Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Ауторегуляторные di-факторы микроорганизмов и возможность их воздействия на генетический аппарат бактериальной клетки 10
1.1. Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку 12
1.2. Основные закономерности взаимодействия низкомолекулярных лигандов с ДНК 23
Глава 2. Материалы и методы исследований 33
2.1. Объекты исследования. Приготовление образцов 34
2.2. Оптические методы , 36
2.2.1. Измерение спектров поглощения 36
2.2.2. Регистрация спектров люминесценции 39
2.2.3. Термическая денатурация ДНК и измерение оптической плотности 40
2.3. Капиллярная вискозиметрия 42
2.4. Электрофорез в агарозном геле 43
2.5. Методы микроскопии 44
2.5.1. Атомно-силовая микроскопия 44
2.5.2. Сканирующая электронная микроскопия 47
2.6. Методы статистической обработки результатов 48
Глава 3. Доказательства взаимодействия ауторегуляторных di-факторов с ДНК 49
3.1. Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК . 50
3.2. Определение характера взаимодействия di-факторов с ДНК люминесцентным методом 54
3.3. Визуализация комплексов ДНК с с!гфакторами 61
3.4. Количественная оценка связывания молекул di-факторов с ДНК.. 65
3.5. Конформационныи В-+А-переход молекул ДНК в присутствии di-факторов при изменении относительной влажности 67
Глава 4. Устойчивость ДНК к экстремальным воздействиям в присутст вии d-факторов 77
4.1. Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов 78
4.2. Чувствительность ДНК к УФ-облучению в присутствии ds-факторов 82
4.2.1. Влияние УФ-облучения на линейные молекулы ДНК в при сутствии di3KTopoB 84
4.2.2. Влияние УФ-облучения на кольцевые молекулы ДНК в присутствии факторов 88
4.3 Длительное сохранение физико-химических свойств ДНК в при сутствии di-факторов 94
Заключение 100
Выводы 106
Список использованной литературы 108
- Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку
- Термическая денатурация ДНК и измерение оптической плотности
- Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК
- Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов
Введение к работе
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования
Ауторегуляторные d|-факторы микроорганизмов, по своей химической природе относящиеся к производным алкилоксибензолов (АОБ), в последние десятилетия стали предметом интенсивного изучения (Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И., 2000, Мулюкин А.Л. и др., 2005).
Первым из выявленных механизмов влияния АОБ на метаболическую активность и физиологическое состояние бактериальных клеток стало их взаимодействие с мембранными липидами (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979, Reusch R.N., Sadoff H.L., 1983), следствием чего является увеличение микровязкости цитоплазматической мембраны, изменение её проницаемости для моновалентных ионов и следующее за этим обезвоживание клетки (Капрель-янц А.С. и др., 1985). Эффект взаимодействия АОБ с ферментными белками (Беспалов ММ. и др., 2000) проявляется в изменении скорости катализа с одновременным существенным повышением устойчивости белковых глобул к различным экстремальным воздействиям (Колпаков А.И., 2000). На клеточном уровне результатом взаимодействия АОБ с биополимерами и надмолекулярными структурами является контроль обменных процессов, включая выраженное иигибирование метаболизма и образование цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов (Эль-Регистан Г.И. и др., 1979), характеризующихся повышенной резистентностью к различным стрессорным воздействиям (Пронин СВ. и др., 1982, Демкина Е.В. и др., 2000).
В то же время, как формирование анабиотического состояния, так и повышение стрессоустойчивости клеток, предполагают стабилизацию основного носителя генетической информации - ДНК - с приобретением ей устойчивости к повреждающему воздействию широкого спектра абиотических и биотических факторов (Setlow Р., 1995, Azam Т.А. et al., 1999). При этом АОБ в силу
особенностей своего химического строения являются одними из достаточно вероятных кандидатов на эту роль.
