Введение к работе
Актуальность проблемы. Молекулярные основы адаптации организмов к выживанию в экстремальных условиях среды определяются образованием внутри клетки ферментных систем, устойчивых к их воздействию и поддерживающих протекание важнейших метаболических процессов. При адаптации клеточного метаболизма к изменениям условий внешней среды организм использует стратегию регуляции активности ферментного аппарата клетки. Важная роль в осуществлении адаптивной реакции принадлежит малатдегидрогеназной системе, представленной в клетках эукариот различно локализованными изоферментами (Епринцев, Игамбердиев, 1995; Епринцевидр., 1996). Поскольку для бактерий, отличающихся большой вариабельностью метаболических потоков, изоферментный полиморфизм не характерен, участие малатдегидрогеназы (МДГ) в разных метаболических процессах может обеспечиваться перестройкой субъединичной структуры молекулы, определяющей функциональную роль фермента (Степанова и др., 2000; Епринцев и др., 2002). МДГ (КФ 1.1.1.37.), являясь полифункциональным ферментным комплексом, обеспечивает протекание конструктивного и энергетического метаболизма (Gietl, 1992). Известно, что в клетках бактерий встречаются как димерные (Charnock et. al., 1992; Labrou, Clonis, 1997), так и тетрамерные формы этого фермента (Wynne et. al., 1996; Madern, Zaccai, 2004). У фототрофных анаэробов (Rodobacter capsulatus, Rodospirfflum ruubrum) МДГ, функционирующая преимущественно в конструктивном обмене, имеет тетрамерное строение. У аэробных микроорганизмов с органотрофным типом питания (Paracoccus denitrificans, Pseudomonas stutzeri) фермент является димером и участвует в протекании конструктивного и энергетического метаболизма.
В ряде работ (Rolstad et al., 1988; Irimia et. al., 2004) показано, что не только тип питания может влиять на структуру и свойства МДГ. Важным фактором, регулирующим активность малатдегидрогеназной системы путём изменения изоферментного состава или каталитической эффективности её белков, является температура. Изменения четвертичной структуры МДГ обнаружены у
|>0С национальная!
БИБЛИОТЕКА !
термофильной зеленой серной бактерии Chloroflexus aurantiacus. Тетрамерная форма фермента из этих микроорганизмов обладает функциональной активностью только при 55С. Снижение температуры приводит к распаду МДГ на неактивные димеры и тримеры. Следовательно, структурные перестройки молекулы малатдегидрогеназы являются важнейшим регуляторным механизмом, обеспечивающим адаптивную реакцию к высокой температуре.
Изучение особенностей структуры и свойств МДГ у бесцветных серобактерий Beggiatoa leptomitiformis и Leucothrix mucor и термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus представляет определённый интерес. Бактерии родов Beggiatoa и Leucothrix, в зависимости от наличия в среде культивирования восстановленных соединений серы, и, в частности, тиосульфата, могут изменять тип метаболизма и расти как хемоорганогетеротрофно, так и хемолито гетеротрофно, используя в качестве источника энергии органические или неорганические доноры электронов. V. medioatlanticus, являясь термофильными организмами, растут при экстремальных температурах, значительно превышающих оптимальную температуру роста мезофильных бактерий В. leptomitiformis и L. mucor.
В связи с этим интересно исследование роли структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов, отличающихся не только типом питания, но и отношением к температуре.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы у микроорганизмов разных экологических групп. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи:
выделить и получить в электрофоретически гомогенном состоянии препараты МДГ из исследуемых бактерий;
изучить на высокоочищенных ферментных препаратах физико-химические, каталитические и регуляторные свойства малатдегидрогеназы;
исследовать четвертичную структуру МДГ из серобактерий Beggiatoa leptomitiformis Д-402 и Leucothrix mucor DSM 2157 в условиях op гано-, лито-и миксотрофного культивирования;
изучить субъединичное строение малатдегидрогеназы из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus, культивируемых при разной температуре;
методом ингибиторного анализа выявить функциональную роль димерной и тетрамерной изоформ МДГ у Beggiatoa leptomitiformis Д-402 в условиях разного типа питания;
исследовать в модельных опытах воздействие тиосульфата на структуру очищенного препарата фермента;
изучить влияние температуры на скорость ферментативной реакции и термостабильность МДГ.
Научная новизна. Получение гомогенных препаратов малатдегидрогеназы из микроорганизмов, принадлежащих к разным экологическим группам, позволило показать функциональную роль тетрамерной и димерной изоформ МДГ в метаболизме бесцветных серобактерий родов Beggiatoa и Leucothrix. В условиях органотрофного роста у бактерий функционирует димерная форма МДГ, участвующая в работе цикла Кребса. При литотрофном культивировании МДГ представляет собой тетрамер, обеспечивающий протекание глиоксилатного цикла (ГЦ). Установлена динамика перехода тетрамера в димер при миксотрофном росте, обусловленная скоростью окисления тиосульфата. Выявлена важная структурная особенность являющейся термоэнзимом димерной МДГ из термофильных бактерий Vulcanithermus medioatlanticus - большая молекулярная масса субъединиц (58 кДа), обеспечивающая, по-видимому, повышенную жесткость структуры фермента (энергия активации 32,6 кДж/моль), необходимую для его функционирования в экстремальном температурном режиме. Показана важная роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к действию различных факторов внешней среды.
Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы
помогают глубже понять современные представления о механизмах
переключения метаболических потоков при разных условиях культивирования
микроорганизмов. Практическая значимость настоящей работы состоит в
расширении и углублении знаний о роли структурно-функциональных изменений
МДГ в механизмах адаптации к изменяющимся факторам внешней среды.
Полученные гомогенные препараты малатдегидрогеназы могут быть
использованы в научно-исследовательских работах, связанных с изучением
ферментативной кинетики, четвертичной структуры фермента,
термодинамических параметров реакций, катализируемых МДГ. Выделение из
термофильных организмов ферментов, отличающихся высокой
термостабильностью, может иметь большое значение для биотехнологии, химической промышленности. Прикладные аспекты изучения бесцветных серобактерий определяются их использованием для удаления токсичных соединений серы из промышленных и бытовых сточных вод, воздушной среды производственных помещений и других объектов.
Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на биолого-почвенном факультете Воронежского государственного университета при чтении лекций по биохимии, в спецкурсах по энзимологии, биохимическим механизмам адаптации прокариот, а также при проведении практикумов и выполнении курсовых и дипломных работ.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались
на международных, региональных и университетских конференциях. Они были
представлены на восьмой международной конференции по химии и физикохимии
олигомеров "Олигомеры - 2002" (Москва - Черноголовка, 2002);
межрегиональных конференциях, посвященных памяти А.А. Землянухина "Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов" (Воронеж, 2002, 2003, 2004); 6-ой Пущинской конференции молодых учёных "Биология - наука 21-ого века" (Пущино, 2002); второй межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой»
7 (Саратов, 2004); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); ежегодных научных сессиях отчетной конференции преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (2002,2003,2004).
Публикации. Основные результаты настоящей диссертационной работы изложены в 12 публикациях - 7 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (248 источников). Иллюстрационный материал включает 35 рисунков и 10 таблиц.
