muhlpfordt, 1975). Каждый ассоцпат содержит примерно 20-50 максикольцевых и 5000-10000 миникольцевых молекул. Максикольцевая кпДНК в клетке транскрибируются и функционально аналогична митохондриальной ДНК других организмов (Simpson et al, 1980; Johnson et al, 1982). Такое большое количество ДНК и её компактное состояние в клетке позволило обнаружить её классическими цитохимическими методами ещё в конце прошлого века (цит. по Simpson, 1987). С момента обнаружения этой структуры для нее было предложено множество различных названий, но к настоящему времени осталось и прочно утвердилось лишь одно — «кинетопласт», отражающее её связь до жгутом. Кинетопласт всегда располагается с непосредственной близости от базального тела жгута. Это состояние не нарушается в течение всей жизни клетки, несмотря на то, что базалыюе тело претерпевает значительные морфологические изменения в жизненном цикле кинетопластид (Heywood et al, I97S). Дело в том, что базальное тело жгута обеспечивает сегрегацию делящегося ассоциата кпДНК при клеточном делении, т.е. играет роль, аналогичную роли центриолей при делении клеточного ядра (Robinson et al, 1991).
В свободном виде изолированный классический ассоциат кпДНК имеет компактную организацию (приблизительно 15 мкм в длину, 10 мкм в ширину и 0,3 мкм в толщину) (Perez-Morga et at, 1993). Электронно-микроскопический анализ выделенных препаратов кпДНК показывает, что ассоциат представляет собой сложноорганизованную сферическую структуру, напоминающую корзинку или сетку (в англоязычной литературе используются термины basket и network) (Рис. 4) (Martin et al, 1991; Guilbride et al., 1998). Морфология ассоциата может быть весьма разнообразной: встречаются как сферические и овальные ассоциаты, так и весь спектр переходных морфологических форм, но никогда не наблюдается вариант плоской структуры (Chen et al, 1995). Возможно, это связано со специфическими цитологическими особенностями организации, функционирования и репликации кпДНК. Размер миниколец видоспецифичен и варьирует от 0,7 до 12,5 тпн. Самые большие миникольца найдены у трипаносом птиц и рыб. Максикольца также варьируют по длине от 38 тпн. у некоторых видов рода Leishmania (подрод Sauroleishmania) до 20 тпн. у рода Trypanosoma. Была определена длина миникольцевых и максикольцевых молекул некоторых видов (Таблица 1). Толщина ассоциата кпДНК напрямую связана с размером миникольцеоон молекулы. Чем крупнее миннкольца, тем крупнее ассоциат. Так, самые крупные ассоциаты наблюдаются у трипаносом рыб и представителей рода Crithidia, а самые мелкие - у трипаносом млекопитающих и лейшманий (Simpson, 1987). Основной способ удержания индивидуальных миникольцевых молекул в ассоциате - это зацепление соседних колец по типу катенанов. При этом максикольцевые молекулы практически не принимают участия в обеспечении макроструктуры ассоциата. Ассоциат с удаленными максикольцами имеет ту же морфологию, что и нативный (Hajduk et al, 1979; Bonrois et al, 1981). Максикольцевые молекулы обычно хорошо видны при делении, когда они концентрируются в зоне расхождения дочерных ассоциатов. Если перенести пространственную структуру ассоциата на плоскость, то миникольцевые молекулы образуют псевдо-плоскую «кольчугу», у которой каждая молекула входит в зацепление с тремя соседними, а максикольца стягивают периферию к центру (Perez-Morga et al, 1993). Однако предложенная схема не совпадает с наблюдениями многих авторов по анализу морфологии ассоциатов с удаленными максикольцами, а также с морфологией ассоциата Т. eqtiiperdum, который не содержит максиколец (Riou et al, 1981). Подобное противоречие может быть объяснено, если предположить участие неких гипотетических небольших молекул (например, небольшой белок или специфические РНК), которые принимают участие в образовании структуры ассоциата и удержании всех компонентов вместе. Таким образом, ассоциаты с нарушенной структурой (удаление максиколец и части «удерживающих» молекул) не могут образовывать правильную пространственную структуру. 2.4 Организация мшшкольцевых молекул кпДНК Миникольца составляют основную массу ассоциата кпДНК (от 85 до 95%). Предполагается, что они ведут свое происхождение от митохондриальных плазмпд (Lukes et al., 2002). Миникольца являются наиболее высоковариабельным компонентом кпДНК трипаносоматид. Только 10% их длины занимает консервативная область, оставшаяся часть варьирует по величине и нуклеотидной последовательности не только между видами, но и между различными штаммами одного вида (Feagin et al., 1992; Simpson, 1987).
