Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ ВОЛН НА МИКРООРГАНИЗМЫ
ГЛАВА II. ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАЗВУКА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ КОКЛШШХ БАКТЕРИЙ И КОНСТРУИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ 24
ЧАСТЬ ВТОРАЯ. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА III. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 35
3.1. Исследование свойств коклюшных бактерий 35
3.2. Методы получения коклюшных антигенов 37
3.3. Методы изучения ультразвуковых коклюшных антигенов 37
3.4. Изучение химического состава антигенов 43
3.5. Электронно-микроскопические исследования коклюшных бактерий 44
3.6. Электронно-микроскопические исследования эритроцитов 45
3.7. Исследование электрофоретической подвижности эритроцитов 45
3.8. Методы вариационно-статистического анализа 46
ГЛАВА ІV. ИЗУЧЕНИЕ УСЛОВИЙ ВЫДЕЛЕНИЯ КОЮШШЫХ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ПРИ НИЗКОЧАСТОТНОМ УЛЬТРАЗВУКОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ 48
4.1 Характеристика ультразвуковых коклюшных дезинтегратов и антигенных комплексов 48
4.2. Электронно-микроскопическое исследование коклюшных бактерий 58
4.3. Изучение хшического состава ультразвуковых коклюшных антигенных комплексов 62
4.4. Некоторые пути совершенствования режима ультразвуковой дезинтеграции для выделения коклюшных антигенов 65
4.5. Изучение особенностей биологического эффекта ультразвука при фракционирован
ном воздействии 74
ГЛАВА V. КОНСТРУИРОВАНИЕ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ КОКДКШЫХ АНТИГЕННЫХ ЭРЙТРОЦИТАРНЫХ ДИАШОСТИКУМОВ 82
5.1. Определение оптимального режима сенсибилизации эритроцитов ультразвуковыми коклюшными антигенами 83
5.2. Изучение возможности повышения сорбционных свойств эритроцитов при ультразвуковом воздействии 91
5.3. Изучение некоторых биофизических характеристик мембран эритроцитов при обработке их ультразвуком в различных режимах и в сочетании с танином 98
5.4. Электронно-микроскопическое изучение морфологии эритроцитов 103
5.5. Изучение срока хранения ультразвуковых коклюшных антигенных эритроцитарных диагностикумов 107
5.6. Применение ультразвуковых коклюшных антигенных эритроцитарных диагностикумов
для исследования сыворотки крови детей 112
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 116
ВЫВОДЫ 128
УКАЗАТЕЛЬ ЛИТЕРАТУРЫ 131
ПРИЛОЖЕНИЯ І62
- МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ УЛЬТРАЗВУКОВЫХ ВОЛН НА МИКРООРГАНИЗМЫ
- ПРИМЕНЕНИЕ УЛЬТРАЗВУКА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННЫХ СУБСТАНЦИЙ КОКЛШШХ БАКТЕРИЙ И КОНСТРУИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНЫХ ДИАГНОСТИКУМОВ
- Исследование свойств коклюшных бактерий
- Характеристика ультразвуковых коклюшных дезинтегратов и антигенных комплексов
- Определение оптимального режима сенсибилизации эритроцитов ультразвуковыми коклюшными антигенами
Механизм действия ультразвуковых волн на микроорганизмы
В настоящее время в связи с проведением научных исследований в микробиологии на субклеточном и молекулярном уровне весь-ка Еажным представляется выбор оптимального метода воздействия на микробную клетку с целью получения необходимых морфологических, физиологических изменений, извлечения активных субстанций клетки (Б.А. Фихте, 1972,1978; И.Е. Элышнер, 1973; Е.П. Москаленко, 1975), Дезинтеграция является первым и наиболее важным этапом при получении субклеточных препаратов. Правильно выбранный метод дезинтеграции определяет полноценность выделяемых субклеточных структур.
Для дезинтеграции микроорганизмов в настоящее время используется свыше 100 различных методов, модификаций и число их непрерывно растет. По мнению большинства исследователей, необходимость в различных методах дезинтеграции неизбежна и обусловлена, во-первых, неодинаковой устойчивостью различных видов микроорганизмов к дезинтегрирующим воздействиям и, во-вторых, диапазоном задач, решаемых в связи с использованием данных методов.
Методы дезинтеграции условно разделяют на механические, физические, химические и биологические (Е.С. Станиславский, М.И. Жва-нецкая, 1972). -физические методы дезинтеграции включают действие таких факторов, как Еысокое давление, ультразвуковые и звуковые волны, электрический разряд, температурные факторы. Механические методы предусматривают встряхивание микробной суспензии с мелкими стеклянными бусами диаметром 0,12-0,15 мм в специальных дезинтеграторах. Химические методы основаны на действии химических факторов на микроорганизмы, таких как детергенты (доде-цилсульфат, дезоксихолат, тритон Х-100 и т.д.), кислоты, щелочи, ферменты. Б.А. Фихте (1972) предлагает Еыделить в отдельную группу энзиматические (ферментативные) методы дезинтеграции.
