Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия Васильева Инна Анатольевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 9

1.1. Реакция аминоацилирования тРНК 9

1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз. 9

1.3. Структура тРНК 13

1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК: методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли 15

1.4.1. In vivo и in vitro методы определения элементов специфичности 15

1.4.2. Распределение элементов узнавания в тРНК 17

1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования 23

1.4.4. Аминоацшшрование мини-тРНК субстратов (mini- и microhelices) 25

1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия 26

1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия 32

1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК 34

1.4.8. Механизмы контроля продуктивного связывания З-конца тРНК ..36

1.5. Фенилаланил-тРНК-синтетаза: структурно-функциональные особенности

фермента и его взаимодействия с субстратами 39

1.5.1. Общая характеристика структуры фермента... 40

1.5.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНКр е 41

1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента 45

Глава 2. Экспериментальная часть 50

2.1. Материалы 50

2.2. Методы исследования 51

2.2.1. Выделение плазмидных ДНК ...51

2.2.2. Гидролиз плазмидных ДНК эндонуклеазой рестрикции 53

2.2.3. Синтез и выделение тРНК-транскриптов 53

2.2.4.32Р-Мечение тРНК по 5'-концу. 53

2.2.5. Ступенчатая деградация тРНК с З'-конца. 54

2.2.6. УФ-индуцируемая модификация мутантных TPHKPhe 55

2.2.7. Частичный нуклеазный и щелочной гидролиз тРНК... 55

2.2.8. Получение транскриптов тРНКРНе, содержащих остаток s4U(s6G) на З'-конце, с использованием концевой СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансферазы 55

2.2.9. Получение диальдегидных производных тРНКРЬе 56

2.2.10. Получение s U-замещенных аналогов тРНКр е с использованием Т4 РНК-лигазы 56

2.2.11. Аминоацилирование тРНК е, тРНК е-транскрипта и его фотоактивных аналогов и неспецифичных тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой 57

2.2.12. Мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы фотореакциошюспособными аналогами тРНКРЬг и разделение продуктов модификации. 57

2.2.13. Аффинное мечение фенилаланил-тРНК-синтетазы диальдегидными производными тРНК е 58

2.2.14. Нуклеазный гидролиз продуктов модификации фенилаланил-тРНК-синтетазы 58

2.2.15. Определение констант диссоциации комплексов фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК 59

2.2.16. Гель-электофорез нуклеиновых кислот и белков 60

Глава 3. Функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия с фенилаланил-тРНК- синтетазой 62

3.1. Эффективность распознавания тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой Г. thermophilus на стадии связывания 62

3.1.1. тРНКРЬе Е. coli-эффективный субстрат фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus в связывании 62

3.1.2. Исследование стабильности третичной структуры мутантных TPHKphe с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях 65

3.1.3. Сравнение параметров связывания и аминоацилирования мутантных тРНК№е. 69

3.1.4. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с неспецифичными тРНК 76

3.1.5. Заключение к разделу 3.1 77

3.2. Роль низкомолекулярных субстратов и элементов узнавания в продуктивном взаимодействии фенилаланил-тРНК-синтетазы Т. thermophilus с акцепторным концом тРНКРЬе 79

3.2.1. Получение реакционноспособных аналогов тРНК е, исследование их субстратных свойств и аффинная модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы 79

3.2.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с акцепторным концом тРНКР1ге в присутствии низкомолекулярных субстратов 90

3.2.2.1. Влияние Phe и АТР на модификацию фенилаланил-тРНК-синтетазы различными аналогами тРНКрЧ 90

3.2.2.2. Роль низкомолекулярных субстратов в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК№е 92

3.3. Влияние нуклеотидных замен в тРНК е на ориентацию акцепторного конца в комплексе с фснилаланил-тРНК-синтетазой 103

3.3.1. Сравнительное исследование з4и-индуцируемой модификации фенилалаиил-тРНК-синтетазы аналогами тРНК№е, содержащими замены элементов узнавания , 103

3.3.2. Роль элементов узнавания тРНК е в функциональной ориентации акцепторного конца 111

Выводы 116

Список литературы 118

Приложение 138

• Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования
• Механизмы контроля продуктивного связывания З-конца тРНК
• Выделение плазмидных ДНК
• Исследование стабильности третичной структуры мутантных TPHKphe с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях

Введение к работе

Точность воспроизведения генетически заданной структуры белков зависит от способности аминоацил-тРНК-синтетаз (aaRS) узнавать и эффективно аминоацилировать соответствующую тРНК. Правильный отбор и аминоацилирование тРНК достигается благодаря взаимодействиям aaRS с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых "элементами идентичности" ("identity elements") или "элементами узнавания" ("recognition elements"). В настоящее время известны элементы идентичности для всех 20 систем тРНК-aaRS из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Thermits thermophilus и высших эукариот, включая человека [1]. Аминоацилирование тРНК - это многостадийный процесс, который включает первоначальное связывание субстратов, конформационную перестройку фермент-субстратного комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение продуктов. Несмотря на многочисленные исследования по проблеме "узнавания" тРНК, выполненные преимущественно с использованием генетических методов in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК [1,2], данные об уровне распознавания тРНК на стадии связывания и последующих этапах каталитического превращения получены для ограниченного числа систем. Взаимодействия аспартил-тРНК-синтетазы (AspRS) дрожжей и гистидил-тРНК-синтетазы (HisRS) Е. coli с антикодоном специфичных тРНК вносят основной вклад в прочность соответствующих комплексов и обеспечивают специфичность отбора на стадии связывания [3, 4]. Многочисленные биохимические и структурные исследования дрожжевой AspRS и ее взаимодействия с субстратами позволили установить, что связывание тРНЕС^ инициируется узнаванием антикодоновой петли, и что все элементы ее узнавания участвуют в формировании каталитически активного комплекса [5]. Селективность отбора тРНК ^IS на стадии связывания усиливается взаимодействием HisRS с устойчивым аналогом гистидиладенилата [4]. В то же время идентичность тРНК ^ф определяет преимущественно скорость переноса на нее активированной аминокислоты [6], Нарушения взаимодействий глутаминил-тРНК-синтетазы Е, coli с элементами идентичности тРНК ^п влияют на эффективность узнавания глутамина [7]. Способность тРНК оптимизировать взаимодействие фермента со специфичной аминокислотой обнаружена и для тРНК-независимых триптофанил- и серил-тРНК-синтетаз (катализирующих реакцию активации в отсутствие тРНК) [6, 8]. Уменьшение каталитической эффективности аминоацилирования тРНК^{р е} дрожжевой фенилаланил-тРНК-синтетазой в результате мутаций нуклеотидов, стабилизирующих третичную структуру, обусловлено в значительной мере ингибированием диссоциации пиро фосфата

[9]. Таким образом, индивидуальность систем проявляется не только в наборе элементов узнавания, но и выполняемых ими функциях.

Основной целью данной работы было изучение функциональной роли элементов узнавания тРНК на разных этапах взаимодействия: на стадии первоначального связывания тРНК синтетазой и последующих перестройках комплекса в каталитически активную форму, в том числе индуцируемых низкомолекулярными субстратами. В качестве объекта исследования была выбрана фенилаланин-специфичная система из Thermus thermophilus.

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) - один из наиболее сложноорганизованных ферментов семейства аминоацил-тРНК-синтетаз: субъединичная структура цитоплазматического фермента (ар)₂-типа эволюционно консервативна [10]. Согласно своим структурным характеристикам PheRS принадлежит к так называемому классу II синтетаз, но использует 2'-гидроксил концевой рибозы тРНК для переноса аминокислоты, подобно ферментам класса I [11-13]. Трехмерная структура PheRS Т. thermophilus и ее комплексов с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНК^РЬе) и фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) установлена с помощью рентгеноструктурного анализа (РСА) [10, 14-16]. Взаимодействие PheRS Т. thermophilus с тРНК^РЬе изучено с помощью биохимических методов [17, 18]. Идентифицированы элементы узнавания тРНК ^е в эволюционно различных организмах [19-26]. Структурные исследования ряда комплексов aaRS с тРНК на атомном уровне позволили понять молекулярную основу специфичности их взаимодействия, но для большинства систем не решена проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Данные РСА комплексов с правильной ориентацией ССА-конца получены пока для глутаминил-, глутамил- и аргинил-тРНК-синтетаз (GlnRS, GluRS и ArgRS) класса І, аспартил-, треонил- и серил-тРНК-синтетаз (AspRS, ThrRS и SerRS) класса II [5, 27-33]. Присутствие малых субстратов в активном центре является необходимым условием функционального связывания 3'-конца тРНК не только для тРНК-зависимых aaRS (GlnRS, GluRS и ArgRS, не синтезирующих аминоациладенилат в отсутствие тРНК). Для Asp- и Ser-специфичных ферментов класса II показано, что правильная ориентация акцепторного конца тРНК, необходимая для катализа, достигается только в присутствии АТР и аминокислоты [30, 31, 33]. Необходимость существования аналогичного механизма контроля для PheRS следует из анализа структуры комплексов фермента с отдельными субстратами (низкомолекулярными или тРНК^РЬе); перекрывание участков связывания концевого аденозина и фенилаланина создает серьезные препятствия для продуктивного взаимодействия [16]. Получение комплексов aaRS со всеми субстратами является большой удачей из-за ограничений, накладываемых условиями кристаллизации и

возможного протекания второй стадии реакции аминоацилирования в кристаллах [29]. С другой стороны, использование негидролизуемых аналогов аденилатов не всегда способствует связыванию и функциональной ориентации акцепторного конца тРНК. Так, в комплексах лизил- и пролил-тРНК-синтетаз, сокристаллизованных со специфичными тРНК в присутствии устойчивых аналогов аминоациладенилата, ССА-конец остается неупорядоченным [34, 35]. Альтернативным подходом к изучению структурной динамики взаимодействия с тРНК представляется метод аффинной модификации, применявшийся в основном в ранних исследованиях aaRS [36, 37].

Первой задачей данной работы было изучение эффективности распознавания специфичной и отбраковки неспецифичных тРНК PheRS Т. thermophilus на стадии связывания. Для её решения были определены константы диссоциации комплексов фермента с тРНК^Р11е различного происхождения, рядом мутантных tPHK^Phe Е. coli и неспецифичными тРНК и сопоставлены с известными кинетическими параметрами аминоацилирования.

Второй задачей было изучение функциональной роли фенилаланина и АТР в продуктивном связывании акцепторного конца тРНК^РЬе с помощью аффинного мечения PheRS аналогами тРНК ^е, содержащими различные реакционноспособные нуклеотиды на З'-конце.