Однако, имеющиеся данные как о возможности взаимодействия АОБ с ДНК, так и о результатах подобного контакта до настоящего времени немногочисленны, а иногда и противоречивы. С одной стороны, описан повреждающий эффект АОБ на ДНК, включающий Си(П)-зависимое расщепление ДНК с ингибированием её репарации (Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M., 2000), а также мутагенное действие АОБ на клетки про- и эукариот (Маргулис А.Б. и др., 2005). С другой стороны, хорошо документированным является антимутагенное действие АОБ (Gasiorowski К., Brocos В., 2001), а также связываемый с их воздействием эффект компактизации нуклеоида в покоящихся бактериальных клетках (Мулюкин А.Л. и др., 2005), сопровождающийся изменением эла-стовязкости ДНК.
В пользу актуальности исследования взаимодействия АОБ с ДНК говорят и перспективы применения полученных результатов для совершенствования методов направленного воздействия на метаболические процессы в бактериальных клетках и их генетический аппарат. Кроме того, актуальным представляется и исследование процессов формирования функциональных надмолекулярных структур на основе ДНК и АОБ, потенциально востребованных в таких перспективных областях как биотехнология и биоинженерия.
Цель и задачи исследования
Цель работы - исследование взаимодействия алкилоксибензолов - химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов с ДНК, а также оценка последствий подобного взаимодействия.
Для достижения этой цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:
Изучить возможность прямого взаимодействия алкилоксибензолов -химических аналогов ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов, различающихся строением и биологической активностью, с ДНК.
Визуализировать результат взаимодействия структурно различных АОБ с ДНК.
Определить конформационное состояние ДНК в присутствии структурно различающихся АОБ при изменении относительной влажности.
Исследовать влияние АОБ на чувствительность ДНК к экстремальным факторам (температура, УФ-облучение), а также динамику изменения физико-химических свойств ДНК в водных растворах в присутствии АОБ.
Научная новизна
На основании анализа ряда физико-химических характеристик ДНК в присутствии синтетических аналогов ауторегуляторных ф-факторов микроорганизмов впервые установлен факт прямого взаимодействия между этими молекулами, что расширяет список биополимеров бактериальной клетки, способных устанавливать контакт с АОБ.
Изучение флуоресцентных характеристик структурно различных АОБ в присутствии ДНК, а также поведения флуоресцентного зонда пирена в смесях ДНК-АОБ показали, что взаимодействие между данными молекулами может вести к формированию вокруг ДНК гидрофобного окружения. Впервые показано, что в результате взаимодействия одного из наиболее биологически активных АОБ - гексилрезорцина - на ДНК формируются устойчивые мицелло-подобные наноструктуры. При этом развивающееся во времени увеличение подобных образований и их слияние в более крупные агрегаты соответствует картине компактизации нуклеоида бактериальной клетки при воздействии АОБ.
Установлено влияние химических аналогов ауторегуляторных dr факторов микроорганизмов на конформационную подвижность ДНК при уменьшении относительной влажности, результатом которого является замедление В—»А-перехода в присутствии метилрезорцина и его ускорение в присутствии тирозола и гексилрезорцина, что может быть одной из причин метаболической инертности ДНК в покоящихся клетках микроорганизмов.
Выявлено повышение температуры плавления ДНК в присутствии АОБ, а также защитное действие последних на линейные и кольцевые молекулы ДНК при УФ-облучении, что является экспериментальным объяснением высокой УФ- и терморезистентности покоящихся форм микроорганизмов, образование которых индуцируется АОБ. Показан факт длительного сохранения вязкостных и электрофоретических свойств полимерных молекул ДНК в водных растворах в присутствии ауторегуляторных di-факторов, что моделирует процесс консервации генетического материала в цитозоле покоящихся клеток микроорганизмов.
Практическая значимость
Полученные результаты, свидетельствующие о формировании вокруг нитей ДНК оболочек из химических аналогов ауторегуляторных ф-факторов микроорганизмов, изолирующих их от водного окружения, потенциально мо-
гут быть использованы в нескольких областях современной микробиологии, биохимии и биоинженерии, а именно:
при разработке методик консервации генетического материала бактериальных клеток, позволяющих сохранять их ДНК в нативных условиях;
при создании частиц для трансфекции и доставки лекарственных препаратов или плазмидной ДНК в клетки про- и эукариот.