Даже в пределах одного кинетопласта миникольца обычно весьма гетсрогены. Степень гетерогенности различна у разных видов; у L. tarcntolae 5 классов составляют половину всех миниколсц, в то время как кпДНК Т. bmcei содержит более 400 различных классов миниколсц. У видов, для которых характерна частичная или полная потеря кинетопласта, обусловленная особенностями жизненного цикла (Т. eqiriperdttm, Т. eqtihmm и Т. cvansi), существует всего 1 микрогетерогенный класс миниколец (Barrois et al., 1981; Feagin et al., 1992; Songa et al„ 1990; Baltz et al., 1991). Эта гетерогенность может быть результатом множественных перестроек и рекомбинаций в процессе эволюции, Во всех исследованных к настоящему времени мшшкольцах выделяют консервативную область (КО) и вариабельную область. Общая протяженность консервативной области (участок относительной консервативности, характерный для определенного класса миниколец) составляет 120 - 180 нуклеотидов. Консервативная область миниколец имеет размер 120 пн у Т. brticei и 85 пн у L. tarentolae. Она может быть представлена в одной, двух или четырёх копиях на миниколыю в зависимости от вида. Гомология этой области между различными классами миниколец разных штаммов одного вида составляет около 90%, между разными видами она выражена слабее. КО проявляет высокую степень гомологии среди представителей одного вида и рода, однако она не гомогенна по своей организации. В пределах КО выделяют три района с очень высокой (90-100%) степенью гомологии: CSBI, CSBII и CSBIII (название CSB произошло от англ. «conserved sequence block», Ntambi and Englund, 1985; Ntambi et al., 1986; Ray, 1989). Участки CSBI и CSBIII практически абсолютно идентичны среди как высших, так и низших трипаносоматид, тогда как для CSBII могут наблюдаться и отклонения от канонической последовательности. CSBI (GGGCGT) - последовательность, связанная с точкой начала репликации отстающей цепи; CSBII (CCCGTTC); CSBIII (GGGGTTGGTGTA) - последовательность, связанная с точкой начала репликации лидирующей цепи. Считается, что CSBIII структурно и функционально связан с инициацией репликации лидирующей цепи, a CSBI - отстающей цепи ДНК (Kitchin et al., 1985; Scheline et a!., 1989). Перед CSBI находится район относительной или видоспецифичной консервативности. Он консервативен у разных клонов, штаммов и изолятов одного вида (Рис. 5).