Третьей задачей являлась оценка роли структурных элементов тРНК^РЬе, определяющих специфичность системы, в функциональном связывании акцепторного конца, контролируемом низкомолекулярными субстратами. Для ее решения был проведен сравнительный анализ продуктов мечения субъединиц PheRS Г. thermophilus s U76-замещенными аналогами тРНК^РЬе и ее мутантов (содержащих нуклеотидные замены в различных участках структуры) в отсутствие либо в присутствии малых субстратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Реакция аминоацилирования тРНК

Аминоацил-тРНК-синтетазы катализируют двустадийную реакцию этерификации тРНК соответствующей аминокислотой. На первой стадии аминокислота (аа) активируется с образованием связанного ферментом (Е) аминоациладенилата (аа-АМР) и освобождением пирофосфата (РР,):

Е + аа + АТР -» Е»аа-АМР + PPj На второй стадии активированная аминокислота переносится на З'-концевую рибозу соответствующей тРНК:

Е« аа-АМР + тРНК -* аа-тРНК + AMP + Е Как правило, каждой аминокислоте соответствует своя тРНК (или набор изоакцепторных тРНК [38]) и своя синтетаза, и в клетке существует 20 ферментов различной специфичности, хотя известны исключения для некоторых организмов. Например, многие архебактерии, грамм-положительные эубактерии и эукариотические органеллы не имеют функциональной глутаминил-тРНК-синтетазы (GlnRS) [39, 40]. В ряде архебактсрий не обнаружено AsnRS и CysRS [41]. Глутамил-тРНК-синтетаза (GIuRS) и аспартил-тРНК-синтетаза (AspRS) в этих случаях аминоацилируют тРНК^1п и тРНК^АїП глутаматом и аспартатом, соответственно; затем амидотрансфераза трансамидирует Glu-тРНК ^п и Asp-тРНК^" [41,42].

1.2. Два класса аминоацил-тРНК-синтетаз

Несмотря на общую роль в процессе биосинтеза белка, аминоацил-тРНК-синтетазы чрезвычайно разнообразны по размеру, первичной последовательности и пространственной структуре. Открытие характерных структурных мотивов, отражающих различия в топологии активных центров, позволило разделить синтетазы на два класса (табл. 1) [43, 44]. Каждый класс содержит по 10 ферментов различной специфичности. Единственным исключением является существование двух типов LysRS со структурной топологией 1-ого и П-ого классов [41,45]. Деление на подклассы основано на структурном сходстве каталитических и некаталитических доменов и их композиции [46, 47].

Ферменты класса I (представители подклассов 1а и lb являются мономерами, подкласс 1с - гомодимеры) содержат две консервативные последовательности фНфСп (His-IIe-Gly-His) и KmSKs (Lys-Met-Ser-Lys-Ser), образующие нуклеотид-связываюшую складку Россмана активного центра (Rossmann fold) (рис. 1, а). Синтетазы класса ІГ (обычно димеры или тетрамеры) характеризуются тремя мотивами. Мотив 1, содержащий консервативный остаток пролина, участвует в образовании межсубъединичных контактов.

Таблица 1. Структурные и функциональные различия двух классов аминоацил-тРНК-синтетаз [40,

48]

""Консервативные остатки обозначены большими буквами, строго консервативные — жирным
шрифтом; ф - гидрофобный остаток; х-любой остаток; цепь переменной длины (х^.^) в мотиве 2
образует петлю.

Мотивы 2 и 3, каждый из которых содержит консервативный остаток Arg, формируют часть активного центра (рис. 1, б). Структурное различие классов проявляется в конформациях связанного нуклеотидного субстрата: трифосфатная цепь АТР вытянута или изогнута в активном центре 1-ого или П-ого классов, соответственно. Второе принципиальное различие между ферментами двух классов состоит в способах связывания акцепторной ветви тРНК. Синтетазы 1-ого класса взаимодействуют с акцепторным стеблем со стороны малой бороздки, при этом вариабельная петля экспонирована в раствор. Ферменты П-ого класса связывают акцепторный стебель со стороны большой бороздки, и вариабельная петля контактирует с белком. З'-ССА-конец имеет шпилькоподобную структуру или вытянутую конформацию в комплексах синтетаз класса I и II, соответственно. Разделение синтетаз на два класса коррелирует с функциональным различием в стереохимии реакции аминоацилирования: ферменты класса I присоединяют аминокислоту к 2'-, а ферменты класса II - к З'-ОН-группе 3'-концевого аденозина тРНК. В настоящее время результаты рентгеноструктурных исследований комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз со специфичными тРНК в отсутствие или присутствии лигандов известны для шести представителей первого и восьми - второго класса (табл. 2) [40, 50, 51].

Риє. 1. Структура активных центров представителей 1-ого (GlnRS, а) и П-ого классов (AspRS, б). Показаны конформации АТР и З'-концевых последовательностей соответствующих тРНК в комплексах. Характерные структурные мотивы выделены разным цветом (в соответствии с их обозначением). Рисунок воспроизводится из обзора [50].

Рис. 2. Связывание АТР аминоацил-тРНК-синтетазами 1-ого (GlnRS, а) и П-ого (SerRS, б) классов. Изображены основные остатки и ионы Mg²⁺, взаимодействующие с субстратом. Водородные связи показаны зелеными линиями, (а) Остатки 40-^43 и 256-275 принадлежат мотивам фНфСп и KmSKs, соответственно, (б) Остатки 256-275 входят в состав мотива 2, a Arg386 - мотива 3. Консервативные остатки Asp332 и Glu345 связывают каталитический ион Mg²⁺. Рисунок воспроизводится из обзора [50].

Таблица 2. Наличие структурных данных для комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз с тРНК

"Указан субъединичный состав исследованных ферментов данной специфичности, ⁶Использованы сокращенные названия организмов: S. е.- Saccharomyces cerevisiae, Е. с. — Escherichia colt, Т. t. - Thermus thermophilics, S. a. - Staphylococcus aureus, M. j. -Methanococcusjarmaschii.

"Для аналогов субстратов использованы следующие обозначения: ТугОН, РгоОН -тирозинол и пролинол; АМРРсР и АМРсРР - содержат СНг-группу вместо Р-у- или а-р"-межфосфатного атома О в ATP; Val-AMS, Gln-AMS, Pro-AMS, Ser-AMS и Lys-AMS - аналоги аминоациладенилатов, содержащие вместо фосфатной сульфамоильную группу; GluOH-AMP

- аминоалкиладенилат, полученный конденсацией аминоспирта с AMP.

'Структура комплекса с тРНК в отсутствие (-) или в присутствии (+) различных наборов лигандов. Источник тРНК указан для гетерологичных комплексов, в остальных случаях тРНК и фермент одинакового происхождения. Приведены последовательности антикодонов, различающиеся в тРНК разного происхождения или в шоакцепторных тРНК, где I - инозин, Ч*

- псевдоуридин, U* - 5-метиламинометилуридин, Q - кьюозин.

''Отмеченные тРНК синтезированы транскрипцией in vitro.

Структурные основы взаимодействия с низкомолекулярными субстратами (АТР и аминокислотами) изучены для большинства синтетаз; механизмы катализа реакции активации являются общими внутри каждого класса [40, 48, 50]. В то же время каждая система индивидуальна в способах связывания тРНК из-за отсутствия общих тРНК-связывающих мотивов.

1.3. Структура тРНК

Все немитохондриальные тРНК (канонические) имеют вторичную структуру, получившую название "клеверный лист" и состоящую из пяти доменов: акцепторная ветвь, ТЧ'С-ветвь, вариабельная петля, антикодоновая ветвь и D-ветвь [71] (рис. 3, а). Их длина варьирует от 72 до 95 нуклеотидов [38] за счет различий в длине вариабельной и D-петель. Митохондриальные тРНК млекопитающих имеют явные отличия в структуре D- и ТС-ветвей или отличаются полным отсутствием D-ветви. Все известные трехмерные структуры тРНК образуют компактную L-форму, состоящую из двух частей -коаксиально соединенных под определенным углом друг к другу спиралей (рис. 3, б), удерживаемых сетью третичных взаимодействий и ионами Mg²⁺, стабилизирующими структуру. Ограничивают L-форму две функционально важные области тРНК: акцепторный стебель, взаимодействующий с активным центром соответствующей aaRS и участвующий в элонгации пептида на рибосоме, и антикодон, взаимодействующий с мРНК в процессе трансляции. Первая структура дрожжевой тРНК ^е была решена с помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением З А в 1974 году [72]. Трехмерная структура стабилизирована девятью третичными взаимодействиями оснований, которые, за исключением пары G19-C56, не относятся к уотсон-криковскому типу (табл. 3). Неустойчивая (wobble) G4-U69 пара вызывает частичное нарушение регулярности А-формы спирали акцепторного стебля. Дополнительные взаимодействия, которые служат для стабилизации общей третичной структуры, включают водородные связи между функциональными группами оснований и сахаро-фосфатным скелетом (2'-ОН-группами и фосфатными группами) и взаимодействия с ионами металла. Стэкинг-взаимодействия (межплоскостные взаимодействия оснований), стабилизирующие структуру, были обнаружены в центральной части молекулы тРНК, в одноцепочечном участке акцепторной ветви и антикодоновой петле. 4 гидратированпых иона магния (прочно связанных) стабилизируют петли и крутые переломы структуры, поддерживая функционально активную конформацию. Молекула полиамина, спермина, стабилизирует двойную спираль тРНК^РЬе. Эти же кристаллы были вновь проанализированы через 15 лет с высоким разрешением (2 А), и получена более точная информация о геометрии участков связывания ионов магния (см. рис. 3 а и б) и роли молекул воды в координировании ионов металла и стабилизации структуры тРНК [73]. В представленной модели обнаружены десять ионов магния, одна молекула спермина и 220 молекул воды. Параллельно другой группой авторов были получены новые кристаллы дрожжевой тРНК ^с, и решена структура (1,93 А) с помощью более совершенной техники. Новые версии трехмерной структуры тРНК ^е в основном подтвердили ранее полученную информацию, но при

Таблица 3. Третичные взаимодействия в дрожжевой тРНК

ТЧ'С-ветвь

D-петля

D ^G A , _4І1І
D CU C«G

G Ш G A GC

іантикодоновая ветвь

yW А ^Т

акцепторная ветвь

Рис. 3. Вторичная (а) и третичная {6) структуры дрожжевой тРНК^РЬе в соответствии с данными РСА [73]. Различные участки молекулы и их названия выделены одинаковым цветом на двух представленных моделях. Кружками темно-зеленого (для сильных взаимодействий) и светло-зеленого цвета (для слабых взаимодействий) с указанием номера обозначены ионы магния, зеленые стрелки указывают нуклеотиды, с которыми они взаимодействуют. Молекула спермина представлена в виде красных линий (б) или красных линий с четырьмя точками (а), соответствующими ее атомам азота; красными стрелками указаны взаимодействия спермина с тРНК. Обозначения модифицированных нуклеотидов соответствуют принятым [74].

