Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
Интеграза вируса иммунодефицита человека 9
1.1 Вирус иммунодефицита человека 9
1.1.1 Общая характеристика ВИЧ 9
1.1.2 Цикл репликации ретровируса ВИЧ 9
1.2ИнтегразаВИЧ-1 11
1.2.1 Строение и каталитические свойства ИН ВИЧ -1 12
1.2.1.1 Строение каталитического домена 14
1.2.1.2 Строение N-концевого домена 17
1.2.1.3 Строение С-концевого домена 19
1.2.1.4 Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы 21
1.2.1.5 Структура полного фермента 23
1.2.2 Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 с олигонуклеотидами и ДНК 26
1.2.2.1 Взаимодействие интегразы с ДНК 26
1.2.2.1.1 Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК 26
1.2.2.1.2 Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК 27
1.2.2.1.3 Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК 30
1.2.2.2 Взаимодействие ИН ВИЧ-1 с олигонуклеотидами 32
1.2.3 Олигомеризация ИН ВИЧ-1 34
1.2.3.1 Роль олигомерного состояния ИН во взаимодействии с ДНК 38
1.2.4 Реакция интеграции вирусной ДНК 40
1.3 Подходы к изучению механизмов узнавания ДНК ДНК-зависимыми ферментами 43
1.3.1 Типы взаимодействий при узнавании ДНК различными белками и ферментами 46
2. Экспериментальная часть 48
2.1 Реактивы и материалы 48
2.2 Методы 51
2.2.1 Электрофоретический анализ белков 51
2.2.2 Окраска ПААГ нитратом серебра 51
2 2 3 Опоепеление концентрации белков 51
2.2.4 Концентрирование препаратов белка 52
2.2.5 Отжиг комплементарных цепей олигонуклеотидов 52
2.2.6 Получение меченого субстрата 52
2.2.7 Получение Р32-меченых олигонуклеотидов с помощью Т4-полинуклеотидкиназы .53
2.2.8 Анализ влияния различных олигонуклеотидов на реакцию З'-процессинга 53
2.2.9 Подготовка препаратов ИН для измерения методом МУРР 55
2.2.10 Измерение спектров малоуглового рентгеновского рассеяния 55
2.2.11 Определение олигомерных форм ИН электрофорезом в ПААГ 55
2.2.12 Разделение иммуноглобулинов из крови ВИЧ-инфицированных больных 56
2.2.13 Иммобилизация белка на BrCN-сефарозу 56
2.2.14 Аффинная хроматография AT на ИН-сефарозе 56
2.2.15 «Кислотный шок» препаратов антител 57
2.2.16 Хроматография на колонке с иммобилизованными AT против легких цепей IgG
человека 57
2.2.17 Определение протеолитической активности антител 57
2.2.18 Определение субстратной специфичности иммуноглобулинов 58
2.2.19 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность антител .58
2.2.20 Определение типа протеолитической активности иммуноглобулинов с помощью ингибиторного анализа 58
2.2.21 Определение оптимального значения рН реакции гидролиза интегразы 59
2.2.22 Определение кинетических параметров реакции гидролиза субстрата антителами59
2.2.23 Тестирование ИН-гидролизуюицей активности AT после электрофореза 59
2.2.24 Модификация продуктов гидролиза ИН ВИЧ-антителами 59
2.2.25 Метод MALDI-TOF 60
3. Результаты и их обсуждение 61
3.1 Взаимодействие интегразы с различными олигонуклеотидами 61
3.1.1 Взаимодействие ИН со «стандартным» субстратом 61
3.1.2 Взаимодействие фермента с различными олигонуклеотидами 63
3.1.2.1 Взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с неспецифическими одноцепочечными олигонуклеотидами 63
3.1.2.2 Сродство ИН к неспецифическим ДНК-дуплексам 69
3.1.2.3 Активация ИН специфическими олигонуклеотидами 70
3.1.2.4 Сродство ИН к специфическим олигонуклеотидам 72
3.1.2.5 Сродство ИН к специфическим ДНК дуплексам 75
3.1.2.6 Термодинамическая модель взаимодействия ИН ВИЧ-1 со специфической последовательностью ДНК 76
3 2 Влияние нуклеотидов на олигомерное состояние интегразы 81
3.2.1 Подбор условий проведения экспериментов методом МУРР 83
3.2.3 Анализ взаимодействия ИН ВИЧ-1 с ДНК методом МУРР 85
3.2.4 Кинетическая схема олигомеризации ИН 87
3.2.5 Анализ кинетической схемы олигомеризации ИН 90
3.2.6 Расчет радиуса инерции олигомерных форм ИН-ON 92
3.2.7 Определение количества олигомерных форм ИН 95
3.2.8 Гипотетическая схема взаимодействия интегразы со специфическими и неспецифическими ON 97
3.3 Иммуноглобулины крови ВИЧ-инфицированных больных 102
