Введение к работе
Актуальность проблемы. Обстановка в стране по бруцеллезу остается напряженной и определяется наличием инфекции среди сельскохозяйственных животных, являющихся в Российской Федерации основным источником заболеваний людей, регистрирующихся в большинстве случаев на территориях с развитым овцеводством. Одним из самых неблагополучных регионов страны по данной инфекции является Северный Кавказ, на долю которого в 2000 году приходилось 53 % общероссийской заболеваемости бруцеллезом [Желудков М.М., Горшенко В.В., 2002].
В Ставропольском крае во многих животноводческих хозяйствах обстановка по бруцеллезу остается достаточно неблагоприятной, а заболеваемость людей этой инфекцией имеет тенденцию к росту. Ежегодно спорадические случаи заболевания людей отмечаются в большинстве административных районов края, 90 % из которых зарегистрировано в хозяйствах, ранее считавшихся благополучными по бруцеллезу. При сложившейся в настояще'е время эпизоотической и эпидемической обстановке существует прогноз неблагоприятной эпидемиологической ситуации по бруцеллезу в крае в последующие годы [Таран И.Ф., 2002].
Рост заболеваемости в регионах с развитым животноводством ведет к огромным экономическим потерям. Болезнь наносит моральный ущерб человеку, лишая его активной трудовой деятельности. Бруцеллез остается одной из самых сложных проблем инфекционной патологии. На фоне стойкого неблагополучия по бруцеллезу сельскохозяйственных животных, наблюдающегбся роста заболеваемости данной инфекцией людей, и утяжеления ее течения отмечается снижение эффективности в лечении заболевания ранее применявшихся антибиотиков, связанное сих низкой способностью проникать внутрь клетки и с развивающейся резистентностью бруцелл к ним. В связи с этим возникла потребность в расширении арсенала противомикробных' средств лечения бруцеллеза и в совершенствовании методов комплексной терапии этого заболевания.
В последние годы появилось значительное количество антимикробных препаратов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с ранее синтезированными антибиотиками и обладающих способностью проникать внутрь клетки, эффективность которых влечении бруцеллезной инфекции не изучена.
Длительное течение бруцеллезной инфекции с формированием хронических и затяжных форм является следствием особенности патогенезаданного заболевания, связанной с развитием вторичных иммунодефицитных состояний. Формирование выраженной иммунодепрессии способствует накоплению в фагоцитарных клетках крови жизнеспособных бруцелл и их размножению. На фоне подавленной иммунореактивности снижается клинический эффект применения антимикробных средств [Лусс Л.В. с соавт., 2000; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2000; Петров Р.В. с соавт., 2000]. Одним из путей повышения результативности этиотропного лечения бруцеллеза может быть тактика комбинированной терапии путем воздействия антибактериальными препаратами на микроб с одновременным стимулированием защитных механизмов организма.
Внутриклеточное паразитирование бруцелл препятствует непосредственному действию на них антимикробных средств и создает значительные трудности при лечении бруцеллеза. В связи с этим вполне естественны поиски новых форм лекарственных препаратов и их комбинаций, которые обеспечивали бы проникновение лекарств в клетки. Одним из вариантов носителей, позволяющих доставлять терапевтические средства внутрь клеток, являются липосомальные везикулы [Bachhawat В.К.,1985; Jaeschke Н. et al., 1987; Давьщов В.Ю, с соавт., 1996]. Препараты, включенные в липосомы, оказываются более эффективными для достижения терапевтических целей [Ефременко В.И., 1999]. Их применение позволяет снизить дозу антибиотиков при сохранении эффективности лечения [Закревский В.И., 1985; Марголис Л.Б., Бергельсон Л.Д., 1986; Ротов К.А. с соавт., 1995; Merei М., MeseiA, 1988]:
Снижения вероятности перехода бруцеллезной инфекции в хроническую форму можно достичь с помощью увеличения эффективности этиотропного лечения при использовании различных направлений: тщательного выбора антибактериальных средств, высокоактивных в отношении бруцелл; взвешенного воздействия иммунотропными препаратами на иммунный статус больного с целью повышения его защитных функций; применения лекарственных форм, позволяющих осуществлять целенаправленную доставку препаратов.
Цель исследования
Научно-экспериментальное обоснование путей повышения эффективности лечения бруцеллеза на основе изучения интенсивности элиминации бруцелл из организма и изменения некоторых факторов иммунологической реактивности
макроорганизма при применении новых антибактериальных и иммунокорригирующих средств, в том числе, заключенных в липосомы.
Основные задачи исследования 1. Экспериментально обосновать выбор новых перспективных для лечения бруцеллеза антибактериальных средств путем оценки их антимикробного действия на бруцеллы in vitro и влияния на интенсивность элиминации бруцелл из макроорганизмав сравнении с действием традиционно используемых при бруцеллезе антибиотиков. Подобрать эффективные дозы препаратов и схемы их введения.
