Введение к работе
Актуальность темы. Данная работа посвящена изучению молекулярных механизмов гормональной регуляции транскрипции. Известно, что адаптивные свойства гормонов, как правило, реализуются через взаимодействие с геномом клетки, приводя к усилению экспрессии или, напротив, к супрессии отдельных генов. Несмотря на пристальное внимание ученых к данной проблеме многие этапы этого взаимодействия до сих пор неясны. Достаточно полно изучены молекулярные механизмы индукции ключевых ферментов глюконеогенеза при участии гормонов пучковой зоны коры надпочечников и цитозольного рецептора этих гормонов (Mangelsford D. J. et al., 1995; Libri V. et al., 2004). Однако механизмы взаимодействия гормон-рецепторных комплексов с ДНК изучены недостаточно.
В Институте биохимии СО РАМН ранее было открыто явление стимуляции резидентными макрофагами биосинтеза белка в паренхимных клетках органов и тканей в процессе регенерации, в котором принципиальную роль играли стероидные гормоны и липопротеины высокой плотности 3 подкласса (ЛПВП3) (Панин Л.Е., Усынин И.Ф., Харьковский А.В., 1994; 1999). Показано, что функцию переносчика стероидных гормонов в ядра клеток в данном механизме выполняет аполипопротеин A-I (апоA-I) (Панин Л.Е. и др., 1992). Образование биологически активного комплекса стероидный гормон-аполипопротеин A-I протекает в резидентных макрофагах. Затем осуществляется перенос данного комплекса в ядра соматических клеток, где он взаимодействует с депротеинизированными участками ДНК с последующим усилением экспрессии генов. Молекулярные механизмы данного явления во многом еще не раскрыты. К ним следует отнести определение сайтов взаимодействия комплексов стероидный гормон-аполипопротеин A-I с ДНК и их роль в активации транскрипции. Так, ранее было показано, что комплекс стероидный гормон (тетрагидрокортизол, дегидроэпиандростерон-сульфат)-аполипопротеин A-I взаимодействует преимущественно с GCC/CGG-последовательностями в изолированной ДНК (Панин Л.Е. и др., 2002; Panin L.E. et. al., 2003). Однако ряд деталей этого взаимодействия можно выяснить только на синтетических олигонуклеотидах, а не на нативной ДНК. Сегодня это важное и недостающее звено в изучении не только механизмов усиления экспрессии генов, но и копирования ДНК. Решение этих вопросов чрезвычайно актуально для понимания молекулярных механизмов гормональной индукции синтеза белков, их роли в процессах регенерации и пролиферации клеток.
Цель и задачи исследования
Целью данного исследования являлось изучение молекулярных механизмов действия комплексов стероидный гормон (тетрагидрокортизол, кортизол)-аполипопротеин A-I на вторичную структуру синтетических олигонуклеотидов вида (gCC)n и их комплементарных дуплексов, а также на транскрипцию ДНК крысы.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Установить возможные нуклеотидные последовательности сайтов связывания комплексов стероидный гормон-апоA-I (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) с ДНК. Определить устойчивость их к действию ДНКазы I и нуклеазы S1 после взаимодействия с комплексом тетрагидрокортизол-апоА-I;
2. Изучить воздействие комплексов стероидный гормон-апоA-I (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) на вторичную структуру синтетических олигонуклеотидов и их комплементарных дуплексов;
3. Оценить влияние метилирования олигонуклеотидов вида (gCC/ggC)n на их взаимодействие с комплексом стероидный гормон-апоА-I;
4. Исследовать влияние комплексов стероидный гормон-апоA-I на транскрипцию ДНК in vitro.
Научная новизна работы
Впервые определены минимально достаточные нуклеотидные последовательности, специфично взаимодействующие с комплексом тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I. Найдены концевые нуклеотиды последовательностей, усиливающие связывание с указанным комплексом. Показано, что последовательность, связывающая комплекс тетрагидрокортизол-аполипопротеин A-I и недоступная действию нуклеаз, представляет собой 5`-gg(Cgg)3T3.