Одной из возможных технологий также является способ получения надмолекулярных композитов из молекул гексилрезорцина и ДНК, характеризующихся взаимноупорядоченным расположением, на который получено решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005.
На защиту выносятся следующие положения:
Алкилоксибензолы - химические аналоги ауторегуляторных dr факторов микроорганизмов взаимодействуют с ДНК. Это взаимодействие носит различный характер в зависимости от химического строения di-факторов, их молярного соотношения с ДНК и времени совместной инкубации. При определённых условиях в присутствии одного из ауторегуляторных di-факторов (гексилрезорцина) на нитях ДНК образуются упорядоченные надмолекулярные структуры.
Взаимодействие с химическими аналогами ауторегуляторных d|-факторов влияет на скорость конформационного В—*А-перехода ДНК при снижении относительной влажности воздуха и оказывает протективное действие на ДНК, заключающееся в повышении температуры её плавления, защите от УФ-облучения и замедлении гидролитических процессов.
Публикации
Основные результаты изложены в 12 печатных работах, в числе которых 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК для публикации результатов диссертационных исследований.
Апробация работы
Результаты исследований обсуждались на международной конференции «Молодая наука - XXI веку» (Иваново, 2001); III, VI и VIII международных конференциях «Опто-, наноэлектроника, нанотехпологий и микросистемы» (Ульяновск, 2001, 2004 и 2006), III межрегиональной конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружаю-
щей средой» (Саратов, 2006), международной конференции «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006).
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка использованной литературы из 194 источников, включает 127 страниц машинописного текста, в том числе 28 рисунков и 4 таблицы.
Многообразие внеклеточных ауторегуляторных di-факторов микроорганизмов и их влияние на бактериальную клетку
В современной микробиологии существует концепция, согласно которой развивающаяся клеточная культура представляет собой саморегулирующуюся систему, поведение которой определяется как воздействием внешних факторов, так и влиянием ауторегуляторных метаболитов, контролирующих скорость и этапность развития культуры [I]. Оригинальные отечественные и зарубежные статьи по низкомолекулярным микробным ауторегуляторам обобщены в монографии А.С. Хохлова [2]. В последние годы опубликован ряд работ по микробной колониальной организации и биокоммуникации, в которых микробная колония рассматривается как целостная структура или даже надор ган изм енная (биосоциальная) система, подобно социумам муравьев или млекопитающих [3-5], а выделяемые ею химические вещества выступают в качестве факторов межклеточной коммуникации и социального поведения.
Неуклонно расширяется список работ, посвященных плотностноза-висимой (кворумзависимой) коммуникации [6-8], состоящей в том, что по концентрации сигнального вещества коллектив организмов оценивает собственную плотность. Если эта плотность достигла определённого порогового значения (кворума), то предпринимаются те или иные коллективные действия. К числу описанных к настоящему времени явлений относятся, например, биолюминесценция у морских бактерий, где в роли диффундирующих химических факторов коммуникации выступают аци-лированные лактоны гомосерина. Кроме ацилированных производных го-мосеринлактона другие (в частности, грамположительные) бактерии используют также пептидные факторы плотностнозависимой коммуникации, например, определяющие спорообразование у бацилл. В роли факторов межклеточной коммуникации могут выступать и некоторые аминокислоты (глутамин, аспарагиновая кислота), например, глутамин необходим для образования клеток-швермеров у Proteus, последующая стимуляция движения которых осуществляется упоминавшимися выше ацилированными производными гомосеринлактона [9].