Организация максикольцевых молекул кпДНК
Максикольца гомологичны митохондриальному геному других групп и, как полагают (Колесников, 1993), гомогенны по последовательности в одном кинетопласте. Максикольца состоят из двух областей - консервативной и вариабельной (дивергентной) (Рис. 6). Консервативная область содержит плотно сгруппированные гены митохондриальных белков, рРНК и часто гРНК. Она кодирует 12S и 9S рРНК; 1_? 3-, 4-, 5-, 7-, 8- и 9-ую субъединицы NADH-дегидрогеназы; апоцитохром Ь; 1-, 2- и 3-ую субъединицы цитохромоксидазы; 6-ую субъединицу АТФазы; четыре неидентифицированных открытых рамки считывания (MURF) (Рис. 7). Порядок расположения генов и общая длина консервативной области (17-20 тпн) сходны для всех видов (Munich et al., 1983; Maslov et al., 1984). Транскрипты генов консервативной области были обнаружены методом нозерн-блот анализа. Наибольшая интенсивность транскрипции отмечена для генов рРНК (Simpson et al., 1980). В отличие от многих эукариот, все известные митохондриальные геномы кинетопластид не содержит генов тРНК, их транскрипты также не были обнаружены в митохондриях. По всей видимости, тРНК транспортируются из цитозоля. Одной из интересных особенностей кинетопластид является уридиловое редактирование митохондриальных транскриптов. Было обнаружено, что последовательности многих генов очень сильно отличаются от последовательностей соответствующих мРНК. Пре-мРНК в митохондриях кинетопластид подвергается широкомасштабному редактированию, которое заключается во вставке и/или делеции U в определенных сайтах. За нацеливание редактирования на нужные сайты отвечают так называемые гидовыс РНК (гРНК), которые частично комплементарны пре-мРНК (Simpson et al., 2000). Гидовые РНК, как правило, являются продуктами миниколец, однако у L. tarcntolac и С. fasciculate гены гРНК были найдены в максикольцах, в том числе, на 5 - и З -концах дивергентной области (Blum et al., 1990; Feagin et al., 1992). Степень редактирования неодинакова для разных генов одного вида. К наименее редактируемым относятся гены рРНК, к наиболее редактируемым - ген 3-ей субъединицы цитохромоксидазы (СОШ). Дивергентая область, расположенная между З -концом гена ND5 и 5 -концом гена 12S рРНК, на сегодняшни день изучена значительно меньше, чем консервативная. Дивергентная область была впервые обнаружена по результатам рестрикциошюго картирования максиколец различных изолятов Т. brucci (Borst et al., 1980; Borst et al., 1981; Borst et al., 1982).
В данных работах был выявлен протяженный рестрикционный фрагмент, вариабельный по длине у разных изолятов. Максимальное различие составило 1,5 тпн при средней длине рестрикционного фрагмента 5 тпн. В дальнейшем данные рестрикционного картирования, Саузерн-гибридизации и секвенирования, полученные на С. oncopclti, С. lucHiae, Herpetomonas saimtelpessoai, L. gymnociactyU в нашей лаборатории, а также на Л. tarentolac и Т. Ьпіссі показали, что дивергентная область состоит почти полностью из повторов различной длины, которые не имеют гомологии с последовательностями консервативной области. При этом, по общему мнению, структура дивергентной области не имеет ничего общего у представителей разных родов кинетопластид (Munich et al., 1983; Maslov et al., 1984; Simpson et al., 1987). Размер дивергентной области сильно варьирует у разных видов трипаносоматид. Именно дивергентая область ответственна за различия в размере максикодец как между видами,, так и в пределах одногр вида (Maslov et al., 1984; Myier et al., 1993). Большинство данных говорят в пользу того, что дивергентная область не кодирует белков и РНК (за исключением случаев, описанных выше для гидовых РНК). Можно выделить несколько свойств этого участка: низкая транскрипционная активность; отсутствие протяженных открытых рамок- считывания (ОРС); высокое содержание быстро эволюционирующих повторяющихся поел едовател ьностей. Существуют указания на то, что ДО может содержать: промоторы и регуляторные участки, обеспечивающие транскрипцию; ори джин репликации; энхансерные участки. В ДО ряда видов найдены консервативные последовательности сайтов инициации репликации миниколец (CSB11I) (Горват и др., 1990; Myler ct al., 1993). У С. fasciculata экспериментально подтверждено присутствие сайта инициации репликации максикольца в ДО (Hajduk et al., 1984). Было также показано, что фрагменты ДО L. tarentolac (Hughes et al., 1984) и С. опсорсШ (Maslov et al., 1984; Gutter ct al., 1986) могут обладать ARS-активностью в клетках дрожжей. Однако оказалось, что и некоторые участки консервативной области проявляют ту же активность (Kim and Ray, 1985).
