Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1.1. Тубулярные иммуностимулирующие комплексы 11
1.1.1. Прототипы тубулярных иммуностимулирующих комплексов - ISCOM и ISCOMATRIX 11
1.1.2. Общая характеристика тубулярного иммуностимулирующего комплекса 13
1.2. Физико-химические и биологические свойства полярных липидов морских макрофитов 18
1.2.1. Физико-химические свойства гликолипидов морских макрофитов 18
1.2.2. Иммунологические свойства полиненасыщенных жирных кислот 21
1.3. Биологические свойства тритерпеновых гликозидов 26
1.3.2. Биологическая активность тритерпеновых гликозидов голотурий 27
1.3.2. Тритерпеновые гликозиды дальневосточной голотурии Cucumaria japonica 31
1.4. Липид-белковые взаимодействия, конформация белков и ее связь с
иммуногенностью 34
2. Материалы и методы 45
2.1. Биологические объекты 45
2.2. Экстракция липидов 46
2.3. Тонкослойная хроматография 46
2.4. Системы растворителей для ТСХ липидов и кукумариозидов 46
2.5. Обнаружение липидов и кукумариозидов 47
2.6. Выделение гликолипидов 47
2.7. Выделение фосфатидилхолина 48
2.8. Выделение фосфатидилэтаноламина з
2.9. Анализ состава жирных кислот глико- и фосфолипидов 49
2.10. Определение микровязкости моногалактозилдиацилглицерина 50
2.11. Выделение кукумариозидов 50
2.12. ЯМР-спектроскопия 53
2.13. Получение тубулярных иммуностимулирующих комплексов 53
2.14. Введение антигенов в тубулярный иммуностимулирующий комплекс 54
2.15. Электронная микроскопия 55
2.16. Иммунизация животных 56
2.17. Получение сывороток крови 57
2.18. Анализ сывороток крови иммунизированных животных 57
2.19. Приготовление образцов для калориметрических и спектроскопических исследований 58
2.20. Дифференциальная сканирующая калориметрия 59
2.21. Флуоресцентная спектроскопия 60
2.22. Круговой дихроизм 60
3. Результаты и обсуждение 61
3.1. Физико-химические свойства моногалактозилдиацил-глицерина из морских макрофитов, используемого для приготовления тубулярных иммуностимулирующих комплексов 62
3.1.1. Жирнокислотный состав моногалактозилдиацилглицерина из морских макрофитов 62
3.1.2. Микровязкость моногалактозилдиацилглицерина из морских макрофитов 64
3.2. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных видов морских макрофитов на иммуногенность и конформацию порина в составе тубулярных иммуностимулирующих комплексов 65
3.2.1. Выбор антигенной формы порина 65
3.2.2. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из морских макрофитов на образование антипориновых антител 67
3.2.3 Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных морских макрофитов на цитокиновый профиль 69
3.2.4. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных видов морских макрофитов на конформацию порина 71
3.2.4.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия 71
3.2.4. 2. Собственная флуоресценция порина 75
3.2.4.3. Круговой дихроизм 78
3.3. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных видов морских макрофитов на иммуногенность и конформацию гемагглютинина в составе тубулярных иммуностимулирующих комплексов 80
3.3.1. Характеристика рекомбинантного мономера гемагглютинина вируса тршша A/Rim (A/Califomia/07/2009) 81
3.3.2. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных морских макрофитов на образование антител против гемагглютинина 83
3.3.3. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных морских макрофитов на цитокиновый профиль 84
3.3.4. Влияние моногалактозилдиацилглицерина из различных морских макрофитов на конформацию гемагглютинина
3.3.4.1. Дифференциальная сканирующая калориметрия 86
3.3.4.2. Собственная флуоресценция гемагглютинина 88
3.3.4.3. Круговой дихроизм 91
3.4. Жирнокислотный состав, комплексообразующие свойства фосфолипидов из иглокожих и их влияние на иммуногенность человеческого сывороточного альбумина в составе ТИ-комплексов 93
3.4.1. Жирнокислотный состав фосфолипидов из иглокожих 93
3.4.2. Комплексообразующие свойства фосфолипидов из иглокожих 95
3.4.3. Влияние фосфолипидов из иглокожих на образование антител против человеческого сывороточного альбумина 96
3.4.4. Влияние фосфолипидов из морских иглокожих на цитокиновый профиль 98