3.3.1 Выделение иммуноглобулинов класса G и М из крови ВИЧ-инфицированных больных 104
3.3.2 Доказательства принадлежности каталитической активности непосредственно иммуноглобулинам 105
3.3.3 Анализ сродства AT к интегразе и их субстратная специфичность 108
3.3.4 Определение типа протеолитической активности AT 110
3.3.5 Влияние ионов двухвалентных металлов на каталитическую активность AT 112
3.3.6 Определение рН-оптимума гидролиза ИН антителами 114
3.3.7 Определение кинетических параметров реакции гидролиза интегразы иммуноглобулинами 114
3.3.8 Анализ продуктов гидролиза интегразы иммуноглобулинами классов G и М 116
3.3.8.1 Определение продуктов гидролиза ИН электрофорезом в ПААГ 116
3.3.8.2 Анализ продуктов гидролиза методом масс-спектрометрии 117
Выводы 123
Список литературы 124
- Вирус иммунодефицита человека
- Строение и каталитические свойства ИН ВИЧ
- Электрофоретический анализ белков
- Взаимодействие интегразы с различными олигонуклеотидами
Введение к работе
Взаимодействие белков с нуклеиновыми кислотами лежит в основе многих жизненно важных процессов живых организмов. Изучение механизма узнавания ДНК ферментами, а также механизма функционирования последних, позволяет проводить исследование таких важнейших процессов, как окислительный стресс, старение, патогенез, канцерогенез, генетический контроль, поддержание стабильности клеточного генома, его организации и эволюции. Интерес к ДНК-зависимым ферментам актуален еще и потому, что многие из них являются мишенями для большого числа антивирусных, антибактериальных и антираковых препаратов.
Вирус иммунодефицита человека входит в семейство ретровирусов и является возбудителем одного из самых опасных заболеваний современного общества - синдрома приобретенного иммунодефицита. Одним из направлений химиотерапии ВИЧ-инфекции является использование ингибиторов ключевых ферментов жизненного цикла ВИЧ -интегразы, обратной транскриптазы и протеазы.
Обратная транскриптаза катализирует реакцию синтеза одноцепочечной вирусной ДНК по матрице РНК. Затем с помощью этого же фермента достраивается вторая цепь ДНК. Интеграза ВИЧ осуществляет процесс встраивания двухцепочечной ДНК вируса в геном клетки хозяина, что вызывает хроническую инфекцию организма. Протеаза ВИЧ необходима для разделения длинной белковой цепочки на составные части в процессе репликации вируса.
Несмотря на то, что многие аспекты функционирования одного из ключевых ферментов вируса - интегразы достаточно хорошо изучены, все известные исследования в большинстве своем носят качественный характер, а многие количественные аспекты механизма узнавания и расщепления вирусной ДНК остаются невыясненными. Более того, с практической точки зрения такое изучение важно для поиска специфических ингибиторов интегразы.
Цель настоящей работы заключалась в анализе закономерностей взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных. Для этого необходимо было решить следующие задачи:
1. изучение на количественном уровне характер специфических и неспецифических взаимодействий ИН ВИЧ-1 с ДНК с помощью метода последовательного усложнения структуры ДНК-лиганда. Оценка относительного вклада различных специфических и неспецифических взаимодействий ИН с ДНК в обеспечение специфичности действия фермента;
2. определение зависимости олигомерного состояния и активности интегразы от длины и структуры специфических и неспецифических олигонуклеотидов. Установление механизма образования олигомернои каталитически активной формы 3. проведение исследования протеолитической активности у иммуноглобулинов классов IgG и IgM из крови ВИЧ-инфицированных больных, гидролизующих ИН:
- проверить выполнимость критериев отнесения каталитической активности антител крови ВИЧ-инфицированных больных непосредственно к иммуноглобулинам;
- изучить ферментативные свойства исследуемых абзимов (рН- и металл-зависимость, субстратная специфичность, кинетические параметры реакции гидролиза);
- определить сайт, по которому происходит расщепление интегразы иммуноглобулинами.