Как правило, для ДО характерно высокое содержание ЛТ-пар. Это позволяет провести параллель с АТ-богатой контрольной областью в митохондриальном геноме Drosophila melanogaster, содержащей ориджин репликации (Clary et al, 1985). Подобные протяженные контрольные области характерны для многих митохондриальных геномов. Они также содержат повторы и варьируют по длине у разных видов (Feagin et al.5 1992). Таким образом, ДО является интересным объектом для изучения как особенностей трипаносоматид, так и общих закономерностей регуляции работы генов в митохондриях. Следует отметить, что получение фрагментов ДО сопряжено с определенными техническими трудностями, которые вызваны наличием повторов. Известно, что богатые повторами контрольные области часто с трудом поддаются клонированию, амплификации и секвеннрованию (Mason and Bishop, 1980; Garesse, 1988; Okimoto et al., 1991; Lewis et al., 1994; Delarbre et al., 2001). Относительная сложность получения последовательностей ДО является причиной очень малого числа работ, посвященных ее исследованию, причем последняя работа датируется 1994 годом. Полная последовательность ДО установлена для Т. bmcci (Myler ct al., 1993) и С. oncopelti (Горват и др., 1990). Частичная последовательность известна для L. tarentolae (Muliich et al, 1985; Simpson et al., 1987), очень короткие участки - для L mcxicana amazoncmis (Lee et al., 1994). Интересен механизм репликации кпДНК. В течение S-фазы клеточного цикла миникольца высвобождаются из ассоциата, реплицируются, после чего дочерние кольца прикрепляются обратно. Высвобождение и прикрепление происходят благодаря топоизомеразе II. Показано, что в отсутствие топоизомеразы II нарушается репликация кинетопласта, и клетки в конце длинного GC-богатого повтора (тип А) длиной около 160-180 пн. Из них две первые копии сильно отличаются от остальных (al и 2), последняя копия (а15) сильно урезана с 5 -конца. В целом, 3 -конец данных повторов более консервативен. Между повторами класса А находятся относительно АТ-богатые спейсеры вариабельной длины, образованные короткими повторами класса В. Общим для повторов В мотивом является апс. Они условно разделены на 4 подкласса (В 1-4). Наиболее часто блоки повторов В имеют следующую организацию: (В2)П(ВЗ)ПВ4. Значительно более короткий сегмент II представлен тандемным кластером, состоящим из 17 полных и 7 неполных вырожденных копий АТ-богатого повтора типа II. 5 -конец сегмента III не содержит повторов, но его 3 -конец представлен двумя неидентичными копиями длинной последовательности (507-674 пн). Таким образом, в КО данного вида присутствуют разнообразные классы структурных элементов: 1) диспергированные повторы с вариабельными АТ-богатыми спейсерами; 2) тандемный кластер коротких повторов; 3) длинные тандемные суперкластеры. Сейчас известна последовательность нуклеотидов дивергентной области максикольцевой кпДНК для С. опсореШ (Горват и др., 1990), Т. bntcei (de Vries et al., 1988; Myler et al., 1993) и, частично, для L. tarentolae (Muhich et al., 1985; Simpson et al., 1987). Отдельные короткие участки известны для L. mexicana amazonensis (Lee et al., 1994). Для всех организмов показано высокое содержание АТ-пар.