3.5. Структура, комплексообразующие свойства кукумариозидов и их влияние на
иммуногенность белковых антигенов ТИ-комплексов 100
3.5.1. Характеристика структуры кукумариозидов из Cucumaria japonica 100
3.5.2. Комплексообразующие свойства кукумариозидов Cucumaria japonica. 101
3.5.3. Влияние различных кукумариозидов на иммуногенность и конформацию порина 1 3.5.3.1. Влияние кукумариозидов на иммуногенность порина 104
3.5.3.2. Влияние различных кукумариозидов на конформацию порина 108
3.5.4. Влияние различных кукумариозидов на иммуногенность человеческого
сывороточного альбумина 110
3.5.4.1. Влияние различных кукумариозидов на образование антител против человеческого сывороточного альбумина 110
3.5.4.2. Влияние различных кукумариозидов на цитокиновый профиль 112
Выводы 115
Список литературы
- Общая характеристика тубулярного иммуностимулирующего комплекса
- Системы растворителей для ТСХ липидов и кукумариозидов
- Микровязкость моногалактозилдиацилглицерина из морских макрофитов
- Влияние моногалактозилдиацилглицерина из различных морских макрофитов на конформацию гемагглютинина
Общая характеристика тубулярного иммуностимулирующего комплекса
Как известно, ISCOM представляет собой гибкую конструкцию, в которой возможна замена основных структурообразующих компонентов на аналогичные соединения (Санина, Попов, 2004). Для модификации ISCOM было предложено использовать принципиально новые биологически активные и хорошо охарактеризованные компоненты - гликоглицеролипиды и сапонины из морских гидробионтов (Lee et al., 2004; Костецкий и др., 2007; Попов и др., 2008; Санина и др., 2008; Kostetsky et al., 2011).
На первом этапе модификации ISCOM вместо иммунологически инертных фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) были использованы гликолипиды из морских макрофитов, обладающие широким спектром биологических активностей (Sanina et al, 2004). Кроме того, гликолипиды из морских макрофитов обогащены полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), которые могут проявлять самостоятельную биологическую активность, являясь предшественниками для синтеза различных оксилипинов (Tilley et al. 2001; Calder, 2009, 2014).
Однако среди трех использованных для модификации гликоглицеролипидов из морского макрофита Laminaria japonica (МГДГ, дигалактозилдиацилглицерин (ДГДГ), сульфохиновозилдиацилглицерин (СХДГ)) только МГДГ проявил ISCOM-формирующую способность (Lee et al., 2004). Частицы полученного комплекса имели классическую везикулярную морфологию, характерную для ISCOM, но были примерно вдвое меньше, чем ФХ-содержащие ISCOM. Следует отметить, что МГДГ из морских макрофитов, обогащенный ПНЖК, самоорганизовывается в гексагональную инвертированную суперструктуру Нц. В то время как СХДГ формирует ламеллярную, а ДГДГ - изотропную суперструктуры (Sanina et al., 2008). Следовательно, особенность суперструктуры, а также сравнительно малый гидрофильно-липофильный баланс липида определяют его способность к образованию ISCOM-подобных структур (Lee et al., 2004). Важно также отметить, что температура фазового перехода МГДГ из L. japonica была значительно ниже по сравнению с таковыми ДГДГ и особенно СХДГ. Это в свою очередь коррелировало с индексом ненасыщенности (ИН) исследованных гликолипидов (Sanina et al., 2008). В живых системах замена бислойного фосфолипида на чужеродный небислойный гликолипид сопровождается улучшением некоторых функциональных свойств как мембраносвязанных белков, так и клетки в целом (Wikstrom et al., 2004).
Исследование иммуностимулирующей активности ФХ-ISCOM и МГДГ-ISCOM в отношении OmpF-подобного порина из человеческого патогена Y. pseudotuberculosis (YOmpF) показало низкую адъювантную активность обоих вариантов комплекса (Lee et al., 2004).
Но главную адъювантную функцию в ISCOM выполняет Quil А. Поэтому на следующей стадии модификации был использован структурный аналог сапонинов Quil А - тритерпеновый гликозид из голотурии С. japonica кукумариозид Аг-2, обладающий высокой адъювантной и другими видами биологической активности (Aminin et al., 2006, 2011; Menchinskaya et al., 2013).