детальном сравнении структур авторы обнаружили новые участки связывания двухвалентных катионов и молекул воды, а также отличия некоторых торсионных углов сахаро-фосфатного скелета, особенно в районах петель [75]. К настоящему времени получены кристаллы и расшифрована структура других тРНК как про-, так и эукариотического происхождения [51]. Все они имеют общую L-конформацию, в которой антикодон и З'-ССА конец расположены на концах двух спиральных зон. В то же время очевидно, что трехмерные структуры тРНК не идентичны, и различия обусловлены нуклеотидной последовательностью, связанными лигандами, длиной варьирующих районов цепи и, возможно, другими факторами,

1.4. Общие закономерности и особенности высокоспецифичного взаимодействия аминоацил-тРНК-сиитетаз с тРНК: методы выявления элементов идентичности в тРНК и исследования их функциональной роли

Аминоацил-тРНК-синтетазы специфически взаимодействуют с определенным набором нуклеотидных остатков тРНК, называемых "элементами идентичности" ("identity elements") или "элементами узнавания" ("recognition elements"). Дополнительная специфичность обеспечивается "негативными элементами" или "антидетерминантами", которые препятствуют аминоацилированию неспецифичной aaRS, Элементы узнавания и негативные элементы, взятые вместе, определяют специфичность аминоацилирования тРНК и известны как "элементы специфичности" или "детерминанты специфичности".

1.4.1. In vivo и in vitro методы определения элементов специфичности

Большие успехи в выявлении структурных элементов, по которым синтетаза отличает специфичную тРНК, достигнуты благодаря многочисленным исследованиям, выполненным преимущественно с использованием генетических методов супрессии белков in vivo и кинетических экспериментов in vitro с мутантными тРНК. Эксперименты in vivo сводятся к определению специфичности супрессорных тРНК и их разнообразных мутантных форм. Исследования in vivo проводят в физиологических условиях, когда aaRS, специфичные ко всем 20-ти аминокислотам, конкурируют за тРНК-субстрат. Несколько примеров представлены в таблице 4. Специфичность аминоацилирования супрессорных тРНК определяли анализом аминокислот, встроенных в позицию 10 транслируемого белка (дегидрофолат-редуктазы Е. coif), синтезированного на основе гена, несущего amber-мутацию кодона 10. Частота включения соответствующей аминокислоты в белок варьирует в диапазоне от 0 до 100%. Значительные эффекты (>90% включения неправильной аминокислоты), обусловленные, например, мутацией A20U в супрессорной

Таблица 4. Примеры исследований амнноацилирования in vivo [1]

amber антикодон - 5'-CUA-3\ Транслируемым белком является дегидрофолат-
редуктаза, экспрессированная в Е. coli; степень потери специфичности оценивается по
относительному содержанию аминокислоты, включенной в позицию 10 дегидрофолат-
редуктазы. и.о. - не обнаруживается (включение на уровне фона).

тРНК**⁶ приводят к полной потере специфичности, и А20 является основной детерминантой идентичности Arg-системы. Слабые эффекты обнаружены для amber тРНІС^⁸ дикого типа: количество включившейся природной аминокислоты уменьшалось до 37% , что объясняется заменой С35 в антикодоне тРНК ^є на U35, соответствующий элементу идентичности Lys-системы (при этом ошибочное включение Lys увеличивается до 55%). Множественная специфичность является общим свойством мутантных супрессорных тРНК и может быть обусловлена как удалением элементов идентичности данной системы, так и внесением элементов идентичности других систем.

Стратегия определения элементов узнавания in vitro полностью отличается. В этих опытах вместо оценки окончательной роли мутаций в синтезе белка определяют их физико-химические эффекты в реакции аминоацилирования путем измерения кинетических параметров (Км и к^і) для транскриптов генов тРНК и их мутантных форм. Специфичность aaRS к различным тРНК-субстратам оценивают, сравнивая отношение hJKu ("константа специфичности" или "каталитическая эффективность" реакции), где #cat - число оборотов фермента, а Ки - константа Михаэлиса для тРНК [81]. тРНК получают транскрипцией ДНК-матрицы с помощью Т7 РНК-полимеразы. В большинстве систем транскрипты, несмотря на отсутствие в них модифицированных оснований, являются не менее эффективными субстратами по сравнению с природными тРНК [1, 2]. Небольшим ограничением применения синтезированных in vitro тРНК является обязательное присутствие 5'-гуанозина, необходимого для эффективной траикрипции [82,

83J. Однако использование для инициации транскрипции динуклеотида NpG позволяет включать любое основание в 5*-конец тРНК [84]. Молекулы тРНК с модифицированными остатками можно получить с помощью химического синтеза, чтобы определить роль модифицированных нуклеотидов в узнавании. In vitro эксперименты с использованием индивидуальных тРНК и ферментов выполняются в отсутствие других 19 синтетаз и, следовательно, не в физиологических условиях. Несмотря на некоторые ограничения, эксперименты in vitro позволяют количественно оценить относительный вклад каждого элемента в процесс узнавания тРНК синтетазой. Кроме традиционного метода с использованием осаждения аминоацил-тРНК трихлоруксусной кислотой [85], в последнее время широко применяются методы, основанные на разделении в геле (в квазиравновесных условиях) [86]. Таким образом, оба подхода, in vivo и in vitro, являются взаимодополняющими и используются для полного определения детерминант специфичности. С помощью этих исследований для пар тРНК-синтетаза разной специфичности, выделенных из разнообразных источников, выявлено, что относительно небольшое число нуклеотидов в тРНК является критическим для специфичности аминоацилирования, и этот набор строго индивидуален для каждой пары. В настоящее время с помощью описанных подходов установлены элементы узнавания тРНК для всех 20 систем из Е. coli и для нескольких систем из дрожжей, Thermus thermophilus, архебактерий и высших эукариот, включая человека (табл. 5).

1.4.2. Распределение элементов узнавания ъ тРНК

Распределение элементов узнавания в тРНК представлено на рис. 4 для всех 20 aaRS-тРНК пар Е. соЦ, в соответствии с отличиями для 1-ого и П-ого классов. В обоих случаях элементы узнавания находятся преимущественно в двух периферических районах тРНК, антикодоне и акцепторном стебле. Нуклеотиды антикодона важны для узнавания большинства тРНК, Значительное уменьшение каталитической эффективности аминоацилирования наблюдали в результате единичных замен нуклеотидных остатков антикодона в 16-ти тРНК Е. coli, специфичных к Arg, Asp, Asn, Val, Gly, Gin, GIu, He, Met, Lys, Pro, Tyr, Thr, Trp, Phe и Cys (см. табл. 5). Тринадцать из 15-ти дрожжевых тРНК (исключая тРНК ^а и тРНК ^ег) и три из 6-ти изученных тРНК человека (кроме тРНК^Аа, тРНК^5ег и тРНК^ии) также содержат элементы узнавания в области антикодона. Средняя позиция 35 всегда важна для специфического узнавания. Нуклеотиды в 34-ом (варьирующие в изоакцепторных тРНК) и Зб-ом положениях антикодона используются реже как детерминанты специфичности. Для некоторых тРНК важность антикодона подтверждена дополнительными биохимическими экспериментами.

Таблица 5. Элементы узнавания* тРНК аминоацил-тРНК-синтетазами класса I (А) и класса II (Б)

Элементы узнавания перечислены согласно их положению в акцепторной ветви, антикодоновои шпильке и других районах тРНК. Элементы узнавания, идентифицированные in vitro, отмечены жирным шрифтом, in vivo — показаны на сером фоне, с использованием двух методов -полужирным шрифтом. Модифицированные нуклеотиды, являющиеся элементами специфичности, подчеркнуты. Нумерация остатков и обозначения модифицированных нуклеотидов соответствует общепринятым [74, 183], пурин и пиримидин обозначены символами R и Y, соответственно.

"Использованы сокращенные названия организмов: S. с. - Saccharomyces cerevisiae, Е. с. -Escherichia coli, Т. U - Thermus thermophilus, чел. - человека, млекопит. - млекопитающего, В. s. -Bacillus subtilis, М. j. - Methanococcus jannaschii , H. v. - Haloferax volcanii, H. NRC-1 -Halobacterium NRC-1, B. mori - Bacillus mori, A. th - Arabidopsis thaliana, A. fulgidus - Archeoglobus fulgidus. В данной позиции два основания могут быть элементами специфичности. ^вДанные получены с помощью рентгеноструктурного анализа.

^ГВ скобках указаны элементы, дополнительно необходимые для узнавания инициаторной тРНК⁰⁴*. Пары U4-A69, A5-U68 являются элементами узнавания, специфичными для тРНК^Мм. ^"Отсутствие 47-ого нуклеотида (А47), меняющее стабильность третичного взаимодействия ШЗ-G22-A46, рассматривается как детерминанта специфичности. Транскрипт аминоацилируется в 140 раз менее эффективно по сравнению с природной тРНК.

Класс I

б Класс II

Рис. 4. Распределение элементов узнавания тРНК Е. coli аминоацил-тРНК синтетазами класса I (а)

и класса II (б) в трехмерной модели тРНК . Размеры сфер пропорциональны частоте встречаемости элемента в данном положении в 10 системах (9-10-, 7-8-, 4-6-, 2-3- и 1-кратной). Выделенная в структуре (б) сиреневым цветом вариабельная петля является элементом узнавания в Ser-специфичной системе (где длина петли увеличена до 16 нуклеотидов). Рисунок воспроизводится из обзора [1].

Известно, что дрожжевая AspRS, ValRS, HisRS и MetRS Е. coli, TyrRS E. coli и Т. thermophilus и PheRS Т. thermophilus при взаимодействии с соответствующими тРНК защищают область антикодона от химической модификации и гидролиза нуклеазами [4, 17, 96, 184-186]. Интересно отметить, что в некоторых случаях замены нуклеотидных остатков антикодона, приводящие к изменению аминокислотной специфичности тРНК (соответствующей генетическому коду), не приводят к потере способности тРНК узнаваться исходной aaRS. По крайней мере, для трех тРНК Е. coli, специфичных к Ser-, Leu- и Ala, антикодон не важен для узнавания [см. обзор 2]. В случае тРНК ^ег Е. coli это неудивительно, так как ни один нуклеотид в антикодоне не является общим для всех шести изоакцепторов [183]. Элементы узнавания TPHK^Ser находятся в акцепторной ветви,

D-стебле и длинной вариабельной петле [102, 139-141]. тРНК, специфичные к Leu, также имеют длинную вариабельную петлю, которая важна для узнавания LeuRS человека, однако не является элементом специфичности в системе Е. coli [102-105, 107, 108], критическими для которой являются нуклеотиды А73 в акцепторной ветви и А14 в D-петле. Уникальная неканоническая пара оснований G3-U70 (wobble пара) в тРНК^А1а является основной детерминантой специфичности для AlaRS, и трансплантация ее в тРНК другой специфичности обеспечивает их аминоацшгарование аланином [76, 77]. Кроме трех нуклеотидов антикодона для некоторых ферментов 1-ого класса обнаружены дополнительные элементы узнавания в антикодоновой петле: в позиции 37 Не-, Met-, Gln-и Glu-специфичных тРНК Е. coli и дрожжевых tPHK^Lu и тРНК^Мя и в позиции 38 Не- и Gin-специфичных тРНК Е. coli (см. табл. 5). Для ферментов П-ого класса только дрожжевые тРНК^РЬе и tPHK^Asp имеют дополнительные элементы в антикодоновой петле.

