Динамика активности изоферментов лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и a-глицерофосфатдегидрогеназы в процессе адаптаций рыб к различным факторам окружающей среды Мещерякова Ольга Владимировна

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура и типы изоферментпых наборов лакгатдегидрогеназы, 9
малатдегидрогеиазы и а-глицерофосфатдегидрогеназы у

1. Участие ферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в метаболизме высших 14 животных и рыб

2. Роль изоферментов в метаболизме различных органов и тканей 21 высших животных

1. Особенности метаболизма печени, активность распределение 22 изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в печени рыб

2. Особенности метаболизма мышечной ткани, активность и 27 распределение изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ п мышцах рыб....

4. Влияние различных факторов окружающей среды па ферменты ЛДГ, 32
МДГ и а-ГФДГ рыб

4.1. Влияние температуры на ферменты ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ рыб 32

3. Возможные энзимологические механизмы компенсации 33 тем пературных эффектов

4. Влияние температуры на свойства ферментов 37

2. Влияние токсических веществ на рыб. 39 Участие изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в биохимических адаптациях рыб к токсическому воздействию

3. Влияние заболеваний на углеводный обмен у высших животных и 45 рыб. Активность ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ при заболеваниях рыб

МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1. Материал исследования и его хранение.... 47

2. Методы исследования 50

2. Выделение митохондриалыгой фракции 51

3. Разделение изоферментов методом диск-электрофореза в 52 полиакриламидном геле

2.3.1. Комбинированные буферные системы и приготовление геля к 53
ним

2.3.2, Однородные буферные системы и приготовление геля к ним 56

2.3.4. Проведение электрофореза в комбинированной буферной 57

системе

5. Проведение электрофореза в однородной буферной системе 58

6. Обнаружение разделенных ферментов при помощи 58

окрашивания

2.3.7. Определение активности изофермептов методом 59

денситометрии

2.4. Спектрофотометричсское определение активности ферментов 59

1. Определение общей активности лактатдегидрогеиазы, 60 малатдегидрогеиазы и сс-глицерофосфатдегидрогеназы

2. Определение активности цитохром с оксидазы 61

3. Определение активности альдолазы , 61

4. Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 63

2.5. Определение константы Михаэлис - Мснтен (К_т) и максимальной 64
скорости реакции (V_max) изоферментов ЛДГ

5. Препаративное выделение изоферментов 67

6. Спектрофотомстрическое определение К_т и V_majt изофермептов 68 ЛДГ

6. Определение концентрации белка 68

7. Статистическая обработка данных 68

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Распределение изоферментов лактатдегидрогеиазы, малатдегидро- 69 геназы и а-глииерофосфатдегидрогеназы в некоторых органах исследуемых видов рыб

2. Исследование кинетических характеристик изоферментов 84 ЛДГ леща при различных температурах

3. Влияние содержания ртути в мышцах, рН и цветности водоема на 88 активность изоферментов ЛДГ, МДГ, а-ГФДГ и некоторых других ферментов углеводного обмена в органах окуней.

4. Активность ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ, а также некоторых других 96 ферментов углеводного обмена в органах плотвы обитающей в водоеме загрязненном отходами горно-обогатительного производства

5. Сравнительное изучение активности изоферментов ЛДГ, МДГ, а так 108 же активности альдолазы и цитохромоксидазы в тканях и органах здоровой и больной некрозом плавников молоди семги

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 121

ВЫВОДЫ 126

Список литературы 127

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

МДГ - малатдегидрогсназа

а-ГФДГ - а-глицерофосфатдегидрогеназа

R_r- относительная элсктрофоретическая подвижность

ЦО - цитохром с оксидаза

Г-б-ФДГ - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа

ДОАФ - диоксиацетонфосфат

ЩУК — щавелевоуксусная кислота

ОА - оксалацетат

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ГНГ - глюкопсогепез

ПФП - нентозофосфатный путь

НАДИ - восстановленная форма кофсрмента НАД (НАДИ+І-Ґ)

НАДфН - восстановленная форма кофсрмента МАДф (НАДфН+Н⁺)

