Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы
1. Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований 10
1.1. Пассивная иммунотерапия 11
1.2. Активная иммунотерапия и противоопухолевые вакцины 12
1.3. Противоопухолевые вакцины: проблемы и перспективы 16
2. Белки теплового шока 70кДа и их внутриклеточные функции 20
2.1. Молекулярная структура белков семейства HSP70 20
2.2. Номенклатура генов белков семейства HSP70 21
2.3. Функции HSP70 внутри клетки 23
2.4. Механизм связывания пептидов с HSP70 27
3. Внеклеточные функции HSP70 29
3.1. Механизмы выхода HSP70 из клеток 29
3.2. Иммунологические функции HSP70 30
3.3. Стратегии создания вакцин на основе HSP70 32
II. Экспериментальная часть
Материалы 36
Методы исследования 38
1. Получение мРНК и кДНК генов семейства HSP70 человека 38
2. Конструирование экспрессионных векторов 38
2.1. Амплификация ДНК 3 8
2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и экстракция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 39
2.3. Рестрикция плазмид 40
2.3.1. Рестрикция плазмиды pUC19 Smal рестриктазой
2.3.2. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70 I, pUC19- HSP70 II, pUC19-HSC70 I и pUC 19- HSC70 II рестриктазами PstI и Hindlll
2.3.3. Рестрикция плазмиды pQE80L рестриктазами BamHI и Hindlll
2.3.4. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70AiB. pUC19-HSP70HYB, pUC19-HSC70 и PUC19-HSC70HYB рестриктазами BamHI и Hindlll
2.4. Дефосфорилирование рестриктированной Smal плазмиды pUC19 40
2.5. Фосфорилирование фрагментов ДНК 41
2.6. Лигирование 41
2.7. Получение компетентных клеток и их трансформация 41
2.8. Выделение плазмид методом щелочного лизиса 42
3. Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков 42
4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы штаммов-продуцентов E.coli 43
5. Определение спектральных характеристик белков 43
5.1. Измерение спектральных характеристик белков при различных значениях рН среды 43
5.2. Измерение спектральных характеристик белков при взаимодействии с пептидами 44
6. Определение АТРазной активности рекомбинантных белков 44
7. Получение комплексов рекомбинантных белков HSP70 с синтетическими пептидами 44
7.1. Получение меченых FITC синтетических пептидов 44
7.2. Получение комплексов индивидуальных пептидов с HSP70 44
7.3. Получение комплексов смеси меченого и немеченого пептидов с HSP70HYB 45
7.4. Получение комплексов смеси немеченых пептидов с HSC70 45
8. Определение кинетических характеристик HSP70 46
9. Получение комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток 46
9.1. Получение пептидной фракции лизата опухолевых клеток 46
9.2. Получение комплексов пептидной фракции лизата опухолевых клеток с HSP70 47
10. Анализ клеточных пептидов, образующих комплексы с HSP70 47
11. Анализ индукции цитотоксической активности Т лимфоцитов 48 11.1. Культивирование клеток 4 8
11.2. Получение дендритных клеток 48
11.3. Анализ фенотипа ДК 49
11.4. Нагрузка ДК опухолеспецифическими антигенами 49
11.5. Индукция специфических цитотоксических лимфоцитов 49
11.6. Определение цитотоксической активности ЦТЛ 50
III. Результаты и обсуждение
1. Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных векторах 52
2. Получение рекомбинантных белков 55
3. Исследование спектральных характеристик рекомбинантных HSP70 57
4. Исследование динамики связывания рекомбинантных HSP70 с пептидами 65
5. Исследование АТР-азной активности HSP70 72
6. Исследование влияния различных параметров на связывание HSP70
с пептидами 75
7. Исследование взаимодействия HSP70 со смесью пептидов 77
8. Исследование взаимодействия HSP70 с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток 80
9. Исследование цитотоксической активности 86
Заключение 88
Выводы 91
Список литературы
- Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований
- Получение мРНК и кДНК генов семейства HSP70 человека
- Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков
- Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных векторах
Введение к работе
Актуальность темы.