Даже в системах, где антикодон является основной детерминантой специфичности, акцепторная ветвь также содержит необходимые для узнавания элементы. В ранних работах предполагали, что акцепторная ветвь тРНК может играть определяющую роль в аминоацилировании вследствие близости этого участка к каталитическому центру aaRS, а нуклеотид 73 в одноцепочечном участке этого фрагмента служит первичным сайтом дискриминации, так называемым "дискриминаторным основанием" [187]. Последующие исследования подтвердили справедливость гипотезы. Природа нуклеотида в этой позиции действительно важна для 18 систем Е. coli (за исключением Glu- и Thr-специфичных) и для 10 дрожжевых систем (Val-, Leu-, Met-, Cys-, Туг-, Tip-, Gly-, His-, Asp- и Phe-специфичных). Интересно отметить, что в Gly-, Тгр- и His-специфичных системах дискриминаторные основания являются видоспецифичными и различаются для прокариот и эукариот или архебактерий. Многие тРНК содержат важные элементы узнавания в первых четырех парах оснований акцепторного стебля (см. табл. 5): 2-3 пары в Val-, Met-, Cys-, Тгр-, Glu-, Gin-, Ser-, Thr-, Gly- и Ala-специфичных тРНК E. coli, тРНК^Тф В. subtilis, tPHK^Uu человека, TPHK^Thr T. thermophilus и тРНК^С1у дрожжевой и Т. thermophilics. Некоторые системы (например, Arg-, Leu-, Туг-, Asn-, Lys- и Phe-специфичные из Е. colt) не содержат детерминант специфичности в акцепторном стебле. тРНК ^u содержит уникальный дополнительный нуклеотид на 5'-конце, основание которого образует пару с дискриминаторным основанием и также является важным для узнавания [157-159, 162, 163]. К coli AlaRS чувствительна к замене атомов или групп первой пары G1-C72, тогда как пара G2-C71 может быть заменена другими комбинациями пурин-пиримидин без значительной потери эффективности аминоацилирования [179, 180]. Предполагается, что вторая пара определяет локальную структуру и электростатический потенциал

акцепторного стебля вблизи основного элемента узнавания (G3-U70). Согласно данным других исследователей, впервые применивших метод отбора функциональных тРНК (из огромного числа мутантов) по способности поддерживать рост клеток (инактивированньгх отсутствием гена тРНК^{А а}), акцепторный стебель тРНК^ узнается как целый структурный фрагмент, отдельные нуклеотиды которого вносят неодинаковый вклад в специфичность взаимодействия [178].

Число элементов узнавания в центральных районах молекулы тРНК (положениях 8-31 и 39-65) и их локализация варьируют в разных системах (сферы малого размера в позициях 8, 10-15, 20,20а, 22-24, 29, 41, 46 и 48 на рис.4, айв позициях 10, 11,15, 20, 24, 25, 44,45, 48, 59 и 60 на рис 4, б). Такие элементы обнаружены в шести системах класса I (Не-, Leu-, Cys-, GIu-, Сіп- и Arg-специфичной) и пяти - класса II (Ser-, Pro-, Gly-, Asp- и Phe-специфичной) (см, табл. 5). Пары оснований в антикодоновом стебле узнаются только двумя ферментами (IleRS и PheRS). Элементы специфичности в D-петле встречаются редко (нуклеотиды 18, 19 и 20а в различных тРНК ", 18 и 19 в тРНК ^а Т. thermophilus и 20 в различных тРНК^⁵ и тРНК^РЬс). Спаренные нуклеотиды в D-стебле важны для узнавания тРНК^І1е, тРНК^м", тРНК^Суї, tPHK^g1u, тРНК^с,я tPHK^Sm, тРНК^С1у и tPHK^Asp. Нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия, также являются детерминантами специфичности в ряде систем (специфичных к Leu, Cys, Glu, Pro и Phe). Структурные особенности некоторых тРНК используются как элементы узнавания: длинная вариабельная петля во всех тРНК^5ег [140, 142, 144] и тРНК^" человека [108], дополнительная пара оснований G1-N73 в тРНК^н,$ (С73 в Е. coli и А73 в дрожжевой) [157, 162, 163] и необычная G15-G48 пара оснований в TPHK^Cys Е. coli [79, 115], В редких случаях эту роль играют модифицированные нуклеотиды природных тРНК. Например, лизидин в позиции 34 (модифицированный U) является важной положительной детерминантой специфичности тРНК^ІІе Е. coli, а инозин 34 важен для узнавания дрожжевой тРНК^1,е [100, 101]. Кроме этого, модификации оснований могут служить отрицательными элементами, т. е. предотвращать узнавание тРНК неспецифичными aaRS. Лизидин в тРНК^[,е Е. coli блокирует ее аминоацилироваиие MetRS [99], и 1-метилгуанозин в позиции 37 дрожжевой тРНК^р препятствует ее ошибочному аминоацилироваишо ArgRS [188]. Другие примеры антидетерминант в гомологичных системах приведены в таблице 6. Они наглядно показывают, что тРНК, специфичные для синтетаз класса I, содержат антидетерминанты против ферментов класса II (TPHK^Uu/SerRS) и наоборот CrPHK^/ArgRS). В Leu/Ser системах наблюдается перекрестная защита от неспецифичного аминоацилирования, определяемая нуклеотидами, расположенными в противоположных частях структуры тРНК. А73 предотвращает аминоацилироваиие

Таблица 6. Примеры антидетерминант узнавания в гомологичных или гетерологичных системах (данные взяты из обзора [1] с дополнениями).

"Фермент, ошибочное аминоацилированис которым блокируется антидетерминантой; в скобках указано название организма для гетерологичной системы. Антидетерминанты против синтетаз другого класса.

"Данные получены с amber-супрессорной дрожжевой тРНК^1|с, экспрессированной in
vivo.
^гНемодифицированная тРНК^Тір.

tPHK^Uu SerRS человека (класс II), в то же время G37 в тРНК ^ег является антидетерминантой против дрожжевой LeuRS (класс I) [106, 108]. Хотя в настоящее время известны антидетерминанты лишь для некоторых систем, предполагается, что каждая тРНК имеет антидетерминанты против нескольких синтетаз.

В целом, элементы узнавания обнаружены в 40 позициях, включая 7 в антикодоновой петле, N73 и 5 концевых пар в акцепторном стебле. Оставшиеся 6-12 пар оснований коаксиальной спирали акцепторной ветви тРНК (образованной акцепторным стеблем и Т-ветвью) не содержат элементов специфичности ни одной из изученных систем и удалены в структуре комплексов от области контактов тРНК и синтетаз (рис. 5).

1.4.3. Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования

Замены элементов узнавания могут по-разному влиять на параметры реакции аминоацилирования. В исследованиях in vitro оценивают потерю кинетической специфичности (L) в результате мутаций (отношение величины каталитической эффективности аминоацилирования KJKu для тРНК дикого типа к соответствующему значению для мутанта). Вклад отдельных элементов в узнавание отличается для тРНК различной специфичности. Величина L может изменяться от средних (L<10) до

Рис. 5. Сравнение структур комплексов GlnRS (а) и AspRS (б) с соответствующими тРНК. Нуклеотиды, образующие по данным РСА [55, 66] контакты с ферментом или находящиеся в непосредственной близости к белку, отмечены сферами сиреневого цвета (являются элементами специфичности) или желтого цвета (не участвуют в узнавании). Рисунок воспроизводится из обзора [1].

значительных (L>1000) эффектов. Различия в силе детерминант узнавания наблюдаются и для тРНК одной и той же специфичности из разных видов организмов. Например, потеря специфичности Asp-системы в результате мутаций антикодона и дискриминаторного основания не превышает 10³ в эукариотах и более 10³ в прокариотах [см. обзор 1]. Кроме этого, в системах с несколькими элементами узнавания их индивидуальные вклады в общую специфичность относительно низки. Например, в дрожжевой Asp- и Phe-системах эффекты отдельных замен не превышают 10³. И, наоборот, когда количество элементов узнавания мало, их вклад в специфичность максимален. Яркими примерами являются основные элементы узнавания тРНК^⁸ Е. coli (пара G3-U70), и tPHK^His Е. coli (С73 и дополнительный нуклеотид G1 ,см. табл. 5); величина L в случае их замен превышает 10³. Относительные вклады величин к_сЛ и Км в кинетическую специфичность отличаются для разных элементов. Очевидно, что замена элементов узнавания может оказывать влияние на каталитическую эффективность тремя способами: за счет преимущественного изменения параметра fc_Cat или параметра Км или за счет смешанных эффектов &cat и Км- Наибольшие эффекты (чаще всего за счет изменения к_сгЛ и влияния на катализ аминоацилирования) проявляются для нуклеотидов, находящихся вблизи или в контакте с ферментом. Мутации элементов узнавания, отвечающих за формирование правильной структуры тРНК, чаще вызывают изменение К_т. В ряде случаев, элементы специфичности действуют косвенно, способствуя созданию специфической конформации

РНК, которая узнается синтетазой. Так, например, мутация пары G10-U25 в тРНК^, не образующей прямых контактов с AspRS [192], приводит к іСп-зависимому снижению эффективности аминоацилирования из-за нарушения третичного взаимодействия (N10-N25)-45 в мутантах [169].

Узнавание тРНК не является процессом изолированного взаимодействия отдельных нуклеотидов с соответствующими аминокислотами. Поскольку элементы идентичности чаще всего расположены в трех доменах тРНК (антикодоновой и акцепторной ветвях и центральной части молекулы), возникает вопрос, как же они действуют вместе, обеспечивая общую специфичность. При исследовании аминоацилирования двойных мутантов тРНК^Р1,е дрожжевой PheRS было обнаружено, что три элемента специфичности (антикодон, А73 и G20) функционируют независимо друг от друга [23]. 2-3-х кратное различие экспериментальных и вычисленных значений k_cti/K_m для двойных мутантов G20A/A73U и G34A/A73U существенно меньше эффектов индивидуальных мутаций. Функциональную взаимосвязь детерминант специфичности дрожжевой тРНК ^р (G73, G34, Ш5, С36 и G10*U25) изучали с помощью транскриптов с двумя или более мутациями в этих позициях [193]: множественные мутации оказывают влияние на эффективность аминоацилирования в основном на уровне A_cat. Значительные различия в экспериментальных и вычисленных значениях k_zJK_m для двойных мутаций с попарными замещениями в антикодоне и акцепторной ветви, а также в D- и акцепторной или D- и антикодоновой ветвях показали, что нуклеотиды, расположенные далеко друг от друга в трехмерной структуре тРНК^А*^р, действуют кооперативно, тогда как нуклеотиды антикодонового триплета действуют аддитивно или антикооперативно. Подобные свойства обнаружены и для элементов узнавания тРНК^ Т. thermophilus [168]. Наличие кооперативных эффектов в Asp-системе позволяет предположить, что в формировании функционально активного комплекса TPHK^Asp-AspRS играют важную роль конформационные изменения макромолекул.