Терминология, применяемая для обозначения метаболитов с конкретной сигнальной функцией весьма многообразна. Классификация их построена на выяснении типа взаимодействий: меж- или внутривидовых, а также их характера: благоприятного или вредного для микроорганизма [10]. Термин «семиохемики» был предложен для обозначения всех метаболитов с сигнальной функцией [11], разделяющихся на два класса и обеспечивающих межвидовые (алломоны, кайромоны, депрессоры) и внутривидовые (аутоксины, аутоингибиторы адаптации, феромоны) взаимодействия. Следует отметить, что как классификация, так и терминология метаболитов с сигнальной функцией достаточно условна, поэтому в последнее время наиболее употребимым стал термин «факторы ауторегуляции».
В наиболее общем определении под ауторегуляторными факторами понимаются физиологически активные соединения различной химической природы, выделяемые микробной популяцией или её частью в окружающую среду, не используемые в целях конструктивного и энергетического метаболизма, но играющие в клеточном сообществе сигнальную роль к изменению количественного (скорость роста) и качественного (дифференциация) состояния микробной культуры [12]. В соответствии с последним, группу таких метаболитов называют факторами d (от англ. differentiation). Показано, что микроорганизмы различных таксономических групп в про цессе развития их периодических или непрерывных культур синтезируют и выделяют в окружающую среду ауторегуляторные метаболиты двух типов: аутостимуляторы автолиза (факторы d2) жирнокислотной природы [13] и аутоиндукторы анабиоза (факторы di), являющиеся фенольными соединениями [12,14]. Одной из последних и наиболее полных работ, посвященных вопросам ауторегуляции образования покоящихся форм бактерий, механизмам анабиоза и основным свойствам аутоиндукторов анабиоза -факторов db является монография Бухарина О.В. с соавт. [15].
Фенольные соединения представляют собой один из наиболее многочисленных классов природных соединений с различной биологической активностью [16], состоящие из одного ароматического бензольного кольца и являющиеся производными фенола (оксибензола) или дигидроксифе-нола (диоксибензола - резорцина) [17] . Фенольные липиды состоят из фе-нольной части и углеводородной цепи (различной длины), соединённой с ароматическим ядром. Наиболее часто встречающимися являются резор-цинольные липиды, присутствующие в различных живых организмах и представленные широким спектром гомологов и изомеров. Фенольные липиды, имеющие алкильный радикал и две ОН-группы в метаположении называют алкилрезорцинами или алкилоксибензолами (АОБ). Терминология, применяемая для обозначения ауторегуляторных факторов микроорганизмов, представленных низкомолекулярными веществами весьма разнообразна: фенольные соединения, фенольные липиды, длинноцепочечиые фенолы, дигидроксифенолы, алкилрезорцины и алкилоксибензолы. В зарубежных публикациях наиболее распространённым названием является алкилрезорцины, в отечественных - алкилоксибензолы (АОБ). Всего обнаружено более 100 различных форм резорцинольных липидов [18]. Мы остановили своё изучение на двух алкилоксибензолах, различающихся длиной алкилыюго радикала: метилрезорцине (MP) и гексилрезорцине (ГР). Кроме того, функционально близким им является парагидроксиэтилфенол или тирозол (Т), выступающий ауторегуляторным di-фактором дрожжей Saccharomyces cerevisiae [19]. Тирозол лишён гидрофобной углеводородной цепи, довольно гидрофилен и не способен встраиваться в липидный бислой.
Впервые производные алкилрезорцина обнаружены при изучении липидного экстракта Azotobacter vinelandii [20-22], позже были идентифицированы два алкилрезорцинольных гомолога в липидах Azotobacter chroococcum [23]. Те же гомологи были найдены в культуре грамотрица-тельной водородоокисляющей бактерии Pseudomonas carboxydoflava [24]. Позже были изолированы резорцинолы из культуральной жидкости другой почвенной бактерии Streptomyces cyaneus [25]. Присутствие этих соединений в почвенных бактериях авторы [18] связывают с фиксацией азота и симбиозом микроорганизмов с высшими растениями.