Вирус иммунодефицита человека
ВИЧ-1, один из самых опасных ретровирусов (сем. Retroviridae), является возбудителем синдрома приобретенного иммунодефицита человека (СПИД) [1-4]. Ретровирусы вызывают хроническую инфекцию клеток и для достижения этой цели используют уникальную стратегию репликации. Вирусный геном представлен одноцепочечной молекулой РНК, а в ходе репликации происходит образование двухцепочечной ДНК, которая интегрируется в геном клетки хозяина. Синтез вирусной ДНК по РНК осуществляется ферментом ревертазой (РНК- и ДНК-зависимая ДНК-полимераза, или обратная транскриптаза). Встраивание вирусной ДНК осуществляется с помощью интегразы.
Кроме обратной транскриптазы и интегразы, геномы ретровирусов кодируют протеазу (ПР), входящую в состав вириона, которая также катализирует один из важных процессов жизненного цикла вируса - разрезание прополипептида. Ферменты и вирусная геномная РНК находятся внутри икосаэдрического нуклеокапсида, который формируется матриксным, капсидным, нуклеокапсидным и структурными белками. В капсиде димерный геном РНК связан с молекулами нуклеокапсидного белка. Нуклеокапсид окружен внешней мембраной, липидный бислой которой пронизывает трансмембранный оболочечный гликопротеин др41, а на поверхности находится внешний оболочечный гликопротеин -др120[5-7].
Основные этапы репликации ретровируса представлены на рисунке 1 [7].
На первом этапе репликации ВИЧ связывается с клеткой-мишенью благодаря взаимодействию вируса с клеточным рецептором CD4 на поверхности Т-лимфоцитов [7]. Затем происходит слияние мембран клетки-мишени и вируса, что приводит к проникновению вирусной частицы в цитоплазму. Проникая в клетку, вирус теряет оболочку и высвобождает свою геномную РНК в составе нуклеокапсида в цитоплазму.
Следующим этапом репликации является образование ДНК в результате транскрипции РНК, катализируемой обратной транскриптазой. Вирусная РНК используется в качестве матрицы для синтеза провирусной ДНК, осуществляемого ревертазой вируса. Предполагается, что обратная транскрипция происходит внутри нуклеокапсида [8], а затем происходит миграция и интеграция провирусной ДНК. Провирусная двухцепочечная ДНК мигрирует в ядро [9] и интегрируется в геном клетки-мишени в результате эндонуклеолитического расщепления и реакций переноса цепи ДНК, осуществляемых интегразой [10, 11]. Данный процесс протекает в несколько стадий. Сначала фермент связывается со специфической ДНК и удаляет GT-динуклеотиды с 3 -концов каждой из цепей вирусной ДНК. Затем интеграза расщепляет хозяйскую ДНК и соединяет ее концы с вирусной ДНК [12].
Далее интегрированная провирусная ДНК транскрибируется РНК-полимеразами клетки хозяина. Сплайсинг вирусной мРНК происходит по механизмам клетки хозяина. Затем с вирусной мРНК синтезируются полипептидные предшественники. После сборки и почкования образуется незрелый неинфекционный вирус. Появление инфекционное связано с протеолитическим расщеплением полипептидов-предшественников [13]. Таким образом, в результате протеолиза молекул-предшественников под действием вирусной протеазы образуются зрелые формы как структурных (матриксный, капсидный, нуклеокапсидный) белков вируса, так и ферментов (ПР, ОТ, ИН).
В 1960-х годах Г. Темин высказал гипотезу, согласно которой репликация ретровирусов протекает через стадию образования ДНК, хотя их геном состоит из РНК, а затем ДНК встраивается в геном клетки хозяина. Это предположение привело к открытию фермента обратной транскриптазы, осуществляющей синтез вирусной ДНК по матрице РНК [14].
При исследовании сложных процессов ретровирусной интеграции в системе вируса миелобластомы птиц (AMV) был открыт новый фермент с эндонуклеазной активностью [15]. Позднее было показано, что этот белок закодирован в вирусном геноме и принимает участие в реакции встраивания вирусной ДНК в геном клетки хозяина [14], и данный фермент был назван интегразой.
ИН ВИЧ-1 относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят такие ферменты как транспозазы и ретровирусные ИН, а также РНКаза Н и резолваза Ruv С [16, 17]. Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению фрагментов ДНК внутри генома либо между геномами. Данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энергии и без изменения числа фосфодиэфирных связей. Кроме того, для ретровирусных интеграз характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНК-субстратом, однако, катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК [18].