Очистка ПЦР-продуктов
Для очистки ПЦР-продуктов применяли набор QIAquick PCR purification kit («QIAGEN») согласно стандартному протоколу производителя. Элюировали ДНК с помощью 30 мкл воды mQ. ЗЛО Электрофорез ДНК в агарозном геле Для идентификации молекул ДНК использовали электрофорез в 0,3-2% агарозном геле, для секвестрования - в 6% ПААГ (соотношение АА:МБА - 19:1). В обоих случаях в качестве цветного маркёра использовали бромфеноловый синий и ксиленцианол. Электрофорез в агарозном геле проводили в стандартном ТАЕ-буфере (40 мМ трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0). При секвенировании использовали стапдартый ТВЕ-буфер (89 мМ трис-борат, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА). Аналитический электрофорез ДНК в агарозном геле ДНК разделяли электрофорезом в 0,3-2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. Обычно использовали 0,3-0,5% гель для разделения фрагментов размером более 10 тпн; 0,7% - для фрагментов от 3 до 10 тпн; 1% - для 2-4 тпн; 1,5%-для 1-2 тпн; 2%-для фрагментов длиной менее 1 тпн. Проводили электрофорез по стандартной методике. Условия электрофореза: 1 В/см - 10 мин; 4,7-6 В/см - 40-120 мин. В ряде случаев проводили быстрое разделение в условиях: 9,3 В/см - 30-40 мин. В качестве маркера использовали 1 kb Ladder («Gibco» или «Fennentas»), а также ДНК фага ., разрезанную рестриктазой НіпбШ. В лунку вносили обычно 0,5 мкг маркера. Препаративный электрофорез ДНК в агарозном геле Для препаративного электрофореза использовали агарозу производства «Fisher», так как выделенная из нее ДНК хорошо амплифицируется. Перед работой тщательно промывали камеру для электрофореза и другие принадлежности. Условия разделения: 4,7 В/см -90-120 мин. После окрашсния геля бромидом этидия переносили его на трансиллюминатор UVT1 («Biokom»), чистым тонким скальпелем вырезали фрагменты геля. Очистку ДНК осуществляли с помощью набора QIAquick gel extraction kit («QIAGEN») по стандартному протоколу производителя. Элюировали ДНК с помощью 30 мкл воды mQ. Для клонирования и последующего секвенирования ПЦР-продуктов был использован Т-вектор pST-Blue («Novagen»). Штаммы Е. coii: XLlBlue (генотип: Д(тсгА)183, A(mcrCB-hsp SMR)173; end Al, mil, rec A, gyr A96, rcl Al, lac, X, [F, pro AB, lac FZAMIS, TnlO, (tetR)]) - для солевой трансформации; DH5a (генотип: ф80б lacZAMIS, rccAl, cndAl, girA96, tlii-1, lisdR17(rk", mk"), supE44, relAl, deoR, A(lacZYA-argF)U 169)- для трансформации методом электропорации.
Среды для выращивания E.coli: (1)Среда LB (Maniatis, 1989): Юг пептона, 5г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl на 1 литр среды (рН 6,7-7,0) (2)Твердая среда LB: тот же состав, с добавлением агара до конечной концентрации 1,5%. 3.11.2 Лигирование Клонирование в вектор pBluescript Для получения рестрикционных фрагментов ДО производили рестрикцию максикольца кпДНК и вектора pBluescript II 5К(или KS)+ различными рестриктазами. Инкубировали 1,5 ч при 37С. Затем осуществляли депротеинизацию хлороформом, осаждение ДНК этанолом с ацетатом калия. Проверяли электрофорезом концентрацию ДНК после рестрикции и переосаждения. Для лигирования использовалась ДНК-лигаза фага Т4 и лигазный буфер (состав 10х буфера: 66 мМ трис-ЇІСІ (рЫ 7,6), 6 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0,66 мМ ЛТР). Состав реакционной смеси: 7,5мкл рестрикциоиных фрагментов киЩ-lKLep. seymouri; 1 мкл 1 Ох лигазного буфера; 1мкл вектора pBlusScript (50 нг/мкл); 1 единица Т4 ДНК-лигазы; суммарный объем - 10 мкл. Цитирование проводили при 20дС в течение 3 ч или при 4С в течение 14 ч. Затем ииактивировали лигазу прогреванием в течение 10 мин при 65С. Трансформацию производили по стандартной методике (см, ниже), Клонирование в Т-вектор Полученные на ДО максикольца кпДНК ПЦР-продукты подвергались лнгированию с Т-вектором. Состав реакционной смеси; 7 иг плазмидной ДНК; 100-800 иг очищенного ПЦР-продукта; 2,5 единицы лигазы фага Т4; 1х лигазный буфер; вода mQ до объема 10 мкл. Лигирование проводили при 20С в