Термическая денатурация ДНК и измерение оптической плотности
Денатурация нуклеиновых кислот - это процесс нарушения водородных связей между отдельными основаниями и полинуклеотидными цепями в целом, который может быть вызван многими факторами, в том числе и нагреванием. Нередко вместо термина «термическая денатурация» используют термин «плавление» ДНК.
Термическая денатурация ДНК может регистрироваться с помощью целого ряда показателей (оптическая плотность, оптическая активность), непосредственно связанных со спирализациеЙ, естественно также, что денатурация, снижая жёсткость нитей, может регистрироваться по вязкости, дисперсии оптического вращения, по двойному лучепреломлению и т.д. Наиболее показательно и удобно измерение оптической плотности при 260 нм. Гипохромизм двуцепочечных НК обуславливает при денатурации обратный гиперхромный эффект. Удобно оперировать относительными значениями гиперхромного эффекта, принимая за 100% максимальный прирост оптической плотности, достижимый при нагревании. Абсцисса точки перегиба, соответствующая половине гиперхромного эффекта принимается как температура плавления (ТГ1Л).
Одним из параметров, характеризующих свойства ДНК, является её температура плавления [134]. Образование стэкинга (расположение оснований одно на другим, стопочная структура) сопровождается уменьшением поглощения УФ-света (гипохромизм), поэтому, наблюдая за спектром поглощения ДНК в этой области, удобно следить за образованием и разрушением двойной спирали. Если медленно повышать температуру раствора двухцепочечной ДНК, то при определённой температуре будет наблюдать ся резкое увеличение поглощения, обусловленное разрушением спиральной структуры. Введение в раствор ДНК других малых молекул может повлиять на процесс плавления ДНК и дать информацию о процессах, происходящих внутри этой системы.
При проведении термической денатурации интактной ДНК, а также ДНК в присутствии АОБ осуществляли нагрев проб с помощью нагревателей, расположенных с двух сторон герметически закрытой кварцевой кюветы с длиной оптического пути 1 см от 30С до 95С со скоростью 1 град/мин [135]. Регистрировали значения оптической плотности в максимуме поглощения ДНК с помощью спектрофлюориметра «Флюорат-02 Панорама» и приставки «Хобби» на тех сторонах кюветы, где не были расположены нагревательные пластины. Измерения температуры проводили с помощью термопары, расположенной в центральной части кюветы с нагреваемым раствором, точность определения температуры ±1СС.
Достаточно измерять зависимость температуры от величины гипо-хромного эффекта на длине волны 260 им, т.к. при этой длине волны гипо-хромный эффект максимален. Обычно по оси ординат откладывают просто оптическую плотность D. Кривая зависимости оптической плотности от температуры называется кривой плавления, или кривой тепловой денатурации (рис. 2.4).
Для количественной характеристики данного процесса рассчитывали значения точки начала (Т[[П) и окончания плавления (Топ), температуру 50% тепловой денатурации образца (Т50), ширину перехода (ДТ) как разницу между точками начала и конца плавления, а также диапазон плавления (ДН) как разницу между достигнутыми значениями гиперхромизма в контроле (раствор ДНК) и опыте (растворы ДНК с АОБ) [136].
Вязкость растворов НК является особенно ценным показателем для характеристики двухцепочечных ДНК. Упругие нитевидные молекулы большой длины определяют, в общем, очень высокую вязкость, а также такую её зависимость от молекулярного веса, которая является весьма удобной для объективных оценок последнего. Основой зависимости является так называемая характеристическая вязкость:
Вискозиметр располагали строго вертикально. Растворы термостатировали до достижения одинаковой температуры. Для измерения времени истечения использовался секундомер с ценой деления 0,1 с. Использовали растворы ДНК и ДНК+АОБ в объёме 20 мл при концентрации ДНК 5 10"4М, АОБ-5хЮ"3М.
Метод используется в данной работе для регистрации увеличения молекулярной массы ДНК в присутствии АОБ, а также детекции фотоповреждений и фотомодификации ДНК после облучения УФ в присутствии ауторегуляторных факторов [138]. На рис. 2.5 приведено изображение электрофоретической подвижности использованных препаратов ДНК.