Одним из наиболее динамично развивающихся в настоящее время подходов к лечению злокачественных новообразований является иммунотерапия, предполагающая подавление роста опухоли за счет индукция цитотоксических лимфоцитов (CTL), специфичных к антигенам опухоли. Необходимым условием получения специфического клеточного иммунного ответа является представление специализированными антиген-презентирующими клетками (АПК) опухолевых антигенов наивным CD8+ Т-лимфоцитам, осуществляемое благодаря процессу кросс-презентации, заключающемуся в способности АПК презентировать экзогенные антигены в составе MHC-I [135,182]. В 1990-х годах Р.К. Srivastava показал, что наибольшей иммуногенностыо обладают выделенные из опухолевых клеток белковые фракции с молекулярной массой около 70 и 90 кДа, а также, что иммуногенность данных фракций объясняется присутствием в них комплексов пептидных опухолевых антигенов с белками теплового шока HSP70, HSP90 и gp96 [77].
Белки теплового шока выполняют шаперонные функции внутри клеток и потому способны образовывать комплексы с широким спектром пептидов, а при попадании во внутренние среды организма в результате активной секреции при стрессе, или после гибели клеток комплексы пептидов с белками теплового шока могут быть захвачены АПК путем эндоцитоза, опосредуемого рецепторами CD91 и CD40, и включены в механизм кросс-презентации антигенов [11].
Клинические испытания вакцин [189], созданных на основе белков теплового шока, демонстрируют их высокую безопасность при достаточно большой дисперсии эффективности, которая может быть объяснена не только иммуносупрессорным влиянием опухоли, но и факторами, связанными с технологией получения препаратов. Наиболее перспективным подходом представляется создание аутологичных вакцин на основе выделенных из опухоли комплексов антигенных пептидов с HSP70 и gp96. Данный подход обеспечивает использование уникальных антигенов, присущих именно этой опухоли. Основной проблемой аутологичных вакцин является зависимость количества выделяемой вакцины от размеров опухоли. До 50% пациентов исключается из клинических испытаний по причине невозможности выделения достаточного для иммунизации количества вакцины [189]. Повышение концентрации шаперонов внутри клетки связано с воздействием на нее стрессовых факторов. Условия, создающиеся в период стресса различной природы внутри клетки, могут значительно различаться, что, по-видимому, может отражаться на степени нагрузки HSP70 антигенами и сужать спектр
I пептидов, образующих стойкие комплексы с данным белком in vivo. Неполная передача антигенного репертуара опухоли является, по-видимому, второй проблемой, объясняющей высокую дисперсию эффективности, характерную для аутологичных вакцин. Разрешить обе указанные проблемы может применение для получения вакцин рекомбинантного HSP70 человека и разработка методики нагрузки данного белка антигенами, выделяемыми из пептидной фракции лизата клеток аутологичной опухоли in vitro.
Целью данной работы является: определение оптимальных условий получения комплексов пептидных антигенов с рекомбинантным HSP70 человека in vitro для повышения содержания антигенных пептидов в составе комплексов и расширения спектра связываемых антигенов.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
• Клонирование генов белков теплового шока» человека HSPA1B, HSPA8 и создание генно-инженерных конструкций их гибридных аналогов HSP70HYB и HSC70HYB.
• Экспрессия клонированных генов в клетках E.coli и получение высокоочищенных рекомбинантных белков HSP70AIB HSC70, HSP70HYB И HSC70HYB.
• Определение спектральных характеристик и функциональной активности рекомбинантных белков.
• Исследование влияния на процесс образования комплексов рекомбинантных белков с НЬА-А2-рестриктированными пептидами следующих факторов: рН среды, температура, концентрация ADP и аденозиновых нуклеотидных аналогов, соотношение компонентов смеси.
• Отработка методики получения комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизатов опухолевых клеток.
• Исследование способности полученного in vitro комплекса Н8Р70-пептид вызывать активацию антиген специфических цитотоксических Т-лимфоцитов.
Научная новизна и практическая значимость работы.
Продемонстрировано влияние междоменных взаимодействий на спектральные характеристики белков. Впервые была показана корреляция изменений в УФ-спектре рекомбинатных HSP70 человека со структурными изменениями, происходящими при взаимодейстии данных белков с пептидами. Показаны различия пептид-связывающей активности рекомбинантных белков HSP70AIB, HSP70HYB HSC70 и HSC70HYB В ходе исследований был определен характер взаимодействий АТР-азного и пептид-свзывающего доменов в рекомбинантных белках и на основе полученных данных впервые предложен способ определения количества пептидных комплексов в препаратах HSP70, который может быть использован для стандартизации вакцин на основе рекомбинантных HSP70.