течение 3 ч, затем инактивировали лигазу прогреванием в течение 10 мин при 65С. Трансформацию производили по стандартной методике (см. ниже). Клонирование в Т-вектор, конъюгированный с топоизомеразой I В данном методе встраивание в вектор (PCR-2.1OPO, «Invitrogen») происходит не за счет лигазы, а с помощью конъюгированной с вектором топоизомеразы I. Мы пользовались стандартным протоколом производителя («Invitrogen»), трансформацию производили по стандартной методике (см. ниже). Приготовление компетентных: клеток 0,5 мл ночной культуры, выращенной в среде LB, переносили в 5 мл LB и растили при 37С до оптической плотности Дюо = 0,8 (до стадии логарифмического роста). Клетки переносили в пробирки типа «Eppendorf» и осаждали на микроцентрифуге при 15000g 5-10 с, супернатант удаляли. К осадку добавляли 0,7 мл ОД М MgCh- Клетки ресуспендировали и осаждали центрифугированием в тех же условиях, супернатант удаляли. Осадок ресуспендировали, добавляя 0,1 мл ОД М МпСЬ и ОД мл ОД М СаСЬ- Трансформация Очищенную лигированную смесь охлаждали на льду и добавляли к 200 мкл компетеїггньїх клеток, инкубировали на льду 30 мин. Далее прогревали в водяном термостате 1,5 мин при 42С (тепловой шок) и вновь помещали на лед на 5 мин. К осадку клеток добавляли 1 мл среды LB и инкубировали при 37С 40-60 мин на качалке для начала экспрессии гена устойчивости к ампициллину. Клетки осаждали центрифугированием и переносили на селективную среду (твердую LB со 100 мкл ампициллина).
Для селекции полученных колоний использовали бело-голубую селекцию (на поверхность среды наносили 25 мкл IPTG (20 мг/мл) и 25 мкл X-Gal (20 мг/мл). 3.11.4 Выделение плазмндной ДНК Колонии, содержащие плазмиду, пересевали в 5 мл среды LB с ампициллином и растили в течение ночи. Методика выделения ДНК: 1. Клетки осаждали центрифугированием 1 мин. на микроцентрифуге. 2, Осадок суспендировали в 150 мкл ТЕ (10 мМ трис-НСТ (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА). Затем добавляли 300 мкл лизирующего раствора (0,2 и NaOH, \% SDS). Перемешивали переворачиванием пробирки до полного просветления, помещали на лед на 5 мин. 3. После этого добавляли 200 мкл ацетата калия (3 М по К+, 5 М по ацетату, рН 4,8). Осторожно встряхивали и помещали на лед на 5 мин. 4. Смесь центрифугировали 8 мин. Супернатант переносили в новую пробирку. 5. Для депротеинизации добавляли равный объем смеси фенол-хлороформ и перемешивали встряхиванием. После 3 мин центрифугирования переносили водную фазу в новую пробирку. 6. Добавляли 2 объема этанола (96%), перемешивали встряхиванием. Смесь центрифугировали 10 мин, после чего аккуратно сливали супернатант. 7. Промывали осадок 80% этанолом (100 мкл), центрифугировали, после чего удаляли супернатант, высушивали осадок до полного исчезновения остатков этанола, растворяли в 30 мкл воды или ТЕ. 8. Добавляли РНКазу до конечной концентрации 20 мкг/мл (при приготовлении раствора РНКазы необходимо освободить фермент от примеси ДНКаз; для этого инкубировали раствор на кипящей бане в течение 5 мин). Инкубировали 30 мин при комнатной температуре. 9. Переосаждали полученный раствор этанолом с ацетатом калия и растворяли осадок в 30 мкл воды или ТЕ. 3.11.5 ПЦР с клонов Наконечником пипетки отбирали кусочек колонии, суспендировали его в 5 мкл mQ. В состав реакционной смеси входили следующие компоненты: 1х ПЦР-буфер («Fermentas»), содержащий 1,5 мМ MgC ; праймеры (по 0,33 мкМ); dNTP (по 200 мкМ); матрица - 5 мкл суспензии клеток; 1 единица 7ш7-полимеразы Сг- Серпухов); вода mQ до общего объема 15 мкл; 20 мкл минерального масла («ICN»). Все реакции проводили в тонкостенных ПЦР-пробнрках на амплификаторе «Тсрцпк МС2» («ДНК-Технология»). Типичная программа амплификации (25 циклов): 1 цикл 94С 5 мин 25 циклов 94С 30 с 42С 40 с 72С 1-4 мин 10С хранение 3.11.6 Рестрикция плазмиды для проверки наличия встройки Для вырезания фрагмента из плазмиды проводили рестрикцию, используя рестриктазы в соответствующих буферах фирмы производителя. Реакцию проводили 1,5-2 часа при 37С.