-
Изучить влияние иммунокорригирующих препаратов (глу-токсима, ликопида и полиоксидония) на результаты этиотропной терапии бруцеллеза. Определить оптимальные дозы иммуномодуляторов и время их введения.
-
Изучить эффективность перорального применения липосомальных форм антибиотиков и иммуномодуляторов при бруцеллезной инфекции, а также влияние «пустых» липосомальных везикул на результаты терапии этого заболевания. Экспериментально обосновать оптимальный вариант возможных сочетаний липосомальных форм антибиотика и иммуномодулятора для комплексного лечения бруцеллеза.
-
Изучить динамику изменений некоторых показателей клеточного и гуморального иммунитета при лечении экспериментального бруцеллеза традиционно используемыми, а также новыми антимикробными препаратами, иммуномодуляторами и липосомами.
-
Разработать методы контроля эффективности этиотропного лечения бруцеллеза на основе цитоэнзимохимических методов исследования клеток периферической крови и на основе ПЦР-анализа.
Научная новизна
- впервые проведено комплексное изучение взаимоотношений
«микроб-хозяин» в различных, модельных системах при лечении
бруцеллеза свободными илипосомальными формами антибиотиков
и иммуномодуляторов и их сочетаниями;
- впервые предложены для лечения бруцеллеза проти-
вомикробные препараты: ломефлоксацин, меропенем, азитромицин,
позволяющие расширить арсенал средств антибактериальной
терапии бруцеллеза. Показано преимущество азитромицина по
сравнению с традиционно используемыми антибиотиками и
другими изученными препаратами - доксициклином, гента-мицином,рифампицином, пефлоксацином, ломефлоксацином и меропенемом;
показана активация неспецифической резистентности макроорганизма к возбудителю данного заболевания под действием свободных и липосомальных форм иммуномодуляторов. Впервые предложены иммунотропные средства для проведения иммуно-коррекции при бруцеллезе - глутоксим, ликопид, полиоксидоний. Установлено преимущество сочетанного применения азитромицина с левамизолом, глутоксимом, ликопидом и полиоксидонием над самостоятельным введением данного антибиотика. Показано преимущество полиоксидония по сравнению с левамизолом, глутоксимом и ликопидом;
установлено, что интактныелипосомальные везикулы влияют на скорость элиминации бруцелл из организма беспородных белых мышей и величину показателей некоторых факторов клеточного и гуморального иммунитета животных;
впервые выявлено преимущество липосомальных форм пефлоксацина, ломефлоксацина, меропенема, азитромицина, левамизола и ликопида над их свободными формами при этиотропной и иммунокорригирующей терапии бруцеллеза. Установлено, что включение доксициклина и гентамицина в липосомы позволяет при лечении этой инфекции заменить их инъекционные формы пероральными;
экспериментально показано, что при бруцеллезе оптимальной схемой лечения является сочетание антибиотика и иммуномодулятора, включенных в индивидуальные липосомальные везикулы;
выявлена зависимость показателей некоторых неспецифических, факторов клеточного (содержание катионных белков и гликогена, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови) и гуморального (активности лизоцима легких) иммунитета от эффективности лечения бруцеллезной инфекции антибиотиками, иммуномодуляторами и липосомальными везикулами;
предложены способ контроля эффективности антибиотика при лечении бруцеллеза с использованием цитоэнзимохимических методов исследования клеток периферической крови (Патент РФ № 2206898) и способ контроля эффективности проведенной антибиотикотерапии с помощью ПЦР-анализа;
установлено, что величина титра специфических антител при лечении бруцеллеза находится в обратной зависимости от степени активности используемых при этом лечебных препаратов -антибиотиков, иммуномодуляторов или липосомальных везикул;
- результаты проведенных исследований являются научно-экспериментальным обоснованием совершенствования существующих в практическом здравоохранении средств этиотропной терапии бруцеллеза и позволяют раскрыть некоторые механизмы влияния бруцеллезной инфекции и ее лечения на факторы клеточного и гуморального иммунитета, что, несомненно, представляет теоретический интерес.