ИН ВИЧ-1 осуществляет перенос молекулы ДНК вируса в геном зараженной клетки (рис. 2). Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3 -концов каждой цепи. Этот процесс - первая стадия интеграции, и она называется 3 -концевой процессинг (рис. 2 А). Далее ИН осуществляет перенос цепи - встраивание укороченной вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина (рис. 2 Б). Для осуществления 3 -концевого процессинга и переноса цепи ИН необходим кофактор; in vivo роль кофактора играют ионы Мд2+, реакции in vitro могут протекать также в присутствии ионов Мп2+ [19, 20].
Для осуществления стадии переноса цепи ИН необходимо связать сразу две молекулы ДНК: вирусную и клеточную. Причем встраиваемую вирусную ДНК называют субстратом ИН, а ДНК клетки хозяина - мишенью. Взаимодействие ИН с ДНК-субстратом носит строго сиквенс-специфический характер, в то время как мишень связывается с ферментом неспецифически. Все ретровирусные ИН высококонсервативны и обладают гомологией между собой, а также с множеством транспозаз [18]. Рассмотрим строение ИН ВИЧ-1.
Строение и каталитические свойства ИН ВИЧ
Следующим этапом репликации является образование ДНК в результате транскрипции РНК, катализируемой обратной транскриптазой. Вирусная РНК используется в качестве матрицы для синтеза провирусной ДНК, осуществляемого ревертазой вируса. Предполагается, что обратная транскрипция происходит внутри нуклеокапсида [8], а затем происходит миграция и интеграция провирусной ДНК. Провирусная двухцепочечная ДНК мигрирует в ядро [9] и интегрируется в геном клетки-мишени в результате эндонуклеолитического расщепления и реакций переноса цепи ДНК, осуществляемых интегразой [10, 11]. Данный процесс протекает в несколько стадий. Сначала фермент связывается со специфической ДНК и удаляет GT-динуклеотиды с 3 -концов каждой из цепей вирусной ДНК. Затем интеграза расщепляет хозяйскую ДНК и соединяет ее концы с вирусной ДНК [12].
Далее интегрированная провирусная ДНК транскрибируется РНК-полимеразами клетки хозяина. Сплайсинг вирусной мРНК происходит по механизмам клетки хозяина. Затем с вирусной мРНК синтезируются полипептидные предшественники. После сборки и почкования образуется незрелый неинфекционный вирус. Появление инфекционное связано с протеолитическим расщеплением полипептидов-предшественников [13]. Таким образом, в результате протеолиза молекул-предшественников под действием вирусной протеазы образуются зрелые формы как структурных (матриксный, капсидный, нуклеокапсидный) белков вируса, так и ферментов (ПР, ОТ, ИН).
В 1960-х годах Г. Темин высказал гипотезу, согласно которой репликация ретровирусов протекает через стадию образования ДНК, хотя их геном состоит из РНК, а затем ДНК встраивается в геном клетки хозяина. Это предположение привело к открытию фермента обратной транскриптазы, осуществляющей синтез вирусной ДНК по матрице РНК [14].
При исследовании сложных процессов ретровирусной интеграции в системе вируса миелобластомы птиц (AMV) был открыт новый фермент с эндонуклеазной активностью [15]. Позднее было показано, что этот белок закодирован в вирусном геноме и принимает участие в реакции встраивания вирусной ДНК в геном клетки хозяина [14], и данный фермент был назван интегразой.
ИН ВИЧ-1 относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят такие ферменты как транспозазы и ретровирусные ИН, а также РНКаза Н и резолваза Ruv С [16, 17]. Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению фрагментов ДНК внутри генома либо между геномами. Данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энергии и без изменения числа фосфодиэфирных связей. Кроме того, для ретровирусных интеграз характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНК-субстратом, однако, катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК [18].
ИН ВИЧ-1 осуществляет перенос молекулы ДНК вируса в геном зараженной клетки (рис. 2). Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3 -концов каждой цепи. Этот процесс - первая стадия интеграции, и она называется 3 -концевой процессинг (рис. 2 А). Далее ИН осуществляет перенос цепи - встраивание укороченной вирусной ДНК в ДНК клетки хозяина (рис. 2 Б). Для осуществления 3 -концевого процессинга и переноса цепи ИН необходим кофактор; in vivo роль кофактора играют ионы Мд2+, реакции in vitro могут протекать также в присутствии ионов Мп2+ [19, 20].