Очевидно, что такое разнообразие методов не только не облегчает, но и значительно осложняет выбор оптимального и свидетельствует об эмпирическом уровне познания в этой области.
Эта широко применяемая до последнего времени классификация методов дезинтеграции микроорганизмов основана на отвлеченном критерии физической, химической, механическом или биологической природы дезинтегрирующего воздействия (Б.А. Фихте, Г.А. Гуревич, А.А. Кудрявцев, 1978). Изучение литературных данных позволило Б.А. Фихте с соавт. (1978) предложить более рациональную классификацию методов дезинтеграции, основанную на комплексных критериях. В этой классификации учитывается не только природа дезинтегрирующего воздействия, но и масштабность использования данного метода и возможности в области усовершенствования.
Применение ультразвука для выделения антигенных субстанций коклшшх бактерий и конструирования эритроцитарных диагностикумов
Для определения локализации в микробных клетках и выделения иммунологииески активных субстанций необходимо использовать такие методы дезинтеграции, которые позволяют сохранить эти компоненты наиболее полноценными. Пристальное внимание исследователи уделяют изучению антигенной структуры коклюшных бактерий, локализации отдельных субстанций в микробной клетке и выявлению их роли в создании невосприимчивости к инфекции.
Антигенная структура возбудителя коклюша отличается сложностью. У данных микроорганизмов различают такие иммунологически активные субстанции как агглютиноген, гемагглютинин (ГА), четыре токсические субстанции: термолабильный токсин (ТЛТ), термостабильный (ТСТ) или эндотоксин, лейкоцитозстимулирующий фактор (ЛСФ), гистаминсенсибилизирующий фактор (ГСФ) и протективный антиген (ПА).
Широкое применение ультразвука для выделения и изучения антигенов коклюшных бактерий объясняется прежде всего высокой экстрагирующей способностью данного фактора (Е.А. Петросян с соавт., 1964; И.А. Лаиаева, 1973; А.А. Гуреева с соавт.,1976) и отсутствием в дезинтеграте посторонних химических примесей.
Перспективность применения ультразвуковых волн иллюстрируют данные, полученные И.А. Лапаевой (1973). Антигенные комплексы коклюшных бактерий, полученные автором в результате ультразвукового воздействия, содержали до 12 парциальных антигенов, выявленных в РП, в то время как применение для этих целей таких химических агентов, как дезоксихолат натрия и додецилсульфат позволило выделить, соответственно, 7 и 5 парциальных антигенов.
Ультразвуковые волны в сочетании с помледущим действием различных химических факторов были широко использованы для выделения и изучения различных антигенов коклюшных бактерий. Так, с помощью ультразвука были выделены препараты агглютиногена коклюшных бактерий (А.В. Мешков и др., 1958; И.А. Лапаева, Мукке, 1968; Л.В. Жулина, И.П. Багдасаров, 1971; Hosdorf et al., 1940; smolens et al., 1943; Nakase, Kasuga, 1971).
При изучении агглютиногена исследователи предполагают его поверхностную локализацию, связь с оболочечными структурами и отмечают его неоднородность. По некоторым предположениям, в составе агглютиногена насчитывается не менее 7 фактороЕ (Л.В. Жулина с соавт., 1971,1972 а,б). E.G. Станиславский (1971,1972) предполагает идентичность 14 антигенных факторов микробов ряда Bordeeiia и 14 типов агглютиногена. Установлено, что агглютиногены не обладают протективной активностью (М.С. Захарова, 1971,1975; М.С. Захарова, Л.В. Жулина, И.П. Багдасарова, 1972; Nakase , 1971). Экспериментальные исследования ishii (1963) позволили предположить роль агглютиногена в усилении инвазивных свойств возбудителя коклюша.
Исследование свойств коклюшных бактерий
Для изучения дезинтегрирующего действия ультразвука и выделения коклюшных антигенных комплексов нами были использованы три штамма коклюшных бактерий - 222, 305 и 345.
Для культивирования коклюшных бактерий применяли картофельно-глицериновый агар Борде-Жангу, а также казеиново-угольный агар (КУА), приготовленный с использованием кислотного гидролизата казеина и дрожжевого диализата в производственном отделе Ростовского научно-исследовательского института эпидемиологии, микробиологии и гигиены.
Биохимические свойства коклюшных бактерий изучали путем посева в развернутый "пестрый" ряд. Среды для этого готовили на I % пептонной воде, добавляя 0,5 % соответствующего углевода и I % индикатора Андреде. В каждую пробирку добавляли 7-Ю капель сыворотки крупного рогатого скота. Для посева использовали двухсуточную культуру коклюшных бактерий, выращенных на среде Борде-Жангу с добавлением дефибринированной человеческой крови.
Кроме того, исследовали способность коклюшных бактерий в мясо-пептонном бульоне с добавлением сьторотки крупного рогатого скота расщеплять белки до индола и сероводорода.