Показана возможность увеличения количества вакцины, выделяемой из фиксированного количества опухолевых клеток, за счет использования пептидной фракции лизата опухолевых клеток.
Наиболее перспективными из полученных рекомбинантных белков являются HSP70HYB И HSC70. Предложена методика получения противоопухолевых вакцин на их основе.
Работа в целом представляет собой основу для создания технологического регламента получения индивидуальных противоопухолевых, а также противовирусных вакцин на основе рекомбинантных белков HSP70. В работе проанализированы возможности дальнейшего совершенствования данного направления с учетом полученных в ней новых научных данных.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop "New Technologies in Medicine and Experimental Biology" (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007). Міжнародна наукова конференція студентів та молодых вчених «Молодь — медицині майбутнього» (Одесса, Украина, 2008. Работа награждена дипломом I степени.) V Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008). VIII Всероссийская выставка научно-технического творчества молодежи НТТМ-2008 (Москва, 2008. Автор награжден медалью «За успехи в научно-техническом творчестве»). Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных "Ломоносов-2009" (Москва, 2009). Методическая конференция кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова 22.04.2009.
Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований
Впервые данные об иммуногенности опухолей были получены в 1960 году [89]. К тому же времени следует отнести начало работ по определению молекулярной природы опухолевых антигенов. Для того, чтобы были охарактеризованы первые антигены опухолей мышей, а затем и антигены опухолей человека потребовалось около 30 лет [136]. К настоящему моменту известно более 100 опухолеассоциированных антигенов и количество их постоянно увеличивается [58]. Созданы международные базы данных, осуществляющие мониторинг вновь открываемых опухолевых антигенов (hltp://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm)[130,178], представляющих потенциальный интерес для иммунотерапии.
Принято выделять несколько групп опухолевых антигенов: 1) Продукты реактивации онкофетальньгх генов (MAGE, В AGE, GAGE и др.). Такие антигены могут экспрессироваться опухолями различного гистологического происхождения и являются достаточно специфическими для опухолевых клеток. 2) Ткане-специфические антигены (тирозиназа, PSA, PSMA, MART-1/Melan А и т.д.), характерные не только для опухолевых клеток, но и для здоровых клеток той ткани, от которой произошла опухоль. 3) Усиленно продуцируемые опухолями антигены (HER2, MUC1), экспрессия которых в здоровых клетках в значительной мере подавлена. 4) Уникальные опухолевые антигены (р53, ras), являющиеся следствием мутаций в нормальных генах. 5) Вирусные антигены (HBV, HPV, EBV), являющиеся продуктами встроенных в ДНК вирусных частиц, приводящих к злокачественному перерождению клеток.
Описанные выше антигены экспрессируются «зрелыми» опухолевыми клетками. Недавние исследования [71,101] показали существование, так называемых, «стволовых» опухолевых клеток, представляющих собой небольшую популяцию относительно медленно пролиферирующих клеток опухоли, способных восстанавливать опухоль после цитотоксической терапии и образовывать метастазы [15,117]. Эта популяция обладает, по-видимому, несколько отличным от «зрелых» опухолевых клеток антигенным репертуаром, и повышенной резистентностью к цитотоксическим препаратам, действующим на активно пролиферирующие клетки. Таким образом, разработка методик цитотоксической терапии «стволовых» опухолевых клеток, в частности иммунотерапии, а, следовательно, и поиск ассоциированных с ними антигенов становятся одной из наиболее актуальных задач современной медицины.
В основу противоопухолевой иммунотерапии положены представления об иммунологическом контроле и иммунологической толерантности. Было поучено три основных доказательства иммуногенности опухолей. Во-первых, наиболее подверженными возникновению злокачественных опухолей являются экспериментальные животные с иммунодефицитами [39,40]. Во-вторых, к развитию онкологических патологий приводило искусственное угнетение иммунной системы при трансплантациях [121]. И, в-третьих, была обнаружена инфильтрация лимфоцитов в злокачественную опухоль и их способность деструктировать опухолевые клетки [65,180].