1.4.4. Аминоацилирование мини-тРНК субстратов (mini- и microhelices)

Для выяснения роли общей структуры тРНК и отдельных элементов в узнавании, а также для выявления взаимосвязи элементов узнавания, находящихся в разных участках структуры, широкое распространение получили методы с использованием укороченных РНК, имитирующих тРНК-субстрат и содержащих важный фрагмент структуры тРНК. L-образная форма молекулы тРНК позволяет представить ее в виде двух двуспиральных структур, ограниченных Т- или антикодоновой петлями. Функциональная активность тРНК-минисубстратов, имитирующих акцепторный стебель (состоящих из акцепторного и

Т-стеблей) и содержащих элементы узнавания, впервые была предсказана и проверена Шиммелем и др. на аланиновой системе [194]. Впоследствии было исследовано множество других минисубстратов с короткими спиральными или одно цеп очечными участками (4 неспаренных нуклеотида вместо 7 в Т-петле). Такие министруктуры оказались хорошими субстратами для AlaRS и HisRS Е. coli, но плохими для SerRS Е. coli (несмотря на локализацию элементов узнавания в акцепторном стебле и отсутствие детерминант в антикодоновой петле тРНК^ег Е. colt). Низкая активность тРНК ^ег-минисубстрата определяется, по-видимому, отсутствием главного элемента узнавания — длинной вариабельной ветви [195]. Министруктуры, имитирующие акцепторную ветвь тРНК, специфичность которой определяется антико доном, a proiri должны быть не активны. Однако, такие тРНК аминоацилируются, хотя в большинстве случаев с более низкой эффективностью по сравнению с полноразмерной тРНК. Гипотеза о существовании "оперативного кода тРНК" в акцепторном стебле, обеспечивающего селективный отбор тРНК, предполагает, что подобные минисубстраты являются эволюционными предшественниками тРНК, и существует антикодон-независимая взаимосвязь между тРНК и специфичными аминокислотами [196]. На ранних этапах эволюции синтетазы имели, скорее всего, только каталитический домен (характерный для своего класса), и позднее, с приобретением ими дополнительных функциональных доменов, произошло образование второго домена тРНК, содержащего антикодон. Использование тРНК-минисубстратов позволило продемонстрировать, что информация может передаваться от антикодон-связывающего домена в активный центр синтетазы даже в отсутствие целостной L-структуры тРНК, хотя и не очень эффективно. Добавление фрагмента антикодонового стебля увеличивает эффективность аминоацилирования фрагментов акцепторного-ТТС стебля тРНК^ІІе Е. coli и дрожжевой TPHK^Val в 1,6 раза [см. обзор 2]. Однако, в других системах для аналогичных Gin-, Cys-, Asp- и Met-специфичных фрагментов не наблюдалось увеличения эффективности аминоацилирования в присутствии соответствующих антикодоновых шпилек. В совокупности эти эксперименты показали, что правильная общая структура тРНК в большинстве систем не только соединяет функциональные антикодоновую и акцепторную ветви, но также важна для оптимального аминоацилирования.

1.4.5. Функциональная роль элементов узнавания в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия

Аминоацилирование тРНК - это многостадийный процесс, который включает первоначальное связывание субстратов, конформационную перестройку фермент-

субстратного комплекса, химическую реакцию в активном центре и освобождение

продуктов. Многочисленные исследования по проблеме "узнавания" тРНК, выполненные

преимущественно с использованием генетических методов in vivo и кинетических

экспериментов in vitro с мутантными тРНК [1,2], позволили понять молекулярную основу

высокоспецифичного взаимодействия тРНК с синтетазами. Однако вопросы, связанные с

функциональной ролью элементов узнавания в обеспечении специфичности, требуют

дополнительных исследований независимыми методами. Эффекты мутаций супрессорных

тРНК на биосинтез белка ш vivo могут быть обусловлены изменением их взаимодействия -

не только с aaRSs, но и факторами трансляции. Установлено, что фактор EF-Tu связывает

одинаково эффективно правильные аминоацил-тРНК, тогда как его сродство к

ошибочным аминоацил-тРНК сильно варьирует в зависимости от природы аминокислоты

и тРНК [197]. Сложный характер кинетических параметров аминоацилирования не

позволяет однозначно оценить из их изменений относительный вклад элементов

узнавания в обеспечение специфичности на различных этапах взаимодействия

(первоначальном связывании и последующих стадиях каталитического превращения),

Сформулированные на основе кинетических исследований выводы, что специфичность

взаимодействия определяется в большей степени кинетическими (благодаря более

высоким значениям к_са для специфичной тРНК), чем термодинамическими (из-за

различий в значениях К_т) факторами [198, 199], упрощают реальную картину

многоступенчатого контроля специфичности в различных системах.

В ранних исследованиях распознавания специфичных и неспецифичных тРНК с

помощью методов быстрой кинетики Крауссом была предложена динамическая модель

процесса комплексообразования, происходящего в два этапа [200]. Первый

бимолекулярный этап (контролируемый диффузией) рассматривается как рекомбинация

за счет дальнодействующих электростатических взаимодействий: белок образует

множественные контакты с сахаро-фосфатным скелетом тРНК. Вторая стадия

мономолекулярна и заключается в конформационных изменениях комплекса,

обеспечивающих точную подстройку фермента и субстрата.

к к

тРНК + Е «=^ (тРНК Е)* ^ тРНК * Е

^К21 ^К32

первоначальное конформационная
связывание подстройка

Увеличение ионной силы раствора, как правило, значительно ослабляет прочность специфичных и неспецифичных комплексов, что свидетельствует об участии ионных взаимодействий в их образовании [201]. Известные к настоящему времени данные РСА для разных тРНК-синтетазных пар подтверждают полученные ранее с помощью

биохимических методов результаты о важной роли электростатических контактов в образовании комплекса. Каждая синтетаза создает свою уникальную конфигурацию общего положительного потенциала, который предопределяет способ посадки соответствующей отрицательно заряженной тРНК [для обзора см, 202]. Комплексы синтетаз с неспецифичными или специфичными гетерологичными (из других организмов) тРНК в большинстве случаев уступают по прочности специфичным комплексам (табл. 7).

Таблица 7. Константы диссоциации комплексов аминоацил-тРНК-синтетаз со

специфичными и неспецифичными тРНК

Приведены величины Кд, определенные различными методами: флуоресцентным титрованием^; фильтрованием на нитроцеллюлозных мембранах^(б>; ультрацентрифугированием^(в:1; методом лазерного рассеивания^; определены константы для неэквивалентных центров связывания тРНК^(д).

н. с. - нет связывания.

Эффективность распознавания тРНК на стадии связывания сильно варьирует в изученных системах и в различной степени зависит от рН, ионной силы и присутствия ионов Mg ⁺. Очевидно, что она определяется прочностью комплекса с родственной тРНК и структурными различиями специфичной и неспецифичных тРНК. Определяющая роль в обеспечении специфичности принадлежит водородным связям, гидрофобным и вандерваальсовым взаимодействиям [для обзора см. 1]. Положительно заряженные кластеры в концевых фрагментах эукариотических aaRSs (удлиненных по сравнению с их прокариотическими аналогами) участвуют в связывании тРНК, значительно увеличивая стабильность комплекса и каталитическую эффективность аминоацилирования [211-214]. Наличие этих доменов уменьшает эффективность дискриминации неродственных тРНК, как показано в случае дрожжевой AspRS [214]. В то же время для ряда систем показано использование электростатических взаимодействий для распознавания тРНК в процессе связывания [215-217]: отрицательно заряженные остатки аминокислот выступают в роли антидетерминантов по отношению к неспецифичным тРНК.

Процесс структурных изменений комплекса с тРНК, зарегистрированный в ранних исследованиях PheRS [200], характерен для специфичных пар: в гомологичной системе (дрожжевая PheRS/дрожжевая тРНК^РЬе) он протекает в 3-4 раза быстрее, чем у гетерологичной пары (PheRS .со//7дрожжевая тРНК^№е); взаимодействие с тРНК^Т}Т (не являющейся субстратом дрожжевой PheRS) происходило в одну стадию. Конформационная подстройка индуцируется связыванием 3'-концевого нуклеотида тРНК (табл. 8) [206,218].

Таблица 8. Кинетические и равновесные константы связывания различных производных tPHK^'ccn дрожжевой PheRS [206,218]

N - модифицированный нуклеозид на З'-конце тРНК.

F - формицин.

A(F)^H-r_ei - нуклеозид с окисленной периодатом натрия рибозой.

тРНК^р1,есс - TPHK^phe без З'-концевого AMP.

Модификации концевого основания замедляли вторую стадию, а удаление А76 приводило к ее исчезновению и уменьшению прочности комплекса (в 1,6-3 раза по различным оценкам). Возможность регистрации конформационных изменений комплекса по флуоресценции вайбутина, соседствующего с антикодоном, свидетельствует о глобальных перестройках с участием антикодоновой петли тРНК. Образование комплекса в присутствии устойчивого аналога аденилата (фенилаланиниладенилата) также было описано двустадийным механизмом, но обе стадии протекали значительно медленнее [218, 219]. Первая стадия уже не контролируется диффузией и, скорее всего, сопровождается быстрым конформационным переходом, неотделимым от рекомбинации. Очень медленная вторая стадия может рассматриваться как скорость-лимитирующая для реакции аминоацилирования в целом. Она наблюдалась и для тРНК с удаленным 3'-концевым нуклеотидом, хотя кинетические характеристики процесса зависели от его структуры. На основании этих наблюдений авторы сделали вывод, что конформационные изменения комплексов PheRS с тРНК в отсутствие и в присутствии аналога аденилата отражают разные процессы подстройки. Однако функциональная взаимосвязь между субстратами (тРНК и низкомолекулярными) не была установлена из-за отсутствия структурных данных для фермента.

Немногочисленные исследования по изучению роли элементов узнавания тРНК в обеспечении специфичности на различных этапах взаимодействия показывают многообразие механизмов, используемых различными ферментами. Взаимодействия дрожжевой AspRS с антикодоном специфичной тРНК вносят основной вклад в прочность комплекса и обеспечивают эффективную дискриминацию неспецифичных тРНК на стадии связывания: единичные мутации аминокислотных остатков, взаимодействующих с важными детерминантами в антикодоне тРНК^" (G34 и U35), приводят к наиболее значительному увеличению Ка (до 35-кратного) [3]. Нарушения контактов, ответственных за узнавание дискриминаторного основания (G73), обусловленные заменой остатков из консервативного мотива 2, оказывают менее выраженное дестабилизирующее влияние (в 3-7 раз). Отсутствие аддитивности эффектов мутаций остатков, контактирующих с различными нуклеотидами антикодона или антикодоном и G73, отражается в большей степени в изменениях скорости ацилирования (положительная кооперативность эффектов для двойных мутаций), чем прочности комплекса (слабая положительная или отрицательная кооперативность). Результаты этих исследований свидетельствуют о функциональной взаимосвязи основных элементов узнавания и триггерной роли антикодона в структурных перестройках комплекса, оптимизирующих продуктивное связывание акцепторного конца в активном центре фермента.