Гемолитические свойства коклюшных бактерий изучали на карто-фельно-глицериновой среде, содержащей 10 % человеческой дефибринированной крови. Посевы выдерживали в термостате при + 37 С двое суток и затем при комнатной температуре в течение 24 часов.
Обычно слабый гемолиз эритроцитов отмечали через 48 часов термо-статирования, но наиболее четкие результаты выявляли после дополнительного 24 -часового выдерживания посевов при комнатной температуре,
Гемагглютинирущие свойства коклюшных бактерий изучали по методу, описанному СП. Ивановой (1955,1956). При этом культуру коклюшных бактерий, выращенную на среде Борде-Жангу с добавлением человеческой крови, суспендировали в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, доводили густоту взвеси до 10 MEM/мл. Затем к 0,5 мл суспензии бактерий добавляли 0,5 мл 2,0 % взвеси эритроцитов человека, предварительно трижды отмытых физиологическим раствором. Учет реакции проводили после двухчасового контакта ингредиентов при комнатной температуре.
Характеристика ультразвуковых коклюшных дезинтегратов и антигенных комплексов
Несмотря на длительную историю ультразвуковой дезинтеграции микроорганизмов, широкое практическое использование методов в различных областях экспериментальной и прикладной микробиологии (Е.П. Москаленко, 1975; Е.С. Станиславский с соавт., 1978), отсутствие строгой теории и недостаточность метрологического обеспечения процессов ультразвуковой дезинтеграции зачастую заставляет исследователей эмпирически, в зависимости от экспериментальной интуиции, известных опытных данных составлять схемы воздействия. При этом подбор оптимальных режимов действия данного фактора должен находиться в строгой зависимости от цели и последущих задач исследования.
Целью первых этапов исследования явилась разработка оптимальных условий выделения активных антигенных комплексов из коклюшных бактерий при использовании оригинальной низкочастотной ультразвуковой установки ДБУ-01 в так называемой "статической" системе, имеющей неизменный объем. Аппаратура разработана отделом медицинской электроники и акустики совместно с кафедрой микробиологии и вирусологии $ Z Ростовского ордена Дружбы народов медицинского института по заданию Всесоюзного научно-исследовательского и испытательского института медицинской техники и специально предназначена для микробиологических исследований.
Определение оптимального режима сенсибилизации эритроцитов ультразвуковыми коклюшными антигенами
Для выявления оптимальных условий конструирования ультразвуковых коклюшных антигенных эритроцитарных диагностикумов были изучены такие параметры, как концентрация водородных ионов, температура, экспозиция сенсибилизации, доза сенситина. В качестве сорбентов применяли формалинизироЕанные эритроциты барана, приготовленные по методу Cismas (I960) в модификации М.И. Леви с сотр. (1962) и дополнительно обработанные таниноЕой кислотой по методу Boyden (1951), способствущему освобождению эритроцитарных рецепторов к протеинам.
Формалинизироваиные эритроциты барана отмывали от консерванта стандартным солевым раствором (ССР), осаждали центрифугированием, супернатант сливали, а осадок эритроцитов доводили стандартным солевым раствором до концентрации 2,5 %, Полученную суспензию соединяли с раЕНым объемом приготовленного ex tempore раствора таниновой кислоты до конечной концентрации танина 1:20000. Смесь инкубировали при +37 G в течение 15 минут, трижды отмывали центрифугированием от излишков реагента 5-6 -кратными объемами ССР. Осадок эритроцитов после декантирования доводили ССР до 2,5 % концентрации, добавляли соответствующий цитратно-фосфатный буфер. В процессе исследований изучено Елияние концентрации водородных ионов на процесс сенсибилизации в диапазоне значений рН 3,0 - 8,0 (3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 6,4; 7,0; 8,0).
К полученной взвеси эритроцитов с определенным значением рН добавляли ультразвуковой коклюшный антиген в кидком виде в количестве 50-800 ГЕ или 2,5-80 мкг по белку (при коэффициенте разведения 2) на 10,0 мл 2,5 %-й эритроцитарной ЕЗВЄСИ. Сенситин до-зироЕали по активности в РПГА, кроме того, контролировали содержание в нем белка.
Смесь эритроцитов и антигена в заранее определенных дозах инкубировали при температуре +4 С, +22 С, +37 С в течение 2, 4, 18 часов. За час до окончания процесса сенсибилизации для фиксации антигена на поверхности эритроцитов добавляли раствор нейтрального формалина до конечной концентрации I %» После окончания сенсибилизации эритроциты отмывали ССР и хранили в ЕИДЄ 2,5 % взвеси при температуре +4 С с добавлением в качестве консерванта I % формалина.
Активность ультразвуковых антигенных эритроцитарных диагности-думов исследовали в РПГА с коклюшной агглютинирующей сывороткой, специфичность полученных результатов подтЕерадали в РТПГА, а также при постановке РПГА с гетерологической системой.
В опытах по установлению оптимальных условий сенсбилизацик (рН среды, температуры, экспозиции, концентрации антигена) получено и исследоЕано 342 серии диагностикумов.