Супернизкие дозы КД действуют как на клеточный, так и на гуморальный иммунный ответ (Санина, Попов, 2004). Аналогично Quil А тритерпеновые гликозиды голотурий способны образовывать гликозид-стериновые комплексы с высоким аффинитетом к холестерину (Попов, 2003). В результате они становятся менее токсичными, чем в свободном виде (Ли и др., 2008). Способность того или иного сапонина образовывать межмолекулярные комплексы с холестерином является необходимым условием для формирования на его основе надмолекулярных липид-сапониновых комплексов (Kersten, Crommelin, 1995).
Замена в составе ISCOM не только фосфолипидов на МГДГ, но и Quil А на кукумариозид Аг-2 привела к образованию нового носителя для субъединичных антигенов - ТИ-комплекса, который принципиально отличается от прототипа как по составу, так и по морфологии. Причем использование МГДГ из разных видов морских макрофитов не влияло на формирование ТИ-комплекса. Первоначально было предложено весовое соотношение 3:2:6 между компонентами комплекса - кукумариозидом, холестерином и МГДГ (Санина и др., 2008). ТИ-комплексы представляли собой трубчатые частицы с наружным диаметром около 13 нм, внутренним диаметром около 4 нм и длиной порядка 300 нм (Мазейка и др., 2013). Использование нового метода получения ТИ-комплекса (Мазейка и др., 2008), основанного на методе гидратации липидных пленок (Copland et al., 2000), позволило получать гомогенные тубулярные частицы, что важно для воспроизводимости результатов иммунизации. Было установлено, что оптимальным для формирования гомогенного препарата ТИ-комплекса является весовое соотношение между КД Аг-2, холестерином и МГДГ 6:2:4, при котором исключается возможность формирования иных частиц, кроме ТИ-комплексов (рис. 1).
Частицы ТИ-комплекса сходны по морфологии с описанными ранее комплексами гликоалкалоидов растений семейства пасленовых (Keukens et al., 1995), что позволяет предполагать сходство строения обоих типов частиц. Использование позитивного окрашивания частиц кислым гидрозолем железа, который электростатически взаимодействует с сульфатными группами углеводных цепей, позволяет визуализировать гликозиды в виде электронно-плотного вещества на электронных микрофотографиях. Частицы ТИ-комплекса были окрашены гидрозолем железа снаружи, тогда как внутренний канал практически не окрашивался. Это позволяет утверждать, что углеводные цепи молекул кукумариозидов экспонированы преимущественно на внешней стороне трубчатых частиц. Такое расположение молекул сапонинов хорошо согласуется с предложенной моделью строения надмолекулярных комплексов гликоалкалоидов растений семейства пасленовых (рис. 2) и позволяет полагать, что данная модель в общих чертах справедлива и для ТИ-комплекса (Мазейка и др., 2013).
Рис. 2. Модель строения тубулярной наночастицы. 1 - внутренний канал; 2 -слой мембранных фосфолипидов; 3 - слой холестерол-агликоновых комплексов; 4 - слой углеводных цепей гликоалкалоидов.
На примере YOmpF было показано, что в полученный комплекс можно эффективно встраивать белковый антиген. Структура полученного антиген-содержащего ТИ-комплекса не отличалась от структуры исходного носителя (Костецкий и др., 2007; Санина и др., 2008). При эксперементальной иммунизации мышей YOmpF в составе ТИ-комплексов обнаруживался сильный гуморальный иммунный ответ на антиген. Этот ответ был заметно выше, чем при использовании классических ISCOM, липосом и полного адъюванта Фрейнда (Ли и др., 2008; Kostetsky et al., 2011).
При эксперементальной иммунизации мышей YOmpF в составе ТИ-комплексов обнаруживалось примерно 4-х кратное увеличение уровня антипориновых антител по сравнению с эффектом индивидуального антигена. Полученный ТИ-комплекс проявлял значительно меньшую токсичность по сравнению с ISCOM (Kostetsky et al., 2011).
Системы растворителей для ТСХ липидов и кукумариозидов
Для выделения МГДГ использовали морские макрофиты Sargassum pallidum (Turn.) С. Ag., Laminaria japonica Arech. (Phaeophyta), Ulva fenestrana Ruprecht (Chlorophyta), Zostera marina L. (Embriophyta) и Ahnfeltia tobuchiensis (Kanno et Matsubara) Makijenko (Rhodophyta), собранные в заливе Петра Великого Японского моря в августе при температуре воды 20-23 С. Рассортированные растения очищали от эпифитов и беспозвоночных, после чего кипятили 2 мин в морской воде для инактивации липолитических ферментов. Подвергнутые тепловой обработке растения заливали системой хлороформ - метанол (2:1, об/об).