Гипохромный эффект при взаимодействии dj-факторов с ДНК
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о формировании в водных растворах ДНК в присутствии ГР упорядоченных надмолекулярных структур данного биополимера, сопровождающихся его изоляцией от водного окружения. При этом обращает на себя внимание невысокая скорость этого процесса, что заставляет исключить участие в нем электростатических сил. На этом фоне среди прочих наиболее вероятными представляются гидрофобные взаимодействия, одним из аргументов в пользу че го является выраженность регистрируемого эффекта только для ГР, имеющего наибольшую длину алкильного радикала среди изученных соединений.
Следует указать, что наблюдаемые структурные метаморфозы ДНК в присутствии АОБ похожи на картины компактизации нуклеоида в цистопо-добных покоящихся клетках бактерий [15,65]. При этом выявленный эффект позволяет объяснить кажущееся противоречие в данных о наличии у гек-силрезорцина как мутагенного, так и антимутагенного действия [56, 71, 156]. Так избирательная интеграция молекул АОБ в АТ-обогащённые участки ДНК и последующие события вплоть до компактизации ДНК (образование «наноструктур») могут приводить к изменениям в топологии ДНК и процессах репликации и транскрипции, которые являются причиной внут-ригеномных перестроек, обуславливающих явления внутрипопуляционной изменчивости бактерий, в том числе их диссоциативных переходов [60]. С другой стороны, повышение стабильности ДНК в её комплексах с АОБ будет нейтрализовать действие более сильных мутагенов, многие из которых относятся к классическим интеркаляторам, а также способствовать диссипации энергии повреждений, как например, в случаях у- или фотооблучения.
Прикладные аспекты полученных результатов определяются возможностью создания упорядоченных надмолекулярных композитов на основе молекул АОБ и ДНК, представляющих собой особенные «кабельные» структуры, в составе которых молекулы ДНК характеризуются взаимно упорядоченным параллельным расположением, будучи объединенными единым «чехлом» из молекул АОБ (положительное решении о выдаче патента на изобретение на «Способ получения надмолекулярных композитов» по заявке №2005110818/13 от 13.04.2005). При этом потенциальной сферой использования подобных композитов является их применение в ряде биотехнологических и нанотехнологических устройств [157], а также создание на их основе частиц для трансфекции.
Обсуждая же отличие разработанного подхода по сравнению с существующими аналогами, следует указать, что в основу большинства работ по созданию упорядоченных ДНК-содержащих структур положено взаимодействие ДНК с различными поли катионами, что позволяет сблизить молекулы биополимера за счет устранения эффекта электростатического отталкивания [106]. Возникающее же в результате этого фазовое исключение молекул ДНК из водно-полимерных растворов переводит их в жидкокристаллическое состояние [158-159]. На этом фоне значительно менее изученными оказываются иные типы взаимодействий, потенциально также участвующих в упорядоченном расположении молекул ДНК в биологических системах. В полной мере сказанное может быть отнесено к относительно слабо изученным гидрофобным взаимодействиям между молекулами ДНК и низкомолекулярными лигандами. В частности, указанная возможность относительно недавно была продемонстрирована на примере взаимодействия ДНК с кати-онными амфифилами N-триметилалкильного ряда с формированием на протяжении биополимера упорядоченпо расположенных мицеллоподобных структур [104, 160].
На этом фоне выявленное нами прямое взаимодействие между ДНК и АОБ может рассматриваться в качестве еще одного примера ДНК-липидных взаимодействий, сопровождающихся формированием взаимно упорядоченного расположения данных молекул. С другой стороны, полученные результаты, свидетельствующие о прямом взаимодействии АОБ с ДНК с формированием надмолекулярных комплексов явились основанием для постановки вопроса о последствиях подобного взаимодействия для конформационного состояния ДНК, а также её устойчивости к некоторым экстремальным воздействиям. оценки связывания АОБ молекулой ДНК [137]. При этом было введено важное допущение, что изменения вязкостных характеристик при комплексооб-разовании ДНК с АОБ определяются, в основном, увеличением её молекулярной массы за счет связывания АОБ и не зависят от возможных изменений жесткости данного линейного полимера.