В сравнительном исследовании эффективности связывания HisRS Е. coli со специфичной tPHK^1Iis, рядом мутантных тРНК^Нії и дрожжевой тРНК^РЬе показана основная роль антикодона в специфичности отбора тРНК на уровне связывания [4]. Степень дискриминации неспецифичной тРНК ⁶ увеличивается (с 2- до 12-кратной) в присутствии устойчивого аналога гистидиладенилата и заметно уменьшается (как в присутствии, так и в отсутствие аденилата) при замене функционально значимого остатка из антикодон-связывающего домена HisRS. Уникальная дополнительная пара G"l-C73 в акцепторном стебле тРНК^ш важна только для эффективного катализа и не узнается на стадии связывания.

Результаты измерений кинетических параметров для глутамина в реакции
аминоацилирования мутантных катализируемой GlnRS Е. coli, показали, что

взаимодействия GlnRS с элементами идентичности тРНК ^п определяют эффективность узнавания глутамина: замены G73, третичной пары G10-C25 и трех нуклеотидов антикодона приводили к 5-20-кратному увеличению значения К_т для глутамина и снижению каталитической эффективности аминоацилирования (до 640-кратного) [7]. Влияние мутаций отдельных аминокислотных остатков белка, ответственных за узнавание тРНК , выражено слабее по сравнению с эффектами соответствующих нуклеотидных

замен, что может указывать на преимущественные структурные изменения тРНК, а не фермента в процессе их взаимодействия, Структурные исследования показали участие концевого аденозина тРНК ^п в формировании участка связывания глутамина [27] и позволили объяснить необходимость присутствия тРНК для активации аминокислоты. Мутации консервативных остатков Туг и Phe, образующих специфические контакты с А76 тРНК ^п и глутамином, оказывают существенно меньшее влияние на прочность комплекса GInRS с тРНК (значение . уменьшаются в 2-3 раза), чем на эффективность продуктивного взаимодействия с глутамином (величина К_т увеличивается в 5-70 раз) [220]. Для GluRS Е. coli, близкого структурного гомолога GInRS, показано, что мутация остатка из консервативного мотива, участвующего в связывании и узнавании акцепторного стебля тРНК^С1и_г только в 2 раза снижает прочность комплекса с tPHK^g1u, тогда как сродство к глутамату уменьшается более чем в 10 раз (по изменениям К& и К_т ) [221]. Таким образом, функциональная роль элементов узнавания тРНК " и тРНК ^lu в обеспечении правильной ориентации З'-конца тесно связана с прямым участием последнего в модуляции структуры активного центра фермента для эффективного взаимодействия со специфичной аминокислотой.

Способность тРНК оптимизировать взаимодействие aaRS с аминокислотой показана не только для тРНК-зависимых систем. Структурные изменения тРНК^Тф влияют на сродство (К_т) TrpRS Е. coli к триптофану [7]. Величина К_т для серина в реакции АТР-пирофосфатного обмена, катализируемой дрожжевой SerRS, уменьшается в 8 раз в присутствии гомологичной неаминоацилируемой TPHK^Sercc (с укороченным на одно звено 3'-концом) и лишь в 2 раза в присутствии TPHK^Ser Е. coli, не являющейся субстратом. [8]. Эффект, индуцируемый тРНК^5ег, значительно ослабевает при замене функциональных остатков петли мотива 2, ответственной за узнавание акцепторной ветви субстрата. Ошибочная активация треонина SerRS также зависит от мутаций консервативного мотива и присутствия тРНК^5егсс- Природа тРНК-зависимого контроля распознавания аминокислоты SerRS пока непонятна: согласно структурным, данным для бактериальной SerRS тРНК ^ег модулирует взаимодействие петли мотива 2 с АТР [33].

Единственное исследование, прямо демонстрирующее значение идентичности тРНК для обеспечения комплементарное между ферментом и субстратом в переходном состоянии реакции, выполнено с помощью методов нестационарной кинетики для Тгр-специфичной системы из Е. coli [6]. Мутации минорных элементов узнавания тРНК^Тгр (G73, A3 б, удаление А1) приводят к 3-20-кратному уменьшению константы скорости переноса триптофана на тРНК-субстрат, не оказывая практически влияния на эффективность связывания тРНК^Тгр с комплексом TrpRS -Trp-АМР. Комплекс TrpRS с

неспецифичной химерной тРНК^С1п(ССА), содержащей антикодон тРНК^Тф, уступает специфичному лишь в 4 раза в стабильности и в 30 раз в скорости каталитической реакции. Таким образом, наиболее эффективная отбраковка неродственных тРНК TrpRS происходит на каталитической стадии.

Обнаружено избирательное влияние неорганической пирофосфатазы на аминоацилирование мутантов дрожжевой тРНК ^е гомологичной PheRS: каталитическая эффективность увеличивается в 12-30 раз для структурных мутантов (с заменами GI9C/C56G или G20U), оставаясь существенно ниже соответствующего значения для тРНК ^е-транскрипта дикого типа, и лишь в 1,4-2,2 раза для A73U- и А35и*мутантов [9]. Как предполагают авторы, нарушение третичной структуры тРНК^РЬе меняет механизм реакции: диссоциация дирофосфата становится скорость-лимитирующей стадией. Наблюдаемые эффекты отражают события, происходящие в активном центре, и могут быть обусловлены различной степенью дезориентации акцепторного конца тРНК^РЬе в результате мутаций.

В заключение этого раздела хотелось бы отметить, что, несмотря на значительный прогресс в понимании проблемы специфичности тРНК-синтетазного взаимодействия, было бы неверным считать ее полностью решенной. Биохимические функции элементов узнавания, изученные для узкого круга систем, характеризуются разнообразием и индивидуальностью. Подобные исследования систем другой специфичности и различного происхождения, необходимость которых очевидна, могут выявить неизвестные ранее механизмы.

1.4.6. Природа контактов, обеспечивающих специфичность взаимодействия

К настоящему времени известны кристаллические структуры четырнадцати комплексов синтетаз с соответствующими гомологичными тРНК и четырех - с гетерологичными (см. табл. 2). Для многих комплексов (дрожжевых AspRS [184, 222, 223], ArgRS [224], PheRS [225], ValRS [96, 52, 225, 226], TyrRS [227] и SerRS [228], IleRS [100], SerRS [229] и ThrRS E. colt [230], PheRS T. thermophilus [17, 18], CysRS E. coli и человека [231]) получены данные РНКазного картирования (футпринтинга). В совокупности результаты этих исследований очень важны для понимания структурных основ узнавания тРНК синтетазами, поскольку позволяют выявить специфические контакты двух макромолекул. На рисунке 5 а, б приведено сравнение трехмерных структур комплексов GlnRS и AspRS, представителей разных классов, со специфичными тРНК. Нуклеотидные остатки, находящиеся в контакте с ферментом, обозначены сферами (фиолетового цвета - используются для узнавания, желтого цвета - не являются

элементами узнавания). В основном сиитетазы образуют контакты с двумя удаленными частями молекулы тРНК: акцепторной и антикодоновой ветвями, при этом сиитетазы I класса (GlnRS) взаимодействуют с нуклеотидными остатками 5'-конца тРНК, а класса II (AspRS) - с З'-концом, Лишь некоторые нуклеотидные остатки акцепторной ветви, образующие контакты с ферментом, важны для узнавания. Большинство же остатков антикодоновой ветви (особенно в Gin-системе), взаимодействующих с ферментом, являются элементами узнавания. Взаимодействие тРНК с aaRS сопровождается конформационными изменениями обеих макромолекул [для обзора см. 51]. Кристаллографические данные о структуре комплексов GlnRS (класс I) и AspRS (класс II) со специфичными тРНК наглядно показали значительную деформацию антикодоновых петель обеих тРНК, а в случае тРНК^С1п структурные изменения происходят также в акцепторном стебле. В аспартатной системе общая структура тРНК^Р, находящейся в комплексе с ферментом, становится более компактной, чем в свободной молекуле тРНК ^р, за счет уменьшения угла между двумя непрерывными спиралями L-формы. ССА-конец в тРНК принимает U-образную конформациго, и первая пара акцепторного стебля разрушается (см. рис. 5 а). Изгиб акцепторной ветви в районе N73 характерен для комплексов синтетаз 1-ого класса и необходим, по-видимому, для правильного расположения акцепторного конца в активном центре. Разрушение первой пары не является универсальным для этого класса. Так, по данным "F-ЯМР [232] и PC А [52] в комплексе ValRS с тРНК^Уа] пара G1-C72 сохраняется. В тРНК^мр концевая ССА-последовательность является целостным продолжением акцепторного стебля и ориентирована в каталитический центр AspRS (см. рис 5 б). Такое структурное различие обусловлено разными способами связывания акцепторного стебля тРНК-субстрата

синтетазами I и II классов: со стороны малой бороздки тРНК и большой бороздки тРНК^^р.

