Содержание к диссертации
ВБВДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
Глава I. УЧАСТКИ НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ ДНК ЭУКАРИОТ 8
1.1. Особенности репликации хромосом эукариот 8
1.2. Репликация экстра хромосомных ДНК II
1.3. Репликация ДНК у дрожжей-сахаромицетов 20
1.4. Роль репликаторных участков эукариот в процессах, связанных с дестабилизацией генома клетки 38
1.5. Заключение и постановка задачи исследования 42
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44
2.1. Материалы 44
2.2. Методы 46
Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ 63
3.1. Исследование области начала репликации мито хондриальной ДНК печени крысы 63
3.2, Исследование репликатора, локализованного в
повторе генов рРНК дрожжей-сахаромицетов.. 81
Глава ІУ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 93
4.1, Сравнительная характеристика нуклеотидной последовательности области начала репликации мтДНК 93
4.2. Природа гетерогенности Е-тяжа з
4.3. Автономно реплицирующаяся последовательность локализована в пределах НТО 2 основного повтора рДНК дрожжей 95
4.4. Сравнение репликонов мтДНК и рДНК и возможный механизм амплификации генов рРНК у дрожжей 96
4.5. МтДНК и рДНК в качестве векторов 99
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Введение к работе
С момента установления пространственной структуры ДНК внимание исследователей было направлено на расшифровку механизмов, обеспечивающих точную редупликацию генетического материала в клетке /і/. Основные сведения об, факторах и стадиях репликации ДНК были получены на прокариотических. системах. Трудности в изучении процесса репликации ДНК в эукариотической клетке определяются гораздо более сложной организацией хромосом эукариот, недоступностью в использовании простых биохимических и генетических методов исследования репликации ДНК для большинства эукариотических организмов.
Развитие методов молекулярного клонирования и расшифровки первичной структуры нуклеиновых, кислот /2/ в последнее время значительно расширило наши знания об организации и механизмах функционирования генетического аппарата клетки. Важным следствием прогресса в структурных, исследованиях нуклеиновых кислот явилась возможность изучения регуляторных элементов ДНК. и среди них - последовательностей, функционально важных для репликации.
Перспективными модельными системами для исследования структурных компонентов аппарата репликации являются просто организованные автономно реплицирующиеся экстрахромосомные ДНК эукариот, имеющие вирусное, органелльное или плазмидное происхождение. Изучение этих репликонов имеет важное значение для создания генно-инженерных.систем трансформации клеток высших.
В результате исследований, выполненных на различных объектах, в составе экстрахромосомных генетических элементов был выявлен специфический участок ДНК, необходимый для эффективной инициации синтеза ДЖ- участок начала репликации или "репликатор". Знание первичной структуры этих важных участков ДІЖ,очевидно, должно способствовать пониманию молекулярных механизмов процессов инициации и регуляции синтеза ДНК.
Митохондриальная ДНК (мтДНК) млекопитающих - высших эукариот, и рибосомная ДНК, (рДНК) низших эукариот - дрожжей-сахаромицетов, представляют собой пример репликонов с хорошо известной физической и генетической структурой. Ряд особенностей репликации мтДНК делает, этот объект исключительно удобным для тонкого картирования мест инициации синтеза ДНК с помощью методов определения первичной структуры нуклеиновых кислот.
Гены рРНК пекарских дрожжей Saccharomycea cerevisiae на протяжении ряда лет являлись предметом исследования в лаборатории функциональной энзимологии Института молекулярной биологии AR СССР, благодаря чему в настоящее время установлена полная первичная структура повтора рДНК, определены места инициации и терминации транскрипции предшественников рРНК.
Результаты этих исследований в сочетании с новыми методами молекулярного клонирования на дрожжах-сахаромицетах послужили основой для настоящей работы по картированию репликатора рДНК.
Целью настоящей работы явилось картирование и исследование с/труктурной организации участков начала репликации мтДНК крысы и рДНК дрожжей, а также анализ особенностей функционирования этих репликаторов В клетках Saccharomycea cereviaiae.
Мы сконструировали серию гибридных плазмид, несущих фрагменты мтДНК и рДНК. Для фрагмента мтДНК, содержащего область начала репликации, установлена первичная структура,, осуществлена точная, локализация точек инициации синтеза ДНК in vivo.
С использованием системы трансформации дрожжей установлена локализация репликатора в пределах известной нуклеотиддой последовательности нетранскрибируемого спейсера повтора рДНК s.cerevisiae Проведено сравнение свойств репликатора рДНК с другими
известными репликаторными последовательностями ДНК дрожжей.
Сравнение структурной организации и механизмов репликации мтДНК и рДЩ позволило высказать некоторые предположения о функции участка области начала репликации, а также о механизмах амплификации генов рРНК в составе хромосом дрожжей.
Сконструированные в процессе выполнения данной работы плазмиды могут использоваться в качестве векторных молекул ДНК для специфического включения чужеродных последовательностей в состав хромосомного повтора рЦНК, дрожжей. Нам кажется, что принцип создания векторов на основе рДНК может иметь и более широкое значение при разработке систем переноса генетической информации в клетки других микроорганизмов, в том числе промышленных видов дрожжей.