Важным механизмом противоопухолевой защиты является клеточная цитотоксичность, проявляемая CD8+ Т-лимфоцитами и нормальными киллерными клетками (NK). Цитотоксические Т-лимфоциты распознают свои мишени по наличию на поверхности клеток специфических антигенов в составе Главного Комплекса Гистосовместимости (МНС), мишенями для NK служат клетки, не экспрессирующие МНС (например, некоторые опухоли, или клетки пораженные герпесвирусами).
Молекулы MHC-I типа экспрессируются в норме практически всеми ядросодержащими клетками организма и презентируют эндогенные антигены — продукты деградации внутренних белков. Характерной чертой системы МНС является высокая степень полиморфизма. Обладая разными молекулами МНС, иммунная система способна распознавать широкий спектр антигенов с последующей презентацией и развитием эффективного иммунного ответа, несмотря на то, что каждая изоформа МНС обладает достаточно высокой селективностью в отношении связываемого пептидного мотива (феномен МНС-рестрикции). Генетическая вариабельность молекул МНС определяет устойчивость или чувствительность к инфекциям, а также предрасположенность к аутоиммунным заболеваниям и аллергиям. Этим, по-видимому, объясняется преобладание тех или иных аллелей МНС в различных географических регионах. Так на европейской территории около 40% людей имеют аллель HLA-A2.
Исход иммунного ответа зависит от многих факторов, так как активатором Т-клеток служит не сам антиген, а образующиеся в результате его процессинга антигенные пептиды, связанные с молекулами MHC-I класса на поверхности специализированных антиген-презентирующих клеток (АПК). Усиление цитотоксического иммунного ответа осуществляется за счет продукции воспалительных цитокинов и участия Т-хэлперных клеток ТЫ. Взаимодействие с CD4+ Т-клетками, незрелыми АПК и секреция протвовосполительных цитокинов (IL-10, TGFp) - напротив — приводит к иммуносупрессии.
Современная теория развития опухоли и ее ухода от распознавания клетками иммунной системы предполагает наличие трех этапов: элиминирование, равновесие и собственно уход от иммунного контроля. Если перерождение здоровой клетки в опухолевую происходит в результате мутации, процесса стохастического, то переход в состояние равновесия объясняется действием иммунной селекции, механизм которой сходен с механизмом дарвиновского естественного отбора. На первых двух этапах происходит закрепление мутации в перерожденных клетках, а клинически диагностируемые формы злокачественного новообразования появляются только на третьем этапе [136]. Механизмы ускользания опухоли от иммунного контроля разделяют на три группы [110]:
нарушение распознавания антигенов клетками иммунной системы, связанное с дефектами соответствующих молекул на поверхности опухоли (мутация р561ск тирозин киназы, приводящая к нарушению структуры CD3-C, [152]);
нарушение механизмов апоптоза, приводящее к ускользанию от эффекторных воздействий клеток иммунной системы (мутации белка р53, Вс1-2,Вах и др.) [141,170];
нарушение фукционирования иммунной системы посредством факторов, подавляющих активность клеток иммунной системы в микроокружении опухоли (фактор роста эндотелия сосудов, растворимый фосфатидилсерин, прстагландин Ег и др.) [86].
Таким образом, основными направлениями противоопухолевой иммунотерапии становятся преодоление иммунной толерантности к опухоли (активная иммунотерапия) и введение искусственных эффекторов, специфичных к антигенам опухоли (пассивная иммунотерапия). Историческое позиционирование активной иммунизации, как профилактической, а пассивной — как терапевтической, привело к тому, что второй подход развивался более динамично.