При этом проведенные расчеты показали, что средняя молекулярная масса комплексов ДНК-ГР (5406±124 кДа) примерно на 20% превышает молекулярную массу индивидуального полимера (4465±106 кДа), что соответствует связыванию на фрагменте ДНК длиной 1000 н.п. около полутора тысяч (1492±112) молекул гексил резорцина. Если принимать во внимание возможность изменений жёсткости биополимера, то полученные расчетные величины несколько занижены.
Сходные результаты получены нами при расчете молекулярных масс ДНК и комплексов ДНК-АОБ, основанном на их электрофоретической подвижности в агарозном геле в присутствии маркеров молекулярных масс ДНК [138], в качестве которых использовались Hind III-рестрикты ДНК фага X (рис. 3.11).
Начиная с 4-5 недели инкубации было зарегистрировано выраженное снижение электрофоретической подвижности комплексов ДНК-гексилрезорцин, по сравнению с интактной ДНК, что может быть расценено как возрастание среднего значения их молекулярной массы до 6432±144 кДа против 4217±111 кДа в контроле. Основанные на этих различиях расчеты свидетельствуют о том, что на 1000 н.п. в полимерной молекуле ДНК может связываться немногим более полутора тысяч (1670±180) молекул гексилре-зорцина. Данная расчетная величина оказалась несколько выше, полученной при анализе зависимостей «молекулярная масса полимера - вязкость», что может объясняться ростом количественных показателей связывания гексил-резорцина с ДНК во времени.
Изменение температуры плавления ДНК в присутствии dj-факторов
Ультрафилетовое (УФ) облучение играет важную роль в экологии микроорганизмов, обуславливая развитие у них комплекса мутагенных и летальных эффектов, а также индуцируя деструктивные реакции в биологических системах [181]. Важную роль в этих процессах играет воздействие УФ-облучения на ДНК, наиболее интенсивно поглощающую в диапазоне 240-300 нм с максимумом 254 нм. Результатом этого являются различные фотоповреждения ДНК, наиболее ранним и распространенным из которых является образование пиримидиновых димеров из рядом расположенных в нуклеотидной цепи тиминовых и цитозиновых остатков [182-185]. Несмотря на то, что образование подобных димеров составляет 70-80% от общего эффекта УФ на ДНК, они достаточно хорошо репарируются особыми присутствующим в бактериальной клетке ферментными системами [186]. Дополнительными и также частично репарируемыми эффектами УФ-облучения являются фотогидратация пиримидинового кольца (протекает только в одноцепочечной ДНК), образование пиримидиновых аддуктов, формирование ковалентных сшивок ДНК с белками, а также сшивок между находящимися в пространственном контакте ДНК-дуплексами [187]. При повышении же интенсивности УФ-облучения возрастает роль таких глубоких и нерепарируемых повреждений как одно- и двунитевые разрывы цепей ДНК, сопровождающихся ее глубокой деградацией и однозначно ведущих к гибели бактериальной клетки. Механизмы фотомодификации микроорганизмов под действием УФ облучения подробно изложены в обзоре [188].
Наибольшую чувствительность к УФ-облучению проявляют вегетативные клетки микроорганизмов, в то время как их покоящиеся формы обычно характеризуются повышенным уровнем радиорезистентности. В наибольшей степени указанная особенность характерна для эндоспор, но может быть продемонстрирована и для цистоподобных рефрактерных клеток [189, 32, 12]. При этом, учитывая важную роль ауторегуляторных d]-факторов бактерий из группы алкилоксибензолов (АОБ) в индукции анабиотического состояния последних, нам представилось целесообразным изучить роль этих низкомолекулярных лигандов в модификации чувствительности ДНК к УФ-облучению. Дополнительным аргументом в пользу подобной постановки вопроса явились данные о возможности прямого взаимодействия АОБ с ДНК, показанные в предыдущей главе, существенно изменяющего физико-химические свойства этой макромолекулы. И то, что некоторые АОБ в настоящее время используются в промышленности в качестве химических УФ-протекторов [190].