Практическая значимость работы
В процессе проведения экспериментальных исследований отработаны методы получения липосомальных форм антибиотиков, что нашло отражение в методических рекомендациях «Иммобилизация в липосомы веществ различной химической природы. Стерилизация и стабилизация липосом», утвержденных на федеральном уровне первым заместителем министра здравоохранения РФ, главным государственным санитарным врачом России Г.Г.Онищенко 6 апреля 2000 г. Разработанные в эксперименте схемы лечения бруцеллеза липосомальными формами доксициклина, гентамицина, рифампицина, пефлоксацина, меропенема и азитромицина изложены в методических рекомендациях «Схемы лечения особо опасных инфекционных заболеваний (бруцеллез, сибирская язва, туляремия) липосомальными антибиотиками», которые утверждены директором СтавНИПЧИ на региональном уровне 26 октября 2001 г. (протокол № 9). Предложены новые антибактериальные и иммуномо-дулирующие средства для лечения бруцеллезной инфекции, что нашло отражение в методических рекомендациях «Бруцеллез. Эпизоотолого-эпидемиологический надзор, лабораторная диагностика, клиника, лечение, диспансерное наблюдение за больными», утвержденных на федеральном уровне первым заместителем министра здравоохранения РФ главным государственным санитарным врачом России Г.Г.Онищенко 12 февраля 2004 г. Предложен способ, контроля эффективности антибиотикотерапии и составлены «Методические рекомендации-по использованию цитоэнзимохимических показателей для контроля лечения антибиотиками бруцеллезной инфекции», утвержденные директором СтавНИПЧИ 28 апреля 2003 года на региональном уровне (протокол № 4). Разработанные критерии выбора иммуномодуляторов, применяемых при лечении бруцеллеза, изложены в «Методических рекомендациях по изучению эффективности иммунокорригирующих препаратов в лечении бруцеллеза», которые утверждены директором СтавНИПЧИ 26 июня 2003 года на учрежденческом уровне (протокол № 6). Усовершенствованы схемы лечения бруцеллеза посредством
включения антибиотиков и иммуномодуляторов в липосомы и путем сочетанного применения антибиотиков с иммуномодуляторами, что служит основанием для их последующего внедрения в практическое здравоохранение. Результаты работы используются в практической работе Ставропольского краевого центра по лечению и диагностике бруцеллеза, а также включены в план лекционных и семинарских занятий учебного процесса кафедры инфекционных болезней Ставропольской государственной медицинской академии и в план подготовки специалистов на курсах повышения квалификации и специализации по особо опасным инфекциям при СтавНИПЧИ.
Диссертационная работа выполнена в рамках государственных тем НИР: № ГР 01200004621 «Изучение эффективности новых антибактериальных и иммуномодулирующих препаратов при лечении экспериментальной бруцеллезной инфекции», № ГР 01897080 «Изучение эффективности липосомальных форм иммуномодуляторов при особо опасных зоонозных инфекционных заболеваниях» и темы «Конструирование липосомальных форм антибиотиков и разработка схем лечения особо опасных инфекционных заболеваний (бруцеллез, туляремия, сибирская язва)» по договору № 422-Д от 03.07.2001 в соответствии с Федеральной Целевой Программой «Защита от патогенов».
Положения, выносимые на защиту
-
Впервые изученные при экспериментальном бруцеллезе новые антибактериальные средства - фторхинолон ломефлоксацин, беталактамный антибиотик карбапенемного ряда меропенем, макролидный препарат азалидного ряда азитромицин эффективны при лечении данного заболевания.
-
Иммунокорригирующие препараты глутоксим, ликопид и полиоксидоний повышают эффективность этиотропной терапии бруцеллезной инфекции.
-
Липосомальные формы антибиотиков и иммуномодуляторов, а.также «пустые» липосомальные везикулы при пероральной терапии экспериментального бруцеллеза увеличивают интенсивность элиминации бруцелл из макроорганизма и повышают эффективность лечения заболевания.
А. Показатели неспецифического клеточного (содержание катионных белков и гликогена, активности миелопероксидазы в нейтрофилах и сукцинатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови) и гуморального (активности лизоцима легких) иммунитета свидетельствуют об эффективности комплексной терапии бруцеллеза, включающей применение антибиотиков, иммуномодуляторов и (или) липосом.
5. Цитоэнзимохимические методы исследования клеток периферической крови и ПЦР-анализ обеспечивают быстрый и точный контроль эффективности этиотропного лечения бруцеллеза.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на научных конференциях СтавНИПЧИ (Ставрополь, 2000-2003); на научно-практической конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); на международной конференции «Проблемы биологической безопасности» (Оболенск, 2000); на научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001); на научно-практической конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции МЗ РФ «Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); на международной научно-практической конференции «Современный эпидемиологический потенциал природных очагов чумы», посвященной 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочумной станции (г. Талдыкорган, 2001); на международной научной конференции «Природно-очаговые инфекционные болезни» (Уланбатор, 2001); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию Дагестанской противочумной станции (Махачкала, 2002); на научно-практической конференции, посвященной 50-летию Ставропольского научно-исследовательского противочумного института «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе. Итоги и перспективы» (Ставрополь, 2002).
Публикации
Основное содержание диссертации изложено в 41 опубликованной работе.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 237 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, шести глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 428 источников, в том числе 265 работы отечественных и 163 - зарубежных авторов. Материалы исследований иллюстрированы 24 таблицами и 24 рисунками.