Получение мРНК и кДНК генов семейства HSP70 человека
Амплификацию ДНК HSP70 проводили методом ПЦР с использованием следующих пар праймеров:
1) для фрагмента HSP70J прямой праймер 5 -САТ ATG GGA ТСС GCC AAA GCC GCG G-3 содержит сайты для рестриктаз Ndel (подчеркнут) и BamHI (выделен курсивом), обратный праймер 5 -G AAG TCCTGCAGC AGC ТТС TGC-3 содержит сайт рестрикции PstI (подчеркнут);
2) для фрагмента HSP70JI и HSC70JI, прямой праймер 5 -GCA GAA GCT GCT GCA GGA СТТ С-3 содержит сайт рестрикции PstI (подчеркнут), обратный праймер 5 -AAG СТТ TTA GTC GAC CTC CTC AAT GG-3 содержит сайты рестрикции для Hindlll (подчеркнут) и Sail (выделен курсивом);
3) для фрагмента HSC70J прямой праймер 5 -ТТТ-САТ ATG GGA ТСС AAG GGA CCA GCA G-3 содержит сайты для рестриктаз Ndel (подчеркнут) и ВатШ (выделен курсивом), обратный праймер 5 -GTC CTG CAG AAG СТТ CTG ААТ-3 содержит сайт рестрикции PstI (подчеркнут);
Реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала 1 мкл кДНК, по 50 пмоль/мкл каждого праймера для амплификации соответствующих фрагментов, 5 мкл буфера для ПЦР (67 мМ Трис-HCl, рН 8.8, 16.6 мМ (NH4)2S04, 1.5 мМ MgCl2, 0.01% Tween20), 200 мкМ dNTPs, 1 ед Taq-полимеразы. Для синтеза фрагментов HSP70_I, HSP70_II и HSC70JI проводили последовательно 5 (94С, 30 с; 44С, 30 с; 72С, 40 с) и 30 (94С, 30 с; 67С, 30 с; 72С, 40 с) циклов амплификации. Для синтеза фрагмента HSC70_I проводили последовательно 5 (94С, 30 с; 45С, 40 с; 72С, 50 с) и 30 (94С, 30 с; 59С, 30 с; 72С, 50 с) циклов амплификации.
Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 1.2% агарозном геле в буфере ТАЕ (400 мМ Трис-ацетат, рН 8.0, 2 мМ ЭДТА, 1 мкг/мл бромистого этидия) при напряжении 90 V и комнатной температуре. Для нанесения на гель раствор ДНК смешивали с шестикратным буфером для нанесения проб (0.25% бромфенолового синего, 0.25% ксилолцианола, 30% глицерина в воде). По окончании разделения окрашенную бромистым этидием ДНК наблюдали при освещении геля ультрафиолетовыми лучами.
Полосы фрагментов ДНК величиной 1068 п.о. (фрагмент HSP70_I), 1064 п.о. (фрагмент HSC70J) и 895 п.о (фрагменты HSP70JI HSC70 II) переводили в 1% гель легкоплавкой агарозы, откуда их вырезали и расплавляли при 70С в течение 10 мин. Расплавленную смесь инкубировали 5 мин при 42С, добавляли агаразу (1 ед. на 100 мкг вырезанного геля с амплификатом) и снова инкубировали при 42С в течение 40 мин. К смеси добавляли ацетат натрия до конечной концентрации 0.3 М, охлаждали во льду 5 мин и центрифугировали при 13000 g (+4С) в течение 15 мин. Супернатанты, содержащие фрагменты ДНК, переносили в чистые пробирки и переосаждали двумя объемами этанола.
Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10-кратного буфера Y+/tango (33 мМ Трис-ацетат (рН 7.9 при 37С); 10 мМ Mg-ацетат, 66 мМ К-ацетат, 0.1 мг/мл БСА); 10 мкл (2 мкг) плазмиды pUC19; 1 мкл (10 ед) рестриктазы Smal; 34 мкл дистиллированной воды. Смесь инкубировали при 30С в течение 1.5 ч и инактивировали при 65С 20 мин.
Рестрикция плазмидpUC19-HSP70_I, pUC19- HSP70II, pUC19-HSC70_I upUC19 HSC70_IIрестриктазами PstI и Hindlll.
Реакционные смеси объемом 50 мкл содержали по 5 мкл 10-кратного буфера R+; 4 мкл плазмиды (2 мкг); 0.5 мкл рестриктазы PstI (5 ед) и 1 мкл HindHI (10 ед); 39.5 мкл дистиллированной воды. Смеси инкубировали при 37С в течение 1.5 ч и инактивировали добавлением 2 мкл 0.5 М ЭДТА.
Рестрикция плазмиды pQE80L ВатНІ и HindHI.
Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10-кратного буфера R+ (10 мМ Трис-HCl (рН 8.5 при 37С); 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 0.1 мг/мл БСА); 1 мкл (1 мкг) плазмиды pQE80L; по 0.5 мкл (5 ед) рестриктаз Ndel и HindHI, 43 мкл дистиллированной воды. Смесь инкубировали при 37С в течение 1.5 ч и инактивировали добавлением 2 мкл 0.5 М ЭДТА.
Рестрикция плазмид PUC19-HSP70AIB,PUC19-HSP70HYB,PUC19-HSC70 и pUC19 HSC70HYBрестриктазами ВатШ и HindHI.
Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10-кратного буфера R+(10 мМ Трис-HCI (рН 8.5 при 37С); 10 мМ MgCl2, 100 мМ КС1, 0.1 мг/мл БСА); 4 мкл (2 мкг) плазмиды pUC19-HSP70, содержащей ген, кодирующий HSP70A1B; по 0.5 мкл (5 ед) рестриктаз BamHI и HindHI, 40 мкл дистиллированной воды. Смесь инкубировали при 37С в течение 1.5 ч и инактивировали добавлением 2 мкл 0.5 М ЭДТА.
Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков
Процедура выделения всех 4-х белков была идентичной. К влажной биомассе из 150 мл культуральной среды добавляли 5 мл буфера А (50 мМ Трис-НС1, 0.4 М NaCl, 2 мМ PMSF, рН 8.0), тритон Х-100 до концентрации 0.1% и гомогенизировали ультразвуком на дезинтеграторе High Intensity Ultrasonic Processor 750 Watt Series ("Cole Parmer", США) в течение 1 мин во льду. Суспензию осаждали центрифугированием при 13000 g в течение 10 мин, надосадочную жидкость собирали в отдельные пробирки (растворимая фракция белка). Растворимую фракцию белка (5 мл), к которой предварительно добавили имидазол до конечной концентрации 5 мМ, наносили на колонку с 1 мл насыщенной ионами никеля иминодиацетат-сефарозы, уравновешенную буфером I (0.05 М Трис-НС1, 0.4 М NaCl, 0.02 М имидазол, рН 8.0). Колонку промывали 10 мл буфера I и элюировали белок 5 мл буфера 11 (0.05 М Трис-НО, 0.15 М NaCl, 0.2 М имидазол, рН 8.0). Элюат диализовали против 1 л буфера III (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0) в течение ночи и хранили при -70С. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически или методом ВСА по протоколу фирмы "Sigma".
К 20 мкг исследуемого белка добавляли буферный раствор: 0,05М NaH2PC 4 рН 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 и 7.0, либо 0,05М Tris-HCI рН 7.0, 8.0 и 10.0 до конечного объема 100 мкл. УФ-спектр в диапазоне 200-380 нм. с интервалом 1 нм. снимался при помощи спектрофотометра BioRad Smart Spec 3000 в кювете объемом 100 мкл., длиной 100 мм. Численные значения оптической плотности передавались на персональный компьютер (ПК) с помощью 9 штыревого кабеля стандарта RS-232 и программного обеспечения Hyperterminal.
Для анализа спектральных данных использовалось ПО OriginPro 8. Для определения положения и величин сдвига пиков был применен алгоритм поиска скрытых пиков с помощью 2-й производной, размер сглаживающего окна — 5 точек.
К 20 мкг исследуемого белка добавляли 1.4 мкг пептида NS5, gplOO или Е7 и буферный раствор 0,05М Tris-HCl рН 8,0 до конечного объема 100 мкл. УФ-спектр в диапазоне 200-380 нм. с интервалом 1 нм. снимался при помощи спектрофотометра BioRad Smart Spec 3000 в кювете объемом 100 мкл., длиной 100 в течение 180 мин с интервалом 10 мин. Передача цифровых данных на ПК и математический анализ спектров производились, как описано в п. 5.1..