Все вышесказанное определило следующую задачу - изучить результаты воздействия УФ-облучения на линейные и кольцевые молекулы ДНК, а также влияние предварительной инкубации ДНК с химическими аналогами микробных ауторегуляторов - алкилоксибензолами, на уровень ее УФ-резистентности с акцентом на выявление глубоких необратимых повреждений ДНК.
При проведении УФ-облучения пробы ДНК и ДНК+АОБ в объеме 100 мкл вносили в лунки полистироловых планшетов с плоским дном и облучали с расстояния 5 см широкополосной УФ-лампой (Osram) через светофильтр 254 нм. Время облучения равнялось 60, 120 и 180 мин. Для регистрации процессов фото деструкции ДНК использовали метод гель-электрофореза.
При электрофорезе в агарозном геле HindIII-рестрикты ДНК фага X формировали семь четко обособленных полос, каждая из которых содержала фрагменты с определенной молекулярной массой от 23130 до 564 н.п. (наиболее мелкий фрагмент 125 н.п. в использованных условиях выходил за границы электрофоретического поля). На этом фоне УФ-облучение данного типа ДНК вело к прогрессирующему снижению интенсивности каждой из данных полос, замещающихся единым «треком» из фрагментов вариабельной молекулярной массы с повышенной электрофоретической подвижностью, так что после 3 часов подобного воздействия при электрофорезе выявлялся только «трек» в отсутствие какой-либо из типичных полос (рис. 4.2). Непосредственной же причиной этого являлись индуцированные УФ-облучением множественные двунитевые разрывы ДНК с распадом каждой из молекул на два или более нерегулярных фрагмента. Инкубация ДНК с АОБ не приводила к изменению ее исходной элек-трофоретической подвижности, но уже на ранних сроках (с 1-ой недели контакта) сказывалась на чувствительности данной макромолекулы к УФ-облучению. При этом регистрируемые эффекты сводились к формированию различных степеней УФ-резистентности комплексов ДНК+АОБ, зависящих как от используемой концентрации последних, так и от особенностей их химического строения. В частности, использование MP в концентрации 10" М еще не вело к формированию защитного эффекта, тогда как повышение содержания данного вещества в облучаемых пробах до 10" М на фоне общего «трека» позволило зафиксировать максимумы с молекулярными массами, типичными для HindIII-рестриктов ДНК фага "к. При этом соответствующие расчеты свидетельствовали о том, что в присутствии последней концентрации MP после 3-часового УФ-облучения сохранялось до 62,3±3,0% исходных линейных фрагментов ДНК.
В свою очередь комплексы ДНК с ГР, обладающим более выраженным апкильным радикалом, характеризовались еще более выраженной устойчивостью к УФ-облучению, что проявлялось в формировании заметного уровня защиты и при его концентрации действующего фактора 10" М, а использование ГР в концентрации 10"3М позволяло сохранять уже до 82,1±4,7% исходных фрагментов ДНК (рис. 4.2).
Проведение экспериментов с линейной ДНК из молок лосося вариабельной молекулярной массы при электорофорезе в агарозном геле изначально позволяло регистрировать её в виде единого «трека». На этом фоне последствия УФ-облучения данного типа ДНК заключались в прогрессирующем увеличении средней электрофоретической подвижности фрагментов при одновременном снижении общего количества электрофоретически выявляемой ДНК (рис.4.3). Так после 60 минут облучения при электрофорезе выявлялось 74,7±3,2% от исходного количества ДНК в пробе, определяемое содержание которого в дальнейшем снижалось до 56,1±2,2% к 120-й и до 42,2±2,7% к 180-й минуте воздействия.
