Введение к работе
Актуальность темы. К настоящему времени известно, что метилирование ДНК, катализируемое ДНК-метилтрансферазами, осуществляется в первые минуты после репликации, т.е. пострепликативно. Это эпигенетическое событие, т.к. нуклеотидная последовательность ДНК при этом не меняется (Baylin S.B., et al., 1998). И хотя метилирование азотистых оснований является стабильной и наследуемой модификацией, оно обратимо под воздействием деметилирующих агентов или ферментов и, тем самым, принципиально отличается от мутаций ДНК. В общебиологическом плане феномен метилирования ДНК является элементом системы распознавания «свой-чужой». Существует класс белков, которые специфическим образом связываются с метилированными участками ДНК, делая их недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, по-видимому, и для полимераз (Sarraf S.A. et al., 2004; Gebhard C. et al., 2010). Получено много прямых экспериментальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации эукариотических промоторов, а, следовательно, и в регуляции активности генов (Wang G. et al., 2003; Pulukuri S.M. and Rao J.S., 2006).
Общей чертой генома человека является то, что in vivo значительная доля цитозиновых остатков ДНК метилирована, т.е. находится в форме 5-метилдезоксицитидина, который зачастую входит в CpG-«островки». CpG-«островки» локализованы преимущественно в 5'-участках структурных генов: в регуляторных последовательностях, промоторах, последовательностях первого экзона (Baylin, et al., 1998; Turker, et al., 1999). В неметилированном состоянии CpG-«островки» поддерживаются в клетках зародышевой линии и нормальных соматических клетках тканей. Исключение составляют CpG-«островки» в генах, подвергнутых импринтингу, в генах инактивированных X-хромосом, а также в повторяющихся элементах генома LINE и SINE (например, Alu), где они значительно метилированы (Li E. et al., 1993).
Одним из наиболее ранних проявлений трансформации, часто еще до появления сформированной опухоли, является снижение числа модифицированных оснований ДНК (Pogribny I.P. et al., 1995). Причины деметилирования генома и конкретные механизмы, обусловливающие его канцерогенный эффект, до сих пор остаются невыясненными. Однако ясно, что тотальное деметилирование может кардинально повлиять на структуру хроматина, степень его конденсации, расписание репликации (Bhattacharya, S.K. et al., 1999).
Регенерация печени после частичной гепатэктомии является хорошо разработанной моделью in vivo для изучения пролиферации клеток, включая репликацию и последующие процессы вплоть до регенерации органа (Панин Л.Е., Маянская Н.Н., 1987; Michalopoulos G.K. and DeFrances M.C., 1997; W. de Graaf et al., 2008). В настоящее время внимание подавляющего большинства исследователей обращено на механизмы регуляции транскрипции, обусловленные статусом метилирования генома, а его влияние на репликацию ДНК остается в тени.
В Институте биохимии СО РАМН ранее было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации, в котором принципиальную роль играли стероидные гормоны и липопротеины высокой плотности 3 подкласса (ЛПВП3) (Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Поляков Л.М., Харьковский А.В., 1994; 1999). Показано, что функцию переносчика стероидных гормонов в ядра клеток в данном механизме выполняет аполипопротеин A-I (АпоA-I) (Панин Л.Е. и др., 1992). Образование биологически активного комплекса стероидный гормон-АпоA-I протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где он взаимодействует с ДНК с последующим усилением экспрессии генов и/или репликации ДНК. Молекулярные механизмы данных явлений во многом еще не раскрыты. К ним следует отнести механизмы регуляции копирования ДНК и роль метилирования азотистых оснований в расписании репликации с участием комплексов стероидный гормон-АпоA-I. Особенности гормональной индукции процессов репликации, пролиферации важны для понимания физиологической регенерации тканей и особенно актуальны для понимания возможности ингибирования роста опухолей.
В связи с этим в данной работе мы исследовали влияние комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I на процесс копирования ДНК крысы и человека и особенности копирования ДНК в регенерирующей печени крыс Вистар в разные интервалы времени после частичной гепатэктомии.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлось изучение молекулярных механизмов действия комплексов стероидный гормон (тетрагидрокортизол, кортизол, андростерон)-аполипопротеин A-I на процесс копирования ДНК крысы и человека в зависимости от статуса метилирования.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Выделить белковый экстракт из ядер клеток печени крыс с активными полимеразами.
2. Исследовать влияние комплексов стероидный гормон-АпоA-I на копирование ДНК in vitro.