Для осуществления стадии переноса цепи ИН необходимо связать сразу две молекулы ДНК: вирусную и клеточную. Причем встраиваемую вирусную ДНК называют субстратом ИН, а ДНК клетки хозяина - мишенью. Взаимодействие ИН с ДНК-субстратом носит строго сиквенс-специфический характер, в то время как мишень связывается с ферментом неспецифически.
Все ретровирусные ИН высококонсервативны и обладают гомологией между собой, а также с множеством транспозаз [18]. Рассмотрим строение ИН ВИЧ-1.
Интеграза - вирусный белок с мол. массой 32 «Да - содержит 288 аминокислотных остатков в одной полипептидной цепи и обладает эндонуклеазной активностью. Частичным протеолизом и сайт-направленным мутагенезом было показано, что в структуре ИН можно выделить три домена: N-концевой домен (с 1 по 51 аминокислотный остаток), центральный (каталитический) домен (с 52 по 210 АК) и С-концевой домен (220 -288АКМ22-25].
N-концевой и каталитический домены содержат участки, характерные для всех ретровирусных интеграз, в то время как С-концевой домен существенно менее консервативен [26, 27]. На рис. 3 схематически изображены три домена ИН и выделены несколько консервативных аминокислотных остатков в каждом домене.
N-концевой домен фермента содержит консервативные АК-остатки: два гистидина и два цистеина, мотив ННСС, который связывает цинк. Связывание иона цинка инициирует сворачивание N-концевого домена в структуру, подобную цинковому пальцу, и запускает тетрамеризацию ИН, что приводит к увеличению каталитической активности фермента.
С-концевые домены интеграз разных ретровирусов различаются между собой, но все они обладают способностью неспецифически связывать ДНК.
Все три домена ИН участвуют в реакции З -процессинга и переноса цепи ДНК. Каталитический домен содержит сайт, принимающий участие в переносе полинуклеотида, а также осуществляет реакцию дезинтеграции [14, 24]. Эту реакцию может осуществлять изолированный каталитический домен, и эффективность реакции в данном случае сравнима с таковой для полного фермента [29]. Было показано, что N-концевой домен так же, как и каталитический, вносит вклад в ферментативную активность белка [24]. Однако роли N- и С-концевых доменов в реакции интеграции пока точно неизвестны [16, 30].
Ферментативная активность ИН in vivo регулируется вирусными и клеточными белками, присутствующими в нуклеопротеидном преинтеграционном комплексе. Хотя интеграза катализирует реакцию интеграции in vitro и в их отсутствии.
Пространственная структура ИН до сих пор точно не установлена. Закристаллизовать ИН ВИЧ-1 не удается из-за низкой растворимости фермента, а также его способности к агрегации [31]. Однако внесение в структуру доменов точечных мутаций, повышающих растворимость фермента, позволило определить структуры отдельных доменов и белков, состоящих из двух доменов: каталитического и С-концевого, а также N-концевого и каталитического [32].
Каталитический домен является участком ИН, наиболее устойчивым к протеолизу [33]. Кроме того, он наиболее консервативен по первичной структуре. Три АК-остатка: Asp-64, Asp-116 и Glu-152 - входят в состав каталитического центра фермента.
Структура каталитического домена ИН ВИЧ-1 была определена с помощью метода рентгеноструктурного анализа. Получить кристаллы каталитического домена ИН и определить его структуру позволила замена Рпе-185 на Lys [16, 30] или His; оба белка имеют похожую структуру [34]. Согласно полученным данным, каталитический домен фермента в кристалле образует димер сферической формы, каждый мономер которого образует полусферу. Центральный домен мономера ИН состоит из шести а-спиралей, расположенных по краям пяти р-складок [16, 34].
В образовании р-структур участвуют следующие АК-остатки: Р1-складка - с 60 по 68; Р2 - с 71 по 79; рЗ - с 82 по 99; р4 - со 111 по 115; р5-структура - со 135 по 138 АК. а-Спирали формируют: а1 - с 93 по 107; а2 - со 118 по 121; аЗ - со 123 по 133; а4 - со 154 по 166; а5 - со 171 по 186; аб - со 196 по 208 аминокислотный остаток. Ход полипептидной цепи изображен на рисунке 5 [16].