Прямое взаимодействие с детерминантами специфичности является общим свойством синтетаз, как показано с помощью кристаллографических исследований. Так, основные элементы узнавания в антикодоне Arg-, Не-, Val-, Gin-, GIu-, Туг-, Pro-, Thr-, Asp-, Lys- и Phe-овой тРНК [для ссылок см. табл. 2] образуют контакты с аминокислотными остатками соответствующих ферментов. Для специфических взаимодействий используются чаще всего водородные связи. Мутации элементов узнавания тРНК приводят к утрате части или всех водородных связей и снижают эффективность аминоацилирования. Кроме прямого взаимодействия с детерминантами специфичности существуют способы непрямого узнавания локальной или общей конформации тРНК. Например, механизм узнавания дискриминаторного основания

различен в Asp- и Gin-системах. G73 дрожжевой тРИК^ образует прямые контакты с
аминокислотными остатками гомологичной AspRS [66]. В то же время в глутаминовой
системе Е. coli G73 не образует взаимодействий с синтетазой; водородная связь между 2-
аминогруппой G73 и фосфатной группой А72 стабилизирует функционально активную
конформацню акцепторного конца [55, 56]. Третичные нуклеотиды также, по-видимому,
непрямым способом участвуют в узнавании тРНК, поскольку в большинстве
закристаллизованных комплексов не обнаружено специфических взаимодействий белков
с нуклеотидами центральной части молекулы тРНК [52, 55, 56 и др. из табл. 2]. Мутации
нуклеотидов, образующих третичные взаимодействия, оказывают меньшее влияние на
эффективность аминоацилирования (обычно Ю-100-кратное уменьшение), по сравнению с
заменами нуклеотидов, образующих специфические контакты (уменьшение на 3-5
порядков величины). Функциональная роль этих взаимодействий состоит в стабилизации
общей конфигурации тРНК, необходимой для оптимального неспецифического
связывания рибозо-фосфатного скелета и структурной взаимосвязи прямых элементов
узнавания. Так, относительный вклад необычной третичной пары оснований G15-G48 в
эффективность аминоацилирования TPHK^Cys Е. coli зависит от природы нуклеотидов в
соседних позициях D-петли, модулирующих ее конформацню [117]. Ключевую роль в
узнавании тРНК¹"^ LeuRS играют нуклеотиды A15-U48, А20а и GI8G19, ответственные за
формирование пространственной структуры и конфигурации отдельных её районов [104].
SerRS Г. thertnophilus узнает конформацню тРНК благодаря неспецифическим
взаимодействиям с рибозо-фосфатным скелетом длинной вариабельной ветви без каких-
либо контактов с антикодоном [64]. Для узнавания тРНК^Аа и тРНК^С1п Е. соїі, тРНК ^уг из
архебактерии Methanococcus jannaschii и дрожжевых тРНК^ег и тРНК ^е длина
вариабельной и/или D-петель важнее, чем их последовательность [1, 129, 132, 142]. Для
идентичности человека большое значение имеют последовательность и

ориентация удлиненной вариабельной петли [108]. Результаты многочисленных биохимических исследований Ala-системы Е. coli находятся в противоречии: некоторые из них свидетельствуют о прямом узнавании основной детерминанты специфичности, wobble пары G3-U70, а другие - о ее структурной роли в создании уникальной конформации акцепторного стебля [76, 77,173-175, 177]. Окончательное решение вопроса о механизме дискриминации тРНК ³ требует кристаллографического анализа комплекса.

1.4.7. Динамика взаимодействия с тРНК

Основные данные по идентификации химической природы контактов между тРНК и синтетазами получены с помощью кристаллографических методов. Динамический

процесс белок-нуклеинового взаимодействия заключается не только в разрушении и образовании связей и контактов, но и в переориентации целых структурных доменов белка и тРНК. Биохимические и структурные данные по взаимодействию дрожжевой AspRS, наиболее изученной среди аминоацил-тРНК-синтетаз, с гомологичной позволили установить, что связывание субстрата инициируется узнаванием антикодоновой петли, и что все элементы узнавания tPHK^ участвуют в формировании каталитически активного комплекса [3, 5]. На основе структурного анализа четырех эволюционно различных комплексов предложена динамическая модель связывания и узнавания тРНК^р [5, 68-70]. Неспецифические взаимодействия нуклеотидов центральных районов тРНК*⁴⁵ с остатками N-концевого антикодон-связывающего домена и шарнирного доменов (соединяющего антикодон-связывагощий с каталитическим) AspRS насталий первоначального связывания (преимущественно с помощью электростатических контактов) ориентируют остов тРНК в благоприятной позиции по отношению к узнающим остаткам белка. Первой узнается и связывается антикодоновая петля тРНК^Аїр, содержащая главные элементы специфичности. Последующий конформационный сдвиг антикодон-связывающего домена способствует сближению D-стебля с шарнирным доменом, взаимодействие которых завершается связыванием акцепторной ветви. Конформационные изменения обоих партнеров оптимизируют их взаимное соответствие, что приводит к формированию компетентного комплекса. Хотя детали узнавания на молекулярном уровне остаются непонятными и вопрос о последовательности или одновременности событий, связанных с конформационными изменениями партнеров, требует специальных исследований, предложенная модель может иметь общее значение для антикодон-узнающих систем. Так, в связывании тРНК^С1п также участвуют три домена GlnRS Е. colt, взаимодействующие с акцепторным стеблем, антикодоном и D-ветвью субстрата [56, 57]. Узнавание тРНК определяется в первую очередь взаимодействием U35 с Arg34I из антикодон-связывающего домена и передается в активный центр, удаленный более чем на 35 А. Функциональную и структурную взаимосвязь между доменами, связывающими антикодон и акцепторный стебель, осуществляет "соединительный пептид": его наиболее важный остаток Glu323 образует контакты с третичной парой G10-C25. Взаимодействия акцепторного стебля тРНК с соответствующим доменом, критическая роль в которых принадлежит остаткам Lysl36 и Asp235, стабилизируют его конформацию [233]. Связывание акцепторного конца тРНК в активном центре синтетаз первого класса сопровождается структурным изменением акцепторной ветви: вытянутая конформация З'-одноцепочечного фрагмента, продолжающего двуцепочечную спираль в исходной тРНК, становится шпилькообразной

и стабилизируется уникальными для каждой системы взаимодействиями РНК-белок и РНК-РНК [29]. В некоторых комплексах деформация ветви сопровождается разрушением первой пары оснований. Анализ комплексов синтетаз с тРНК, закристаллизованных в различных функциональных условиях (см. раздел 1.4.8), показывает, что конформация акцепторного конца тРНК зависит и от взаимодействий фермента с малыми субстратами (или их аналогами).

Структурные данные для комплексов синтетаз с тРНК обеспечивают необходимую информацию о природе контактов и позволяют понять основные принципы конформационных изменений, происходящих в макромолекулах. Однако кристаллография не позволяет дифференцировать элементы структуры тРНК, необходимые для специфического узнавания синтетазой, связывания и катализа. Полную информацию можно получить только из сопоставления результатов структурных и функциональных методов анализа.

1.4,8. Механизмы контроля продуктивного связывания З'-конца тРНК

Первые исследования по влиянию природы нуклеотидов 3'-концевой ССА последовательности на взаимодействие тРНК с синтетазами, результаты которых суммированы в обзоре Шпринзла и Крамера [234], были проведены в 70-е годы. Было показано, что укорачивание с З'-конца либо изменение числа остатков цитидина (С) в ССА последовательности приводят к потере акцепторной активности дрожжевой тРНК ^е, тРНК^р1,е и тРНК Е. coli. тРНК^Туг и тРНК^ К coli сохраняют субстратные свойства при замене остатков С на уридин, в то время как тРНК ^et с подобной модификацией не обладает акцепторной активностью. В случае дрожжевой тРНК ^е модификации остатков С74 и С75 (замена одного или двух на 2-тио- или 5-иодцитидин) приводили к 2-6-кратному, а замена А76 на формицин - к 55-кратному снижению каталитической эффективности аминоацилирования [234], тогда как замена А76 на 1,N -этеноаденозин приводила к полной потере акцепторной активности [235]. На основании этих данных была высказана идея о триггерной роли З'-концевого аденозина тРНК в процессах подстройки, ведущих к образованию каталитически активного комплекса [234, 235].

В более поздних исследованиях, выполненных для Val-специфичной системы Е. coli, отмечено значительное уменьшение величины V_max/K_m при замене А76 или С75 на G (в 300 и 770 раз, соответственно) за счет изменения F_max; другие типы их замен приводили к менее выраженным эффектам (5-7- или 1,6-кратному уменьшению для А7б и С75, соответственно) [236]. При любых заменах С74 наблюдалось незначительное уменьшение эффективности аминоацилирования. В параллельных исследованиях той же системы

другими авторами [237] получены качественно похожие результаты, но отличающиеся количественными эффектами, что может быть обусловлено различной степенью чистоты тРНК-препаратов. В кинетических исследованиях аминоацилирования аналогов тРНК ^е Е. colt и Т. thermophilus, содержащих различные тринуклеотидные замены З'-конца, гомологичными PheRSs показано, что положения 74 и 75 могут быть заняты только пиримидинами, при этом остатки С предпочтительнее для эффективного катализа, чем остатки U: замена остатков С на А приводит к утрате субстратных свойств обеих тРНК^№е, а на U - к 8-кратному уменьшению величины У_т^1К_ш [238]. Снижение каталитической эффективности аминоацилирования в 180 и 140 раз для тРНК^РЬе Е. coli и Т. thermophilus, соответственно, наблюдалось при замене А76 на С (в основном из-за уменьшения скорости каталитического превращения), а замена А76 на U в _TPHK^phe с UUA -концом приводила к потере ее акцепторной активности. Таким образом, экзоциклическая аминогруппа и имидазольный цикл А76 играют, скорее всего, ведущую роль в продуктивном взаимодействии акцепторного конца тРНК с PheRS: отсутствие одного из этих структурных элементов (при замене на С) существенно влияет на эффективность катализа, а утрата обоих (при замене на U) приводит к утрате субстратных свойств. Полученные результаты свидетельствуют об активной роли ССА-конца в целом в продуктивном взаимодействии ValRS и PheRS со специфичными тРНК.

Известная структура ряда комплексов позволяет понять молекулярные основы специфичности взаимодействия синтетаз с тРНК, но для большинства систем остается нерешенной проблема продуктивного связывания акцепторного конца тРНК. Так в комплексах TyrRS, ProRS, LysRS и AspRS Т. thermophilus и TyrRS M.jannaschii (см. табл. 2) с гомологичными специфичными тРНК ССА-конец структурно не упорядочен (не виден на картах электронной плотности), независимо от присутствия низкомолекулярных лигандов. Данные рентгеноструктурного анализа комплексов с правильной ориентацией ССА-конца в активном центре получены пока только для GlnRS, GluRS и ArgRS класса I, AspRS, ThrRS и SerRS класса II [5, 27-33]. Присутствие малых субстратов в активном центре является необходимым условием функционального связывания З'-конца тРНК не только для тРНК-зависимых синтетаз (GlnRS, GluRS и ArgRS, синтезирующих аминоациладенилат только в присутствии тРНК-субстрата). Для Asp- и Ser-специфичных ферментов класса II показано, что правильная ориентация акцепторного конца тРНК, необходимая для катализа, достигается только в продуктивном комплексе в присутствии АТР и аминокислоты [30, 31, 33]. Взаимодействие HisRS (класса II) с устойчивым аналогом гистидиладенилата стабилизирует комплекс с tPHK^His и увеличивает специфичность отбора тРНК на стадии связывания [4].

Рис. 6. Различные конформаций петли (остатки 255-271) мотива 2 (зеленого цвета) в тройном комплексе SerRS Т. thermophilus (а) с тРНК⁵*' (красного цвета) и устойчивым аналогом аденилата Ser-AMS (Т-конформация) или двойном комплексе (б) с Ser-AMS (А-конформация). Показаны функциональные остатки SerRS, ответственные за стабилизацию двух конформаций петли и ориентацию акцепторной ветви TPHK^Ser в комплексе. Рисунок воспроизводится из работы [33].