К_ш — константа Михаэлиса-Ментен

V_mas -максимальная скорость реакции

Введение к работе

Актуальность темы. Одной из актуальных проблем современной биологии является вопрос о механизмах адаптации организмов к постоянно изменяющимся условиям среды. Основная роль в поддержании постоянства метаболизма при влиянии различных факторов среды отводиться ферментам. Кроме этого, ключевые регуляторпые ферменты представлены в виде изоферментных систем. Присутствие в клетке изоферментов, различающихся по структурным, физико-химическим и кинетическим свойствам, клеточной компартментализации, а также ткане- и видоспецифичности наряду с другими механизмами, обеспечивает быструю и тонкую регуляцию клеточного метаболизма в условиях приспособления организма к постоянным изменениям внешней среды (Market, 1968; Ныосхолм, Старт, 1977; Хочачка Семеро, 1988). Особенности распределения и активности изоферментов в различных органах и тканях организма обусловлены характером и направленностью обменных процессов в данном органе, его функцией, а также физиологическим состоянием организма. Изоферменты лактатдегидрогеназы (ЛДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) катализируют реакции дегидрирования в углеводном обмене и регулируют уровень окислительно- восстановительного потенциала клетки — важнейшего фактора клеточного гомеостаза (Мецлср, 1981). Изоферменты ЛДГ осуществляют взаимопревращения лактата и иирувата, участвуя либо в завершении гликолиза с образованием лактата, либо в окислении лактата в пируват, который поступает в цикл трикарбоповых кислот или в глюкоиеогенез - путь синтеза глюкозы. Изоферменты МДГ и а-ГФДГ, конкурируя с ЛДГ за цитоплазматический НЛДН (Guppy, Hochachka,1978), участвуют в челночных механизмах переноса восстановительных эквивалентов между цитоплазмой и митохондриями клетки. Кроме этого, МДГ участвует цикле трикарбоновых кислот (только митохоидриалыше изоферменты) и в одной из реакций глгаконсогенеза. Важная роль а-ГФДГ состоит также в обеспечении глицерофосфатом процессов биосинтеза триапилглицеридов (Harmon, Sheridan, 1992).

Большое разнообразие изоферментов наблюдается у рыб, что связано, прежде всего, с условиями их существования и принадлежностью к группе эктотсрмных животных. Тетраплоидные виды рыб, в связи с их происхождением, имеют еще большее количество изоферментов ЛДГ МДГ и а-ГФДГ (Ohno et. al. 1967; Massaro, Market 1968, Bailey, Wilson, 1969; Holmes, Market 1969; Слынько, 1976; Henry, Ferguson, 1986; Stahl, Ryman, 1982), Очень широко освещен в литературе вопрос о количестве, распределении и свойствах изоферментов ЛДГ у рыб (Market, Faulhaber 1965, Market, Holmes 1969, Odense ct. al. 1969, Whitt 1970; Shukoliukov et al., 1976; Stoika et al., 1978; Rchse, Davidson 1986 и многие др.). Менее изучены МДГ (Starzyk, Merritt, 1980; De Luca, 1983; Hincs, 1983; Walton, 1985; Tripathi, 1993; Lin et al., 2002; Merrit, Quattro, 2003) и а-ГФДГ (Basaglia, Cucchi, 1995; Basaglia 2000).

Что касается участия изоферментов ЛДГ, МДГ, и а-ГФДГ в биохимических адаптациях рыб к различным факторам среды, то наиболее подробно изучен вопрос влияния температуры на структурные и функциональные свойства ЛДГ (Клячко, Озсрнюк, 1991, 1995, 1998; Klyachko, Ozemyuk, 1994, 1998; Fields, Somero, 1998; Fields et al., 2001; Sharpe et al., 2000). Достаточно большое количество работ посвящено влиянию различных токсикантов на ферменты углеводного обмена рыб (Горизонтов и др., 1983; Begum, 1987; Grosh, 1989; Металлов, Аксенов, 1997 и др.). Однако, отдельные аспекты этой проблемы, такие как дифференциальная роль изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в адаптациях рыб к загрязнению окружающей среды или изучение комплексного воздействия факгоров остаются еще слабо изученными. Неизученным остается также вопрос о дифференциальной роли изоферментов исследуемых дегидрогена при заболеваниях рыб.

Таким образом, исходя из выше изложенного, представлялось интересным исследовать дифференциальную роль изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ некоторых видов рыб в адаптациях к различным факторам окружающей среды. Для более глубокого понимания особенностей метаболизма рыб при различных воздействиях было необходимо дополнительно проанализировать и активность некоторых других ферментов углеводного обмена (альдолазы, цитохром с оксидазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы), а использованный в работе метод корреляционного анализа, позволил оценить взаимосвязь отдельных метаболических путей.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение изменений в активности изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ при плантациях рыб к различным факторам окружающей среды.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать распределение изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в <<ф, некоторых органах различных видов рыб, различающихся по экологии, эволюционным положением и генетикой.

Определить кинетические характеристики изоферментов ЛДГ леша при разных температурах.