Электрофоретический анализ белков
Фосфорилирование олигонуклеотидов проводили с помощью метода переноса концевого фосфата с [у-32Р]АТР в 5-положение олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 согласно [160]. Реакционная смесь объемом 10-20 мкл содержала: 50 мМ Трис-НСІ, рН 7,5, 10 мМ МдС!2, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ спермидин, 0,1 М ЭДТА, 5-10 мкКи [у-32Р]АТР и 50-200 пмоль олигонуклеотида. Реакцию начинали добавлением 5 ед. акт. ПНК. После инкубации в течение 1 ч при 37С к реакционной смеси добавляли 1/2 объема 95% раствора формамида, содержащего 1 мМ ЭДТА, 0,0025% ксиленцианол и 0,025% бромфеноловый синий. Продукты реакции очищали электрофорезом в 20% ПААГ (7 М мочевина, 50 мМ Трис-боратный буфер, рН 8,2, 1 мМ ЭДТА, 0,8x150x300 мм). Электрофорез проводили при 1000 В до миграции красителя бромфенолового синего на ЛА пути. Положение меченого олигонуклеотида определяли радиоавтографией. 5-[32Р]-меченый олигонуклеотид извлекали из соответствующего участка геля пассивной элюцией раствором 3 М LiCI04 (3 х 30 мкл) в течение ночи, осаждали 10-кратным объемом ацетона, центрифугировали, промывали ацетоном (2 х 1,5 мл), сушили и растворяли в 10 мМ Трис-НСІ, рН 7,5.
Концентрацию олигонуклеотида определяли спектрофотометрически по поглощению на длине волны 260 нм с помощью микроспектрофотометра «Милихром» отечественного производства.
Анализ ферментативной активности. Активность интегразы в реакции отщепления концевого GT-динуклеотида (реакция З -процессинга) определяли в оптимальных условиях при 30С. Реакционная смесь (10-100 мкл) содержала: 20 мМ HEPES/NaOH (рН 7,5), 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCI, 7,5 мМ MnCI2, 0,05% Nonidet Р-40 и 10 нМ меченый субстрат (дуплекс 21-ON-G T и 21-ON-COM). Реакционную смесь инкубировали в течение 2-60 мин в присутствии 5 нМ фермента и отбирали аликвоты через определенные промежутки времени. Образование продуктов гидролиза анализировали с помощью двух подходов.
При использовании первого метода, реакцию останавливали добавлением к аликвоте реакционной смеси 5 мкл раствора, содержащего 7 М мочевину, ТВЕ (9 мМ Tpnc-NH2, 9 мМ НзВОз, 0,1 мМ ЭДТА), 0,01% бромфеноловый синий. Продукты реакции анализировали с помощью электрофореза в 15% ПААГ, содержащем 7 М мочевину с последующим радиоавтографированием и сканированием, а также определением радиоактивности, соответствующей пятну [32P]GT, по Черенкову на сцинтилляционном счетчике "Rackbeta".
При использовании второго метода аликвоты реакционной смеси наносили на диски из Whatman ЗММ. Диски промывали 1 раз 10% раствором ТХУ, 6 раз 5% раствором ТХУ, 1 раз ацетоном. Затем диски сушили и определяли уровень радиоактивности по Черенкову на сцинтилляционном счетчике "Rackbeta". Об образовании [32P]GT судили по убыли радиоактивной метки на бумажных дисках по сравнению с ее содержанием в контроле (инкубация субстрата в отсутствие ИН).
Влияние олигонуклеотидов на скорость реакции З -процессинга. Ингибирование реакции З -процессинга проводили после предварительной активации фермента в течение 30 мин при 30С. Предынкубационная смесь (20-100 мкл) содержала: 20 мМ HEPES/NaOH (рН 7,5), 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCI, 2 мМ CHAPS, 3% глицерин, 0,05% Nonidet Р-40, 10 мкМ ИН и 40 мМ MnCI2. Аликвоты (5-10 мкл) предынкубационной смеси разбавляли буфером (2 мМ HEPES/NaOH (рН 7,5), 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCI) до нужной концентрации и 2-5 мкл растворов добавляли в реакционную смесь для З -процессинга (конечная концентрация ИН была 5-10 нМ). В пробы добавляли ингибитор в различных концентрациях (10 8—10"5 М). Величину /С50 для ингибиторов, соответствующую понижению скорости реакции на 50%, измеряли при концентрации субстрата равной 2 Км (Км =1,5 нМ, по данным [12]) согласно [161, 162]. Продукты реакции анализировали с помощью двух методов, как описано выше.