3. Оценить влияние метилирования ДНК крысы и человека на взаимодействие с комплексом стероидный гормон-АпоА-I.
4. Изучить влияние метилирования олигонуклетидных дуплексов 5`-A3CC(GCC)35`-GG(CGG)3T3 на взаимодействие с комплексами стероидный гормон-АпоА-I.
5. Изучить копирование ДНК с участием комплексов стероидный гормон-АпоA-I (стероидный гормон – ТГК или кортизол) в зависимости от статуса метилирования на модели гепатэктомированных крыс.
Научная новизна работы
Впервые показана способность комплексов стероид-АпоА-I (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон, андростерон) in vitro выполнять роль, подобную роли факторов, изменяющих структуру ДНК в процессах репликации. Комплексы стероид-АпоА-I (тетрагидрокортизол, андростерон) регулируют реакцию копирования ДНК крысы и человека, катализируемую как фрагментом Кленова из E. coli, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы.
Впервые показана зависимость реакции копирования ДНК крысы от статуса ее метилирования. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в регенерирующей печени крыс. В клетках регенерирующей печени крыс через 1,5 суток после гепатэктомии ДНК копировалась так же, как и в контроле, т.е. до гепатэктомии. В обоих случаях происходила активация копирования под влиянием комплекса тетрагидрокортизол (ТГК)-АпоА-I, но не кортизол-АпоА-I. Через 3 суток после частичной резекции печени реакция копирования ДНК ингибировалась.
Определено, что модельный сайт связывания комплексов АпоА-I-стероид - олигонуклеотидный дуплекс 5`-A3CC(GCC)35`-GG(CGG)3T3 длиной 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4HI имеет длину, критическую для действия этого фермента и ДНК-метилтрансферазы М.Fsp4HI. Показано, что комплекс АпоА-I-ТГК защищает олигонуклеотидный дуплекс 5`-A3CC(GCC)35`-GG(CGG)3T3 независимо от степени его метилирования от действия ферментов ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» неметилированного дуплекса в отсутствие этих ферментов.
Теоретическая и практическая значимость работы
Данные, представленные в нашей работе, вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов репликации ДНК и пролиферации клеток с участием метаболитов стероидных гормонов и аполипопротеина А-I. Доказанное влияние статуса метилирования ДНК на ее копирование является новым вкладом в представления о механизмах и расписании репликации.
Определение критической длины сайта связывания ДНК с комплексом стероидный гормон-аполипопротеин А-I – модельным олигонуклеотидом, для его взаимодействия с ферментами рестрикции и особенности их взаимодействия дополняют современные представления о структурно-функциональной организации генома эукариот.
Полученные данные раскрывают новые особенности механизмов репликации, их роли в пролиферации клеток, в том числе, в опухолях, в которых обнаружено изменение статуса метилирования ДНК. Эти результаты могут быть использованы при обосновании новых методов коррекции и лечения как пролиферативных, так и дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Процесс копирования ДНК крысы зависит от статуса ее метилирования.
2. Копирование изолированной ДНК in vitro с измененной под влиянием комплекса АпоА-I-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) вторичной структурой катализируется как фрагментом Кленова, так и ДНК-полимеразами из белкового экстракта ядер клеток крысы. Комплекс АпоА-I-стероид (тетрагидрокортизол, андростерон) способен регулировать процесс копирования, активируя его на 22-27 % или полностью подавляя копирование ДНК в зависимости от его концентрации.
3. Комплекс АпоА-I-ТГК защищает олигонуклеотидный дуплекс 5`-A3CC(GCC)35`-GG(CGG)3T3 независимо от степени его метилирования от действия ДНКазы I и рестриктазы Fsp4HI, способствуя в то же время «расплетению» дуплекса в отсутствие этих ферментов. Длина 14 пар нуклеотидов с двумя сайтами рестрикции для рестриктазы Fsp4HI является критической для действия этого фермента и ДНК-метилтрансферазы М.Fsp4HI.
4. Деметилированная ДНК менее способна к репликации в регенерирующей печени крыс.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, из них 4 статьи – в журналах, рекомендованных ВАК. Работы были представлены на VI Конгрессе «Наука о человеке» в Томске в 2005 г., на конференции студентов и молодых ученых «Авиценна» (Новосибирск, 2007 г.), на конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (Новосибирск, 2009), доложены на ученом совете НИИ биохимии СО РАМН.
Структура и объем работы: диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, включая 3 таблицы и 44 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературных источников содержит 185 ссылок, включая 30 отечественных.