Для выделения ФХ и ФЭ использовали морские иглокожие Strongilocentrotus intermedius и Distolasterias nippon, собранные в заливе Петра Великого Японского моря в августе при температуре воды 20-23 С.
Кукумариозиды выделяли из голотурии Cucumaria japonica Semper, выловленной в Японском море в апреле - октябре. У свежевыловленных животных брали стенки тела, которые измельчали и обрабатывали 50%-ным этанолом для инактивации гликозидаз.
Определение растений и животных проводили по определителям (Растения и животные залива Петра Великого, 1976; Перестенко и др., 1980). Порин YOmpF из грамотрицательной бактерии Yersinia pseudotuberculosis Pfeiffer (штамм 598, IB серовар) был выделен по методу, описанному Новиковой и др. (1989), и любезно предоставлен в виде раствора в фосфатно-солевом буфере с 0.8% октил-Р-Б-глюкопиранозида (Sigma, США) сотрудниками лаборатории Молекулярных основ противобактериального иммунитета ТИБОХ ДВО РАН. В качестве модельных антигенов также использовали рекомбинантный нерасщепленный мономер гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/California/04/2009) (Sino Biological Inc., Китай) и коммерческий человеческий сывороточный альбумин (Sigma, США). Биологические испытания проводили на мышах линий Balb/c и СВА массой 18-21 г, любезно предоставленных виварием ТИБОХ ДВО РАН.
Экстракцию общих липидов из морских макрофитов и иглокожих проводили по методу Блайя и Дайера (Bligh, Dyer, 1959). Экстракт упаривали под вакуумом при 40 С с помощью роторного испарителя. Остаток перерастворяли в хлороформе. Полученные экстракты стабилизировали 0.01% 2.6-ди-трет-бутил-п-крезола и хранили в морозильной камере в плотно закрытой темной посуде.
Силикагель и пластинки для тонкослойной хроматографии (ТСХ) готовили по методу Светашева В.И. и Васьковского В.Е. (Svetashev, Vaskovsky, 1972). Для микро-ТСХ на стеклянные пластинки размером 6x6 см наносили 2 мл суспензии 2-х часовой фракции силикагеля с 10% CaS04 х 2НгО. Для препаративной ТСХ на стеклянные пластинки размером 9x12 см наносили 5 мл ЗО-ти минутной фракции силикагеля, суспендированной в воде (50:45, об/об) с добавлением 10% CaS04x2H20. Пластины высушивали на воздухе и перед анализом липидов активировали в течение 2 ч при 120 С. Для анализа тритерпеновых гликозидов использовали неактивированные пластинки. Образцы наносили с помощью калиброванного капилляра объемом 5 мкл (Sigma, США).
Для разделения МГДГ с помощью микро-ТСХ использовали систему растворителей ацетон-бензол-вода (91:30:6, об/об). При очистке МГДГ от пигментов и нейтральных липидов с помощью препаративной ТСХ использовали систему хлороформ-ацетон (1:1, об/об). Затем пластинку высушивали и хроматографировали повторно в системе ацетон-бензол-вода (91:30:6, об/об). Для разделения ФЭ и ФХ с помощью микро-ТСХ применяли систему хлороформ-метанол-25%-ный аммиак (65:25:5, об/об). Кукумариозиды разделяли с помощью микро-ТСХ в системе хлороформ-этанол-вода (100:100:17, об/об).
Обнаружение липидов и кукумариозидов Для неспецифического обнаружения хроматографические пластины опрыскивали 10%-ным раствором H2SO4 в метаноле и нагревали при 150 С до появления темных пятен. Гликолипиды и кукумариозиды обнаруживали после опрыскивания ТСХ пластин 0.2%-ным раствором антрона в бензоле и затем 55%-ным раствором серной кислоты с последующим нагреванием при 105 С (Van Gent et al., 1973). Фосфолипиды обнаруживали с помощью универсального молибдатного реактива (Vaskovsky et al., 1975). Для обнаружения холин-содержащих и других соединений с четвертичными аммониевыми группировками использовали реактив Драгендорфа (Wagner et al., 1961). Для обнаружения аминосодержащих соединений использовали 0.2%-ный раствор нингидрина в ацетоне.