Исследовать различия в активности и изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ, a также некоторых других ферментов углеводного обмена у окуней обитающих в озерах с различным уровнем pIF, содержанием Гумилевых кислот и отличающихся содержанием ртути в мышцах. ^ 4. Исследовать влияние загрязнения водной среды отходами горно- обогатительного производства на активность изоферментов изучаемых дегидрогеназ и других ферментов углеводного обмена у плотвы. 5. Изучить изменения в активности изоферментов ЛДГ, МДГ и активности других ферментов углеводного обмена в органах молоди семги при заболевании некрозом плавников. /^ Научная новизна. Получены новые данные, дополняющие существующую информацию об активности и распределении изоферментов ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в органах и тканях различных видов рыб. Впервые изучено влияние комплекса факторов водной среды (рН, цветность водоема) и содержание ртути в мышцах рыб па активность изоферментов исследуемых дегидрогеназ в органах окуня. Впервые получены результаты о влиянии загрязнения водоема отходами горно-обогатительного производства на ферменты в органах плотвы. Впервые исследованы изменения в активности \Щ ферментов углеводного обмена в органах лосося при некрозе плавников.

Практическое значение работы. Полученные данные расширяют представления о дифференциальной роли изоферментных систем ЛДГ, МДГ и а-ГФДГ в биохимических адаптациях рыб к различным факторам окружающей среды. Анализ результатов по влиянию загрязнения окружающей среды на исследуемые ферменты показывает возможность использования их для установления токсичности промышленных стоков, мониторинга окружающей среды и опенки физиологического состояния рыб. Полученные данные о влиянии заболеваний на ферменты лососевых рыб могут быть использованы для ранней диагностики и профилактики заболеваний у искусственно разводимых ценных видов рыб. Материалы диссертации используются п лекционном курсе <ф. «Экологическая биохимия» для студентов ПстрГУ и КГПУ.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на: Всероссийском совещании и выездной научной сессии отделения океанологии, физики атмосферы и географии РАН «Антропогенное воздействие на природу севера и его экологические последствия». Кольский НЦ, Аппатиты,

1998. Международной конференции и выездной научной сессии отделения общей биологии РАН «Биологические основы изучения, освоения и охраны животного и растительного мира, почвенного покрова Восточной '^ Фенноскандии. Карельский НЦ, Петрозаводск. 1999. 1^st International conference «Enzymes in the environment: activity, ecology and applications». Granada, Spain,

1999. Международной конференции «Атлантический лосось: биология, охрана и воспроизводство» Карельский НЦ, Петрозаводск. 2000. Международной конференции «Биоразнообразие европейского севера». Карельский НЦ, Петрозаводск. 2001. Всероссийской конференции «Современные проблемы Qm водной токсикологии» ИБВВ РАН, Борок, Яросл. обл. 2002. 10^ом Молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии» УрО Коми

НЦ РАН, Сыктывкар. 2003. 2"^d International conference «Enzymes in the environment: activity, ecology and applications». Cheh Republic, Praha, 2003.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 2 статьи и 11 тезисов докладов.

Выражаю огромную благодарность моему научному руководителю,ф д.б.н., профессору Немоеой Н.Н., а также всем сотрудникам лаборатории экологической биохимии Института биологии КарНЦ РАII, в особенности, А.И.Груздеву, за ценные рекомендации и помощь в работе, а также моим первым учителям в области биохимии — преподавателям кафедры молекулярной биологии, биологической и органической химии ПетрГУ.

Похожие диссертации на Динамика активности изоферментов лактатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и a-глицерофосфатдегидрогеназы в процессе адаптаций рыб к различным факторам окружающей среды

Влияние некоторых факторов среды на внутриклеточный протеолиз у гидробионтов Бондарева Людмила Александровна

Отношение байкальских и палеарктических амфипод к кислороду как фактору среды и механизмы адаптации при снижении его уровняКириченко Кузьма Анатольевич

Фитогормоны как регуляторы устойчивости растений к неблагоприятным факторам средыТаланова Вера Викторовна

Свободно-радикальное окисление и антиоксидантная защита как критерии оценки адаптационных процессов при действии химических факторов производственной средыЯппаров, Рустем Нуриахметович

Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней среды Парфёнова Наталья Владимировна

Роль структурно-функциональных изменений малатдегидрогеназы в адаптации микроорганизмов к факторам внешней средыПарфенова Наталья Владимировна

Влияние факторов окружающей среды на перекисное окисление липидов в условиях натурного и камерального экспериментовМищенко, Татьяна Михайловна

Динамика АТФазной активности в субклеточных структурах тканей куриных эмбрионовРевина, Анна Борисовна

Антиокислительная активность тканей пойкилотермного животного в динамике гипотермии и самосогревания Магомедова Нурият Гусеновна

Температурная зависимость активности катепсина Д из мозга суслика (Citellus pigmeus Pallas) в динамике зимней спячки Магомедова Зайнаб Таймударовна