Анализ активации ИН под действием различных олигонуклеотидов. Анализ влияния различных олигонуклеотидов на активность интегразы проводили с помощью ее предынкубации при 30С в течение 5-60 мин. Предынкубационная смесь (20-100 мкл) содержала 20 мМ HEPES/NaOH (рН 7,5), 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCI, 2 мМ CHAPS, 3% глицерин, 0,05% Nonidet Р-40 (NP-40), 10 мкМ ИН и олигонуклеотиды в различных концентрациях (0,5-15 мкМ). Через различные интервалы времени отбирали аликвоты (5-10 мкл) предынкубационной смеси, разбавляли буфером (2 мМ HEPES/NaOH (рН 7,5), 10 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА, 4 мМ NaCI), и аликвоты разбавленных растворов добавляли в реакционную смесь для реакции З -процессинга (конечная концентрация ИН была 5-10 нМ). Реакцию останавливали и продукты анализировали, как описано выше, в основном с помощью второго метода.
Для измерения спектров МУРР исходные препараты интегразы переводили в буфер, содержащий 0,05 М HEPES/NaOH, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 5% глицерин, 0,13 М NaCI, 7 мМ CHAPS, 0,5% Nonidet Р 40. Для этого препараты белка различной концентрации разбавляли буфером А в соотношении 1:2. Объем полученной смеси уменьшали в 2 раза с помощью концентрирования, используя центриконы (Centricon-10) на центрифуге Centricon-42K (ротор А-18С, 4500 д, при 4С). После чего опять разбавляли бусрером А в соотношении 1:2. И доводили до конечной концентрации 2-2,5 мг/мл как описано в п. 2.2.4.
Интенсивность рассеяния рентгеновских лучей растворами белка измеряли на малоугловом рентгеновском дифрактометре фирмы "Siemens" (Германия). Использовали излучение CuKo (А = 1,54 А) с Ni - фильтром и сцинтилляционный детектор. Измерения проводили в диапазоне углов 0,0134 5 h s 0,1072 (h = 4тг sin/ А, где - угол рассеяния). Растворы помещали в кварцевый капилляр диаметром 1 мм и толщиной стенок 0,01 мм, затем из камеры откачивали воздух до 0,1 мм рт. столба. Образец в кювете инкубировали 30 мин при 30С. Измерения интенсивностей рассеяния всех растворов были проведены со средней ошибкой в каждой точке 0,5%. Для определения изменений спектра рассеяния интегразы в зависимости от концентрации олигонуклеотидного лиганда к 40 мкл 6 10"5 М или 4-вЮ"5 М раствора белка в буфере, содержащем 0,05 М HEPES/NaOH, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, 5% глицерин, 0,13 М NaCI, 7 мМ CHAPS, 0,5% Nonidet Р-40, последовательно добавляли раствор олигонуклеотида и измеряли интенсивность рассеяния. Конечная концентрация ON превышала концентрацию белка в 4 раза.
Взаимодействие интегразы с различными олигонуклеотидами
Для изучения относительной скорости реакции З -концевого процессинга, катализируемого ИН ВИЧ-1, чаще всего используется не длинная вирусная ДНК, а короткий 21-мерный дуплекс, соответствующий 21 паре нуклеотидов концевой U5 последовательности провирусной ДНК: 5 -GTGGG-AAA-ATCCT-AGC-AGT 3 -CAC-ACCTTAG-AGACGCA Интеграза эффективно связывает этот дуплекс (условно обозначен далее как дцОТ-ON2i или «стандартный» субстрат) и отщепляет концевой динуклеотид GT. Как было показано в работе [12], реальная концентрация активных (каталитически активных) форм ИН, представляющих смесь мономеров и различных олигомеров, при добавлении в реакционную смесь ИН в концентрации 5-10 нМ в -100 раз ниже (5 рМ). В связи с этим, в условиях проведения эксперимента при использовании 10 нМ fl4GT-ON2i соблюдаются концентрационные условия реакции псевдопервого порядка, и реакция отщепления GT-динуклеотида достаточно хорошо описывается уравнением Михаэлиса-Ментен.
В данной работе были использованы препараты ИН, полученные по той же методике, что и в работе [12], а также соблюдены описанные ранее условия реакции. Эффективность образования [32P]GT в реакции ИН-зависимого гидролиза fl4[32P]GT-ON2i оценивали, определяя начальную скорость реакции с использованием линейных участков кинетических кривых, полученных двумя методами.