Для препаративного выделения МГДГ общий липидный экстракт из морского макрофита наносили на колонку, заполненную силикагелем 43-60 мкм (Merck, Германия), суспендированным в хлороформе, из расчета общие липиды-силикагель 1:60-80, в весовом соотношении. Отношение длины столба сорбента к его диаметру - 10:1. МГДГ элюировали системой хлороформ-ацетон (1:1, об/об). Выход МГДГ с колонки контролировали с помощью микро-ТСХ.
Полученные фракции МГДГ объединяли и проводили дополнительную очистку с помощью препаративной ТСХ как описано в разделе 2.4. После хроматографии пластинку высушивали, опрыскивали зоны по 5-7 мм с обоих ее краев 10%-ным раствором серной кислоты в метаноле и подвергали локальному нагреванию до появления темных пятен. Промежуточную зону сорбента, содержащую МГДГ, соскребали с пластинки. Гликолипид элюировали с силикагеля системой хлороформ-метанол (1:1, об/об). Полученный элюат упаривали под вакуумом при 40 С с помощью роторного испарителя и перерастворяли в хлороформе из расчета 5 мг/мл.
Чистоту полученных препаратов МГДГ контролировали с помощью микро-ТСХ в условиях, аналогичных условиям контроля за выходом гликолипидов с колонки. Хроматографическая чистота полученных препаратов была не ниже 99%. Препараты МГДГ стабилизировали 0.01% 2.6-ди-трет-бутил-п-крезолом и хранили в морозильной камере в плотно закрытой темной посуде.
Микровязкость моногалактозилдиацилглицерина из морских макрофитов
В целом описанные в главе 3.2 результаты показали, что одним из путей достижения желаемого иммунного ответа является модуляция не столько самого по себе жирнокислотного состава, сколько микровязкости МГДГ, который обеспечивает липидное окружение для белковых антигенов в ТИ-комплексах. Умеренная жидкостность липидного окружения порина, вероятно, необходима для оптимальной презентации антигенных детерминант белка. Важно, что это предположение было также подтверждено результатами ДСК (табл. 3), которая позволят регистрировать интегральные изменения в биологических макромолекулах. Калориметрические данные показали, что МГДГ из S. pallidum и U. fenestrata со средней микровязкостью мягко стабилизируют конформацию белка и обеспечивают максимальный иммуностимулирующий эффект. Наиболее и наименее вязкие МГДГ из Z. marina и A. tobuchiensis соответственно индуцировали максимальный и минимальный стабилизирующий эффекты на порин. В результате, деконволюция экспериментальных спектров флуоресценции порина показала, что эти образцы МГДГ с противоположной вязкостью влияли на распределение всех спектральных форм остатков триптофана (табл. 4). Наоборот, МГДГ из S. pallidum и U. fenestrata более мягко влияли на третичную структуру белка, поддерживая вклад спектральных форм I или S, соответственно, что, очевидно, способствует появлению антигенной структуры порина близкой к нативной (табл. 4). Относительно небольшие изменения во вторичной структуре порина (табл. 5), вероятно, дают пренебрежительно малый вклад в изменения третичной структуры этого белка под воздействием МГДГ. Сравнительно небольшие флуктуации в содержании большинства цитокинов выявляют тенденцию влияния МГДГ из различных морских макрофитов на цитокиновые механизмы регуляции иммунного ответа.
Возможность регулировать иммуностимулирующий эффект ТИ-комплексов путем варьирования микровязкости МГДГ можно рассматривать как новую функцию этого гликолипида, собственная иммуностимулирующая активность которого была описана ранее (Костецкий и др., 2007). Это наблюдение способствует более глубокому пониманию механизма действия липидсодержащих адъювантов и позволяет использовать преимущества липидной «нанофлюидики» как новой стратегии для повышения иммуностимулирующего потенциала липид-антигенных комплексов с применением разнообразных белков.
Влияние моногалактозилдиацилглицерина из разных видов морских макрофитов на иммуногенность и конформацию гемагглютинина в составе тубулярных иммуностимулирующих комплексов
Как было показано в разделе 3.2. настоящей работы, использование МГДГ с разными физико-химическими свойствами позволяет изменять конформацию бактериального антигена порина в составе ТИ-комплекса и, следовательно, регулировать иммуногенность всей вакцинной конструкции. Чтобы понять, насколько универсальным может быть этот подход для достижения необходимой эффективности ТИ-комплексов по отношению к другим белковым антигенам, нами был использован рекомбинатный мономер главного поверхностного белка вируса гриппа А - гемагглютинина (НА), который является мишенью почти всех нейтрализующих антител. Таким образом, гемагглютинин является важным объектом для разработки вакцин (Ekiert его/., 2011).