Сравнительный анализ CSB-блоков в дивергентной области максикольцевой и в консервативной области миникольцевой кпДНК
Для того чтобы проверить, не является ли такой результат следствием работы на негомогенной культуре, мы получили 24 клона Lep. seymouri и осуществили ПЦР с праймерами LsMBF2 и 12SR6 на ДНК этих клонов. Набор полученных продуктов одинаков для всех клонов. Пример электрофореграммы показан на Рис. 28. Таким образом, совокупность этих результатов позволяет предположить возможность присутствия в ассоциате кпДНК Lep. seymouri нескольких вариантов максиколец, отличающихся по последовательности ДО, причём в одной митохондрии. Для окончательного решения этого вопроса следует провести дополнительные исследования и получить более строгие доказательства. В итоге, мы можем перечислить следующие характерные особенности ДО максикольцевой кпДНК Lep. seymouri: Во-первых, в ДО обнаружены три типа повторов: 1) Тип 1 - АТ-богатые повторы, составляющие из большого количества тандемных повторов (Т)ТТТАА; 2) Тип 2 - GC-богатые повторы размером примерно 200 п.н.; 3) Тип 3 - длинные GC-богатые повторы размером примерно 300-600 п.н. таким оброзом, все вышеперечисленные типы повторов организованы в суиеркластеры состава повторЗ+(повтор1+повтор2)п. Суперкластеры расположены, как правило, тандемно, Во-вторых обнаружены элементы, возможно несущие функциональную нагрузку; 1) В ДО были найдены консенсусные промоторные последовательности А5СТТ, ранее идентифицированные в КО, и несколько отличающийся мотив АААААСАТ на 3 -конце повторов типа 2 и 3. Почти все предполагаемые промоторы направлены в сторону гена 12S рРНК. Более того, в составе длинных повторов типа 3 присутствует длинный изогнутый участок, рядом с которым наедятся два щюмоторных элемента, направленных в разные стороны. Возможно, эта структура играет роль в транскрипции максикольцеваи молекулы; 2) В центре ДО найдены консервативные блоки CSBI и CSBIII, которые являются оп репликации миникольцевой и, возможно, максикольцсвой кпДНК; 3) В районе ДО, прилежащем к гену ND5, обнаружен фрагмент, гомологичный последовательности гена гидовой РНК gG4-IV L. larentalac. В-третьих, впервые показана гетерогенность первичной структуры ДО максикольцевой кпДНК у Lep. seymouri. 4.3.2 Клонирование и секвенирование рестрикционных фрагменнтов и ПЦР-продуктов ДО максикольцевой кпДНК Lcptomonas coUosoma На основании рестрикционной карты максикольцевой кпДНК Lep. coUosoma известно, что в ДО разнообразие рестрикционных сайтов невелико (Рис. 18). Нами были найдены сайты только двух рестриктаз (Spel, Bell). Сайты Spel находятся исключительно в ДО, сайты Bell находятся, кроме того, и в КО.