Гидролиз АТР тестировали колориметрическим методом по накоплению в реакции неорганического фосфата [30]. Реагент для определения неорганического фосфата: 2 мл 0.08% водного раствора малахитового зеленого, 2 мл 2.3% водного раствора поливинилового спирта, 1 мл 5.7% раствора (Ъ1Н4)бМо7024 4Н20 в 6н НС1 и 2 мл НгО. Реакцию проводили в реакционной смеси состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 2 мМ MgC , 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5% глицерин, 0.2 мМ АТР. Для определения скорости гидролиза 100 мкл реакционной смеси с исследуемым белком инкубировали при 30С в течение 30 мин, добавляли 400 мкл окрашенного реагента и определяли оптическое поглощение при длине волны 630 нм. В контрольном опыте аликвоту белка заменяли 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0. АТРазную активность измеряли в нмоль/мг-мин по калибровочной кривой. 2 мг пептида растворяли в 400 мкл 0.1М NaHCOs рН 8.8 и добавляли раствор FITC в DMSO (10 мг/мл) в молярном соотношении 1:1. Смесь инкубировали при перемешивании при комнатной температуре в течение 4-х часов. Меченый пептид отделяли методом ВЭЖХ на колонке Ci8. Элюировали градиентом от 0 до 100%) ацетонитрила в 0.1% TFA. Детекцию проводили при длине волны 495 нм.
Комплексы пептидов с белками HSP70 получали путем совместной инкубации 5-кратного избытка меченого FITC пептида с 40 мкг белка HSP70 в буферных растворах Buf рН 8.0 (100 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 2 мМ MgCl2) и Buf рН 6.0 (100 мМ Трис-HCl, рН 6.0, 2 мМ MgCb) в отсутствии или присутствии ADP в концентрации 1, 2 ,3 и 5 мМ. Инкубацию проводили в течение 30, 60, 90, 120 минут при температуре 4, 15, 25 и 37С После этого смесь наносили на колонку с 40 мкл предварительно уравновешенной соответствующим буферным раствором, насыщенной ионами никеля иминодиацетат-сефарозы. Сорбент дважды промывали 600 мкл буфера III центрифугированием (1500 об/мин, 1 мин, 15С) и связавшийся белок элюировали 100 мкл буфера II (составы буферов II и III в п. 4). Количество связавшегося меченого FITC пептида определяли по оптической плотности при длине волны 495 нм.
Комплексы смесей (1:1) меченого и немеченого пептидов с HSP70HYB получали путем совместной инкубации 5-, 10- и 20-кратного избытка пептидной смеси с 40 мкг белка в буферных растворах Buf рН 8.0 и Buf рН 6.0 (состав в п. 7.1.) в течение 60, 120 и 180 минут в присутствии 1мМ ADP. После этого смесь наносили на колонку с 40 мкл предварительно уравновешенной соответствующим буферным раствором, насыщенной ионами никеля иминодиацетат-сефарозы. Колонку дважды промывали 600 мкл буфера III центрифугированием (1500 об/мин, 1 мин, 15С) и элюировали 100 мкл буфера II. Элюат делили на 2 части для определения АТР-азной активности (п. 6) и количества связавшегося меченого FITC пептида (по оптической плотности при длине волны 495 нм).
Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных векторах
На основе известных последовательностей мРНК HSP70 и HSC70 человека (GenBank NM005346 и GenBank NM_ 006597) с помощью компьютерной программы DNA-SUN были получены рестрикционные карты ДНК-последовательностей транслируемой области генов этих белков для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции. По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации транслируемой области ДНК генов (CDS) семейства белков теплового шока HSP70A1 и HSC70.
Получение рекомбинантных экспрессионных плазмид осуществляли через промежуточное клонирование в pUC19 плазмиду отдельных фрагментов CDS, примерно соответствующих АТР- и пептид-связывающим доменам белков теплового шока для возможности создания гибридных белков.