В свою очередь, использование рекомбинантных белков является привлекательным подходом для создания вакцин, так как в этом случае не требуется обработка инфекционных бактерий и вирусов. Однако рекомбинантные белки слабо иммуногены, и для повышения их иммуногенности необходимы адъюванты (Sedova et al., 2012). 3.3.1. Характеристика рекомбинантного мономера гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/CaliJЬгпіа/O/V2009)
Гемагглютинин синтезируется в виде простого полипептида, который затем тримеризуется. Мономер синтезируется как молекула-предшественник, которая биологически неактивна до момента расщепления трипсиноподобной, аргинин-специфичной протеазой хозяина на две, связанные дисульфидной связью, субъединицы: тяжелую НА1 и легкую НА2 с молекулярными массами примерно 50 и 25 кДа соответственно (Steinhauer, 1999; Gamblin, Skehel, 2010).
Каждая субъединица гемагглютинина представляет собой грибоподобную структуру с двумя регионами: глобулярная часть образована антипараллельными Р-листами, а область стебля состоит из а-спиралей (Gamblin et al., 2004). Глобула содержит только часть НА1, в то время как стебель содержит часть НА1 и весь НА2. Главные нейтрализующие эпитопы представлены в глобулярных участках гемагглютинина. Два антигенных сайта {Sa и Sb) из четырех являются штаммоспецифичными (strain-specific), а два других {Са и СЬ) - перекрестно реагирующими (cross-reactive). Сайт Са подразделяют на два субрегиона: Cal и Са2. Антигенные сайты СЬ и Sb являются секвенциальными, а остальные {Сa, Sa) - конформационными. Однако сайт Са формируется только в тримерной форме гемагглютинина (Hagembe, 2009; Igarashi et al., 2010). При инфицировании ответ организма хозяина главным образом характеризуется индукцией антител, нейтрализующих эти эпитопы и тем самым предотвращающих прикрепление гемагглютинина вируса к клеточному рецептору (Prabakaran et al., 2010).
В настоящей работе мы использовали рекомбинантный нерасщепленный мономер гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 {A/California/04/2009) с полигистидиновой меткой на С-конце (НА0) (Sino Biological Inc., Китай). Важно отметить, что нерасщепленный мономер неинфекционен в отличие от расщепленного. Другим преимуществом нерасщепленного мономера по сравнению с расщепленным является существенно большая иммуногенность, что свидетельствует о зависимости иммуногенности белка от его третичной структуры (Jackson et al., 1978). В аминокислотной последовательности нерасщепленного мономера гемагглютинина вируса гриппа A/H1N1 (A/California/04/2009) различают следующие участки: фрагмент с 1-го по 17-й аминокислотный остаток является сигнальным пептидом; участок от 18-го по 344-й аминокислотный остаток соответствует НА1, а фрагмент от 345-го по 566-й аминокислотный остаток -НА2:
Влияние моногалактозилдиацилглицерина из различных морских макрофитов на конформацию гемагглютинина
Влияние замены КД А2-2 в ТИ-комплексах на другие индивидуальные кукумариозиды (КД А2-4 и КД Е) и фракции кукумариозидов 2 и 4 на иммуногенность антигена порина YOmpF оценивали по содержанию антипориновых антител в сыворотке мышей, иммунизированных соответствующими препаратами. Для приготовления комплексов использовали только МГДГ из U. fenestrata с весовым соотношением КД-Хол-МГДГ 6:2:4. В результате было установлено, что индивидуальный
Электронные микрофотографии неокрашенных частиц ТИ-комплексов на основе различных кукумариозидов (КД) С. japonica: А - КД А2-2; Б - КД А2-4; В - КД Е; Г - фракция КД 2; Д - фракция КД 4. Масштабная линия - 400 нм. тримерныи порин повышает продукцию антител в три раза по сравнению с интактным контролем (рис. 21).