В качестве примера на рис. 20 приведены данные по анализу накопления [32P]GT в зависимости от времени реакции с помощью электрофореза в 12% ПААГ и методом кислотонерастворимых осадков, как описано в п. 2.2.8.
Радиоавтограф геля после электрофореза продуктов ИН-зависимой реакции З -процессинга: К -контроль (flM[3ZP]GT-ON2i), инкубированный 180 мин в отсутствие ИН; 1-30 мин; 2-60 мин; 3-80 мин; 4-90 мин; 5 - 120 мин; 6-150 мин; 7 - 180 мин инкубации реакционной смеси в присутствии 5 нМ ИН. Б - Кинетическая кривая накопления во времени продукта реакции [32P]GT, построенная с помощью метода кислотонерастворимых осадков.
Известно, что короткие олигонуклеотиды, включая [ P]GT, растворимы в 5% ТХУ, в то время как длинные d(pN)n с п больше 10 в таком растворе ТХУ не растворяются и выпадают в осадок. Это различие в растворимости коротких и длинных олигонуклеотидов используется для анализа образования продуктов с помощью метода кислотонерастворимых осадков. Аликвоты этих же реакционных смесей (рис. 20) были нанесены на диски из Whatman Змм, и затем растворимый в 5% ТХУ [32P]GT был удален путем последовательной промывки дисков в нескольких сосудах, содержащих раствор 10 и 5% ТХУ (см. раздел Методы п. 2.2.8 второй метод). Количество образующегося [32P]GT оценивали по убыли радиоактивной метки по сравнению с ее содержанием в контроле, когда A4[32P]GT-ON2i инкубировали в отсутствие ИН. Кинетические кривые, построенные по данным электрофоретического анализа и метода кислотонерастворимых осадков, практически совпадали. Поскольку метод кислотонерастиворимых осадков является более простым методом, позволяющим в одном эксперименте анализировать до 200 экспериментальных точек, соответствующих различным кинетическим кривым, большая часть описанных ниже данных была получена с помощью этого метода.
Ранее было показано, что зависимость скорости реакции от концентрации A4[32P]GT-ON2i имеет типичный гиперболический характер и хорошо описывается уравнением Михаэлиса-Ментен; величина Км для «стандартного» субстрата была найдена равной 1,5 ± 0,3 нМ [12], что согласуется с величиной Км для fl4[32P]GT-ON2i (1,3 ± 0,3 нМ), найденной в данной работе.
Взаимодействие фермента с различными олигонуклеотидами
Целью данного исследования был детальный анализ относительного вклада различных нуклеотидных звеньев (и их структурных элементов) специфической последовательности, соответствующей тупым концам вирусной ДНК (длинные концевые повторы), в эффективность взаимодействия фермента с вирусной ДНК и неспецифической, не соответствующей тупым концам вирусной ДНК. Анализ взаимодействия ИН с различными структурными элементами ДНК проводили с использованием метода последовательного усложнения структуры лиганда (ПУСЛ) в соответствии со схемой, описанной в п. 1.3.
Взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с неспецифическими одноцепочечными олигонуклеотидами
Ранее было показано, что неспецифические олигонуклеотиды являются конкурентными ингибиторами фермента по отношению к «стандартному» субстрату -дцЭТ-ОМ21 [12]. Это позволяло для определения эффективности взаимодействия ИН с различными лигандами использовать метод ингибиторного анализа.
На начальном этапе работы были использованы препараты ИН, которые не были предынкубированы с ионами Мп2+. Было установлено, что все неспецифические олигонуклеотиды и специфический динуклеотид GT ингибируют реакцию -процессинга, катализируемую ИН. В качестве примера на рис. 21 приведена зависимость скорости реакции от концентрации d(pA)i0 а со « Рис. 21. Зависимость активности ИН в реакции З -процессинга [Р32]-«стандартного» субстрата GT-ON21 от концентрации неспецифического олигонуклеотида d(pAi0). На рисунке представлены усредненные данные трех независимых измерений.
Для некоторых олигонуклеотидов были определены величины К,, которые в случае конкурентного ингибирования, как известно [161 -163], равны величинам К . Сродство ИН к коротким ON было относительно низким. Учитывая трудоемкость метода определения величин К, а также необходимость очень больших количеств коротких ON, были оценены величины ICso - концентрации лигандов, при которых достигается ингибирование реакции на 50%.
Похожие диссертации на Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больных