Тотальную РНК выделяли из лимфоцитов человека, подверженных тепловому шоку. Комплементарную ДНК (кДНК) генов HSPA1B и HSPA8 человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (RT М-MuLV). В качестве затравки использовали праймер на З -нетранслируемую область мРНК. Амплификацию кДНК проводили с помощью ПЦР, используя три пары праймеров. В результате получили по два перекрывающихся фрагмента ДНК HSP70A1B и ДНК HSP70A8: N-концевой фрагмент (HSP70J и HSC70J) и С-концевой фрагмент (HSP70JI и HSC70_II в смеси), примерно соответствующие АТР- и пептид-связывающим доменам белков [171]. Фрагменты клонировали по Smal-сайту в плазмиде pUC19. Для этого рестриктированную Smal и дефосфорилированную плазмиду pUC19 лигировали с предварительно кинированными фрагментами ДНК. Лигазные смеси, содержащие плазмидную ДНК, трансфицировали в компетентные клетки E.coli JM109 модифицированным методом кальциевой трансформации с использованием буфера FSB с последующей селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей ампициллин. Скрининг клонов проводили методом ПЦР с помощью универсальных МІЗ/pUC праймеров ("Fermentas") по длине продуктов амплификации . Клоны, содержащие плазмиды со вставками HSP70II и HSC70_II, отбирали методом рестрикционного анализа соответствующих амплификатов, используя наличие в HSC70_II фрагменте уникального EcoRI сайта рестрикции. Отобранные колонии наращивали в среде LB с ампициллином. Из клеточной массы выделяли плазмиды и секвенировали встроенные фрагменты на генетическом анализаторе АВІЗ 10 ("Applied Biosystems", США).
Полноразмерную последовательность транслируемой области генов HSPA1B, HSC70 получали лигированием соотвественно фрагментов HSP70_I и HSP70_II и фрагментов HSC70_I и HSC70_II по сайту PstI, находящегося в области перекрывания этих фрагментов (рис. 6). Гибридные ДНК-последовательности белков HSP70HYB И HSC70HYB получали лигированием фрагментов HSP70_I и HSC70_II и фрагментов HSC70_I и HSP70_II по сайту PstI, соотвественно. Конструкции генов выделяли из промежуточных pUC19 плазмид после рестрикции ферментами BamHI и Hindlll и встраивали в полилинкер коммерческого экспрессионного вектора pQE80L по указанным сайтам рестрикции (рис. 6). Использование данного вектора позволяет при трансляции получать белки с несколькими дополнительными аминокислотами на N-конце: Met-Arg-Gly-Ser-(His)6-Gly-Ser- (далее обозначаемыми Hisag, рис. 6). Лигазные смеси, содержащие рекомбинантные экспрессионные вектора, трансфицировали в компетентные клетки E.coli JM109 модифицированным методом кальциевой трансформации с последующей селекцией на чашках Петри с агаризованной питательной средой LB, содержащей ампициллин. Отбор колоний с генной конструкцией проводили методом ПЦР с помощью стандартных праймеров и для pQE-векторов по длине продуктов амплификации. Отобранные колонии наращивали в среде LB с ампициллином и из клеточной массы выделяли экспрессионные рекомбинантные плазмиды для хранения.
Таким образом, получены четыре эксперессионные плазмиды pQE-hHSP70AlB, pQE-hHSP70HYB, pQE-hHSC70 и pQE-hHSC70HYB.
Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков теплового шока отдельныеные колонии E.coli JM109, трансформированные экспрессионными рекомбинантными плазмидами, наращивали в среде LB с ампициллином для оценки продуктивности, устойчивости к антибиотику и стабильности трансформации. Были получены следующие штаммы-продуценты: JM109/pQE-hHSP70AlB, JM109/pQE-hHSP70HYB, JM109/pQE-hHSC70, JM109/pQE-hHSC70HYB.
Суспензию клеток штамма-продуцента выращивали в среде LB в аэробных условиях с добавлением ампициллина (50 мкг/мл) в течение 3-4 часов до достижения оптической плотности Абоо 0,6-0,8. Синтез рекомбинантного белка индуцировали добавлением изопропилтио-Р-О-галактозида (IPTG), после чего инкубировали клетки еще 3-4 часа. Методом электрофореза в 12% полиакриламидном геле анализировали клеточный белок до и после индукции. Анализ показал, что все четыре штамма являются суперпродуцентами. На рисунке 7 для примера представлена электрофореграмма клеточных белков штамма JM109/pQE-hHSP70AlB. При индукции IPTG происходит эффективный биосинтез рекомбинантного HSP70MB ( 72 кДа), уровень которого составляет более 30% от суммарного клеточного белка (рис. 7, № 1,2). При этом рекомбинантный белок накапливается в клетках, как в растворимой форме, так и в виде телец включения, в примерно равном количестве (рис 7, № 3,4). В работе использовали растворимую клеточную фракцию, что позволило исключить трудоемкий процесс рефолдирования.