Применение ТИ-комплексов позволило усилить способность порина индуцировать выработку антител в 1.4-4.1 раза. Максимального эффекта удалось достичь при применении ТИ-комплекса на основе кукумариозида А2-2, тогда как КД Е стимулировал выработку антипориновых антител в наименьшей степени. Эффект кукумариозида А2-4 был сравнительно высоким, но в 1.3 раза менее выраженным по сравнению с эффектом А2-2 Фракции кукумариозидов 2 и 4 эффективно повышали выработку специфических антител (в 2.3 и 3.1 раза по сравнению с индивидульным порином соответственно), но в меньшей степени, чем кукумариозиды А2-2 и А2-4.
Содержание антипориновых антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных порином в составе ТИ-комплексов на основе различных кукумариозидов и фракций кукумариозидов. По оси абсцисс экспериментальные группы животных, иммунизированных индивидуальным тримерным порином (Порин) или порином в составе ТИ-комплексов, содержащих КД А2-2/ КД Е/ КД А2-4/ КД фракции 2/ КД фракции 4 (ТИ (А2-2)/ ТИ (Е)/ ТИ (А2-4)/ ТИ (фр. 2)/ ТИ (фр. 4) соответственно). ИК -интактный контроль. По оси ординат - содержание антител, выраженное в единицах оптической плотности при длине волны 450 нм (А 450). Разведение сыворотки крови - 1/100. Представлены значения средних арифметических ± доверительный интервал.
Для оценки влияния кукумариозидов на конформационные изменения порина в связи с различной иммуногенностью этого белка в составе ТИ-комплексов была исследована собственная флуоресценция порина в комплексе с кукумариозидами А2-2, А2-4 и Е. Соответствующие экспериментальные спектры и их элементарные компоненты, отвечающие испусканию белкового флуорофора - триптофана, представлены на рисунке 22, а вклад различных спектральных форм триптофана в общий спектр флуоресценции порина показан в таблице 11.
Из полученных результатов следует, что кукумариозиды в значительной степени влияли на третичную структуру белка. Так, под влиянием кукумариозидов появлялась III спектральная форма триптофана, отсутствующая в спектре индивидуального порина, и одновременно сокращался в 2.8-4.6 раза вклад формы S. То есть кукумариозиды способствовали разворачиванию третичной структуры белка, что согласуется с высокой поверхностной активностью сапонинов и их способностью солюбилизировать мембранные белки (Guclu-Ustimdag, Mazza, 2007).
Следует отметить, что исследованные кукумариозиды оказывали разное воздействие на распределение спектральных форм триптофана. Содержание формы I не изменялось только под действием КД А2-2. КД Е и КД А2-4 снижали вклад этой формы с 53% до 46% и 32% соответственно. Вклад формы II уменьшался под действием всех кукумариозидов, особенно сильно (до 0%) это происходило под действием КД Е, и в наименьшей степени - под действием КД А2-4. Вклад формы III увеличивался под воздействием всех кукумариозидов, но наибольший эффект оказывали КД А2-4 и КД Е.
Спектры собственной флуоресценции (темные круги) индивидуального порина YOmpF (а) и порина YOmpF в комплексе с кукумариозидами из С. japonica: А2-2 (Ь), А2-4 (с) и Е (d) в 0.03 М Трис-НС1 буфере, рН 7.5, и их приближение к теоретической модели дискретных состояний остатков триптофана в белках (сплошные линии с темными кругами, которые являются суммой спектральных компонентов S, I, II и III (пунктирные линии)). Концентрация белка - 0.06 мг/мл. Длина волны возбуждения - 296 нм.
Таким образом, кукумариозиды проявили различное влияние на конформацию порина, что согласуется с литературными данными о зависимости влияния сапонинов на физико-химические и биологические свойства других белков от химической структуры сапонинов. Однако, следует отметить, что эффект одного и того же сапонина на разные белки может быть различным (Guclu-Ustimdag, Mazza, 2007). Судя по резкому увеличению вклада III формы в спектр флуоресценции порина, происходило разворачивание белка и экспонирование его антигенных детерминант. КД Аг-2, который оказывал наибольший иммуностимулирующий эффект на порин, в меньшей степени способствовал экспонированию триптофановых остатков в водное окружение. Но если КД Е разворачивал белок за счет наиболее резкого снижения спектральной формы II, то разворачивающий эффект КД Аг-4 оказывал как за счет II, так и I форм. И, вероятно, это более мягкое перераспределение вкладов форм может быть причиной существенно большего эффекта КД Аг-4 на иммуногенность порина по сравнению с КД Е.