Впервые показано, что метилирование оснований в нуклеотидах CpG не препятствует связыванию олигонуклеотидного дуплекса вида gCC/ggC с комплексом ТГК-апоА-I. На модельных олигонуклеотидных дуплексах AnCC(gCC)3gg(Cgg)3Tn (n=0, 3 и 6) доказано «расплетающее» действие комплекса ТГК-апоА-I.
Впервые показано, что комплекс тетрагидрокортизол-аполипопротеин А-I дозозависимо активирует транскрипцию ДНК крысы in vitro, выполняя роль, подобную роли транскрипционного фактора, изменяющего структуру ДНК в сайтах связывания, в процессе транскрипции.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные вносят существенный вклад в понимание молекулярных механизмов гормональной регуляции синтеза белков в соматических клетках. Показано, что важную роль в этих механизмах играет такой адресный переносчик стероидных гормонов в ядра клеток как аполипопротеин А-I. Определение минимально достаточного сайта связывания ДНК с комплексом стероидный гормон-аполипопротеин А-I и особенности их взаимодействия существенно дополняют современные представления о структурно-функциональной организации генома эукариот. Полученные данные раскрывают новые механизмы гормональной регуляции экспрессии генов, их роли в регенерации и пролиферации клеток, в том числе, и при опухолевых процессах. Полученные результаты могут быть использованы при обосновании новых методов коррекции и лечения как пролиферативных, так и дегенеративно-деструктивных процессов в органах и тканях.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Аполипопротеин A-I в составе комплекса со стероидными гормонами (где стероидный гормон – ТГК или кортизол) имеет высокое сродство как к природной ДНК, так и к GC-богатым синтетическим олигодезоксирибонуклеотидам разного состава.
-
Связывание комплекса ТГК-апоA-I с олигонуклеотидными дуплексами вида (gCC/Cgg)n приводит к образованию одноцепочечных (S1-нуклеазочувствительных) участков. Метилирование оснований в нуклеотидах не препятствует связыванию комплекса ТГК-апоA-I с комплементарным дуплексом.
-
Минимально достаточная для связывания комплекса ТГК-апоA-I нуклеотидная последовательность, недоступная действию S1 нуклеазы и ДНКазы I, представляет собой олигонуклеотид gg(Cgg)3T3.
-
Транскрипция in vitro ДНК крысы, катализируемая РНК-полимеразами белкового экстракта ядер из клеток печени, дозозависимо активируется комплексом ТГК-апоА-I; но при 200-кратном мольном избытке комплекса транскрипция ингибируется полностью.
Апробация работы и публикации
Материалы диссертации изложены в 4 публикациях и были представлены на международной школе молодых ученых (BGRS, Новосибирск, 2005 г.), доложены на ученом совете Института Биохимии СО РАМН.
Структура и объем работы: диссертация изложена на 137 страницах машинописного текста, включая 2 таблицы и 22 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературных источников содержит 195 ссылок, включая 57 отечественных.
-
Выделение ЛПВП методом изоплотностного ультрацентрифугирования (Hatch F. T., Less R. S., 1968).
-
Выделение апоА-I из апоЛПВП методом электрофореза по Лэммли (Laemmli U. K., 1970) в препаративном варианте.
-
Выделение нативной ДНК из печени крысы линии Вистар (Karlinsey J. et al., 1989).
-
Выделение белкового экстракта из ядер клеток печени крысы по (Dignam J. D. et al., 1983) с собственными модификациями.
-
Аффинная хроматография олигонуклеотидов.
-
Введение 32Р-метки в олигонуклеотиды (Маниатис Т. и др. 1984).
-
Титрование растворов олигонуклеотидов, комплементарных дуплексов и ДНК комплексами стероидный гормон-апоА-I (Гимаутдинова О. И. и др., 1998).
-
Ферментативный анализ структуры олигонуклеотидов, ДНК и их продуктов с применением нуклеазы S1 (Vogt V.M., 1973), ДНКазы I (Sambrook J., et al., 1989), метилазы M.Fsp4HI и рестриктазы Fsp4HI (Zingg J. M., Jones P. A., 1997; Власова Т. И. и др., 1996).
-
Реакция транскрипции на матрицах ДНК крысы и хроматина in vitro.
-
Электрофорез олигонуклеотидов, ДНК и РНК в полиакриламидном геле.