Для определения нуклеотидной последовательности участков ДО макснколыдсвой кпДНК Lep. collosoma мы проводили клонирование рестрикционных фрагментов по сайтам Spel-Spel, Bell-Bell, Spel-Bcll в вектор pBluescriptll SK+ и ГЩР-продуктов CSBII1R-12SR6 и Lca20Fi-Lca20Fi в Т-вектор (Рис. 18). Б итоге получили большое количество различных рекомбинантных плазмид. После секвенирования встроек этих плазмид мы синтезировали праймеры на основании полученных последовательностей и осуществляли ПЦР для выделения новых участков ДО. Получены следующие рекомбинантные плазм иды, содержащие участки ДО: 1) Clone-Lcl, ПЦР-продукт 12SR6-CSBIIIR в Т-векторе; 2) CIone-Lc2, 682 пи, по сайтам Spel-Spel; 3) Clone-Lc3, 331 пн, по сайтам Spel-Spel; 4) Clone-Lc4, ПЦР-продукт Lca20Fi-Lca20Fi в Т-векторе; 5) Clone-Lc5, 1,2 тпн, по сайтам Spel-Spcl; 6) Clone-Lc6, 1,7 тпн, по сайтам Spel-Spel; 7) Clone-Lc7, 2,5 тпн, по сайтам Spel-Bcll; 8) C]one-Lc8s 1,3 тан, по сайтам Spel-Bcll (Рис. 18, 29). Длина дивергентной области Lep. collosoma составляет 11 тпн. В её последовательности обнаружено два типа повторов - А-20 и В-6. Они образуют тандемные кластеры. Между повторами отсутствует АТ-богатые спэйссры, столь характерные для Lep. scymouri. (Рис.29) Длина дивергентной области Lep. collosoma составляет примерно 11 тпн. В её пеовичной СТОУКТУОЄ обнаоужено два типа относительно GC- богатых повторов, названные А20 и В6. В каждом повторе А20 присутствует коиоткий повтоо (АТТАТК Повтоюы типа В6 поедставлены инвеотиБованными копиями. Последовательности нуклеотидов рестрикционных сайтов Spcl (ACTAGT) и Bell (TGATCA), характерные для ДО данного вида, также представляют собой инвертированные повторы. Повторы А20 и В6 образуют кластеры. Однако между повторами отсутствуют протяженные АТ-богатые спейсеры (Рис. 29). Как и в ДО максикольца Lep. seymouri, в ДО Lep. collosoma также обнаружены CSB-блоки (CSBI, II, III), которые идентичны аналогичным блокам консервативной области миниколец различных видов трипаносоматид и, вероятно, выполняют функцию огі репликации. Кроме того, обнаружены последовательности промоторов Lep. seymouri A5CNN, участки изогнутой ДНК. ДО Lep. collosoma имеет сходную структурную организацию с ДО С. опсорсШ, хотя их последовательности нуклеотидов не имеют гомологии. Иначе говоря, в ДО максикольца С. опсореШ и Lep. collosoma содержатся тандемные GC-богатые повторы без АТ-богатых спенсеров и инвертированные повторы. 4.4 Сравнительный анализ CSB-блоков в дивергентной области максикольцевой и в консервативной области миникольцевой кпДНК. В ДО максикольцевой кпДНК L. tarentolae, С. oncopelti и Т. bnicei давно были обнаружены CSBI- и С5ВШ-подобныепоследовательности, которые идентичны CSB-блокам консервативной области миникольцевой кпДНК. Было высказано предположение о том, что CSB-элемснты участвуют в инициации репликации как максикольцевой, так и миникольцевой кпДНК. Поэтому нам представляется важным обнаружение мотивов CSBI, II, III в ДО максикольцевой кпДНК Lep. collosoma и Lep. seymouri (приложение.6,2). Известно, что CSBI (GGGCGT) - последовательность, связанная с точкой начала репликации отстающей цепи; CSBIII (GGGGTTGGTGTA) -последовательность, связанная с точкой начала репликации лидирующей цепи. В ДО максикольцевой Lep. seymouri присутствуют три CSBIII-мотива и четыре CSBI-мотива, сгрушшрованных в одном регионе ДО (см. выше). Но расположение этих мотивов не имеет ничего общего с таковым в консервативной области миниколец. Однако расположение этих 3-х блоков в ДО Lep. collosoma идентично миникольцевой кпДНК. На основании результатов данной работы можно предположить, что в организации ДО максикольцевой кпДНК у трипаносоматид имеется определённая закономерность: организация первичной структуры ДО консервативна у близкородственных видов, хотя последовательности пуклеотидов ДО у исследованных видов не имеют гомологии. То есть организация ДО у Lep. scymouri сходиа с таковой у представителей рода Leishmania, а ДО Lep. collosoma сходна с ДО С. oncopclli, что коррелирует с положением этих видов на филогенетическом дереве (Рис. 1).