Как показывают структурные исследования различных систем, в активном центре присутствуют консервативные петлевые фрагменты, конформационная подвижность которых обеспечивает динамику взаимодействия с субстратами в процессе аминоацилирования. Такую роль в Ser-специфичной системе выполняет петля мотива 2: различные конформаций петли в отсутствие и в присутствии тРНК ^г (А- и Т-конформации) стабилизируются разными типами взаимодействий с участием одних и тех же аминокислотных остатков (рис. 6). Ключевую роль в переключении конформаций играет остаток Glu258, образующий специфические контакты с нуклеотидной частью Ser-AMS (в А-конформации) или G73 TPHK^Ser (в Т-конформации) [33]. Акцепторная ветвь tPHK^Sw образует контакты с белком только в комплексе с устойчивым аналогом сери л аденилата, хотя даже в его присутствии два З'-концевых нуклеотида остаются неупорядоченными.

Связывание акцепторной ветви тРНК^ не требует присутствия малых субстратов, но в их отсутствие А76 занимает позицию ATP; АТР индуцирует конформационные изменения ССА-конца и акцепторного стебля [30]. В продуктивном взаимодействии AspRS с tPHK^Asp наряду с петлей мотива 2 участвует так называемая "перекидная" (flipping) петля (консервативная для всех AspRS), конформация которой зависит от присутствия и природы субстратов. В комплексе фермента с гомологичной тРНК ^р и аспартиладенилатом эта петля, находясь в "открытой" конформаций, стабилизирует

Рис. 7. а - Основные взаимодействия AspRS Е. coli с акцепторным концом гомологичной тРНК"^ (синего цвета) в присутствии Asp-AMP (зеленого цвета). Показаны петли, участвующие в связывании концевого аденозина tPHK^Asp в продуктивном комплексе: "перекидная" петля 167-173 в открытой конформации (оранжевого цвета) и консервативная для AspRS QPQ-петля 192-196 (голубого цвета). Петля 216-228 мотива 2 (розового цвета) образует многочисленные контакты с нуклеотидами в 73-ем и 74-ом положениях и двумя первыми парами акцепторного стебля, б -Ориентация концевого аденозина дрожжевой тРНК^ (желтого цвета) в активном центре AspRS Е. coli. "Перекидная" петля (выделена синим цветом) находится в закрытой конформации; А76 ориентирован в сторону от связанного ферментом Asp-AMP (зеленого цвета). Рисунки воспроизводятся из работ [31, 70].

ориентацию А76, необходимую для переноса Asp-субстрата (рис. 7, а). В неактивном комплексе AspRS Е. coli с дрожжевой tPHK^Asp (плохим субстратом) она принимает "закрытую" конформацию (образуя контакты с Asp-субстратом), и А76 ориентирован в сторону от активного центра (рис. 7, б). Взаимодействия петли мотива 2 с акцепторным стеблем tPHK^Asp (частично нарушенные в гетерологичном комплексе) выполняют регулирующую роль в конформационном переходе "перекидной" петли [70].

Аналогичная подвижная (flipping) петля в активном центре HisRS и ProRS не структурирована в отсутствие лигандов, необходимым условием для стабилизации ее конформации и связывания 3'-конца специфичной тРНК является связывание гистидина HisRS и пролиладенилата ProRS [62]. Разнообразие молекулярных механизмов, контролирующих продуктивное связывание акцепторного конца различных тРНК с соответствующими синтетазами с использованием характерных для систем структурных мотивов, позволяют рассматривать их как способы усиления специфичности на завершающем этапе взаимодействия.

1.5. Фенилаланил-тРНК-синтетаза: структурно-функциональные особенности фермента и его взаимодействия с субстратами

1.5.1. Общая характеристика структуры фермента

Фенилаланил-тРНК-синтетаза (PheRS) является одним из самых сложных ферментов семейства аминоацил-тРНК-синтетаз. Все известные цитоплазматические PheRS имеют редкую (для аминоацил-тРНК-синтетаз) тетрамерную субъединичную структуру (ар)₂ [10]. Решена структура комплексов фермента (из Т. thermophilus) с отдельными субстратами (фенилаланином, тРНК^РЬе) и промежуточным продуктом фенилаланиладенилатом (Phe-AMP) [14-16]. По характерным структурным мотивам активного центра фермент относится к классу II, но подобно ферментам первого класса использует 2'-ОН-группу концевого аденозина для переноса аминокислоты [11-13]. Каждый сф-гетеродимер состоит из 11 структурных доменов: трех доменов малой а-субъединицы (А1, А2 и N-концевого фрагмента) и восьми - большой Р-субъединицы (В1-В8). Активный центр размещен целиком на а-субъединице. Двухвалентный катион, обнаруженный в области контакта а- и р-субъединиц, важен для активности фермента и для стабилизации сф-гетеродимера. Анализ структуры комплекса PheRS с тРНК^РЬе позволил объяснить необходимость (сф)2 структуры для функциональной активности. Каждая молекула тРНК^РЬе взаимодействует со всеми четырьмя субъединицами фермента: каталитический модуль (А1-А2) и три домена Р-субъединицы (В1, ВЗ и В7) одного оф-гетеродимера участвуют в связывании акцепторной ветви, С-концевой домен симметрично расположенной р-субъединицы и N-концевой домен второй а-субъединицы взаимодействуют с антикодоном и центральной частью тРНК^РНе (рис. 8).

Рис. 8. Структура комплекса PheRS Т. thermophilus с тРНК ^е. Структурные домены белка и их обозначения выделены одинаковым цветом; молекула тРНК^РЬе показана красным цветом. Домены второго гетеродимера отмечены звездочкой; N-концевой биспиральный домен а-субъединицы обозначен как "СС". Рисунок воспроизводится из статьи [15].

ДАРСТВЕННАЯ
,** „ рь, БИБЯІЮТЕІ і

1.5.2. Взаимодействие фенилаланил-тРНК-синтетазы с тРНК

Специфическое узнавание антикодона тРНК^РЬе (GAA) достигается благодаря его взаимодействию с доменом В8 (см. рис. 8). В комплексе PheRS Т. thermophilus с тРНК^РЬе конформация антикодоновой петли сохраняется такой же, как в свободной дрожжевой тРНК ^е, в отличие от измененной конформации антикодоновых петель в других aaRS-тРНК комплексах. Основная причина этого отличия заключается в том, что в большинстве случаев aaRS взаимодействуют с антикодоновой ветвью со стороны большой бороздки, и основания антикодона меняют ориентацию, образуя специфические контакты с белком. PheRS взаимодействует с тРНК^{р е} со стороны малой бороздки антикодоновой ветви.

С помощью кинетических исследований in vitro выявлены элементы узнавания тРНК^РНе из разных организмов [19-26]. Они рассредоточены в различных районах молекулы тРНК^РНе (табл. 9). Нуклеотиды антикодона тРНК^РЬе являются главными детерминантами специфичности во всех изученных системах. Среди них G34 вносит решающий вклад в узнавание, A3 5 и A3 6 играют меньшую роль. Согласно данным рентгеноструктурного анализа комплекса PheRS с тРНК^РЬе, все нуклеотиды антикодона взаимодействуют с С-концевым доменом (В8*) р*-субъединицы (см. рис. 8, структурные элементы, отмеченные звездочкой, относятся ко второму гетеродимеру). Узнавание G34 достигается за счет стэкинг-взаимо действия его основания с Туф* 731 и формирования трех специфических контактов: водородной связи между Об-атомом и Serp**742, N2-атомом и AspP*729 и N7 и Argp*780 (рис. 9).

Рнс. 9. Трехмерная структура (стереоизображение) антикодон-связывающего домена PheRS (серого цвета) в комплексе с тРНК (фрагментом антикодоновой петли бирюзового цвета). Водородные связи показаны пурпурными линиями. Рисунок воспроизводится из статьи [15].

различных концентраций ионов Mg²⁺. Диапазон уменьшения эффективности

аминоацилирования указан для случаев, когда нуклеотид был заменен двумя-тремя

другими нуклеотидами. Значения, полученные с использованием мутантов дрожжевой

цитоплазматической (cyt) тРНК^РЬе, выделены обычным шрифтом, мутантов тРНК^РЬе Е. coli

- показаны на сером фоне.

⁶G20 присутствует в cyt тРНК^РЬе дрожжей и человека.

"cyt тРНК^РЬе дрожжей и человека содержат С60.

^rA30-U40 присутствует в дрожжевой митохондриальной (mit) тРНК ^е.

^дПять тРНК^РНе различаются этими парами оснований.

^еВ 45-ом положении cyt тРНК^РЬе дрожжей и человека присутствует G.

^ж46-ой нуклеотид (и третичное взаимодействие) отсутствует в дрожжевой mit тРНК ^,е.

³cyt тРНК^Р11е дрожжей и человека содержат G26-A44, а дрожжевая mit тРНК^РЬе - G26-U44.

Все четыре аминокислотных остатка являются консервативными в цитоплазматических PheRS. Основания A35 и A36 узнаются благодаря вандерваальсовым контактам с А1ар*698 и LeuP*697, соответственно. Кроме этого, водородная связь между 2'-ОН-группой сахара A3 6 и Об атомом Asp(3*696 стабилизирует конформацию тРНК в этой области. Наибольшее количество контактов с участием G34 коррелирует с его главной

ролью в узнавании. Основной вклад домена В8 в связывание тРНК подтвержден с

помощью мутагенеза: его удаление приводило к уменьшению прочности комплекса PheRS с тРНК^{р е} до уровня неспецифического связывания [240].

Нуклеотид А73 также относится к элементам узнавания в Phe-системе, однако его вклад в эффективность аминоацилирования варьирует в зависимости от вида организма: сильные эффекты мутаций наблюдаются в человеческой системе [26], в то же время в других организмах вклад этого элемента незначительный (в Т. thermophilus) или умеренный [24, 25] (см. табл. 9). Конформация акцепторного АССА-конца тРИК^⁶ в двойном комплексе с ферментом определяется специфическим взаимодействием 3'-концевого аденозина с консервативными (Serai 80, Glua220, Phea260 и Phea258) и неконсервативными (Trp a 149) остатками и сетью контактов сахаро-фосфатного скелета тРНК с большой субъединицей (рис. 10) [15]. Таким образом, наряду с антикодоном, 3'-концевой нуклеотид образует специфические контакты с PheRS. Взаимодействие с ферментом приводит к частичному раскручиванию двойной спирали акцепторного стебля (по сравнению со свободной дрожжевой тРНК^{р е}) и нарушению стэкинг-взаимодействия оснований С72 и А73, при этом основание А73 не образует контактов с белком.

Роль других нуклеотидов антикодоновой ветви и акцепторного стебля изучена меньше (см. табл. 9). Замена пар оснований 27-43 и 28-42 оказывала лишь минорные эффекты на аминоацилирование in vitro двумя бактериальными ферментами, однако,

Рис. 10. Фрагмент структуры
комплекса PheRS с тРНК^РЬе.
Показаны взаимодействия,

стабилизирующие конформацию 3-
АССА-конца: концевой аденозин
взаимодействует с остатками а-
субъединицы, а остальные

нуклеотиды - с остатками Р-субъединицы. Два остатка Phe из Phe-связывающей петли (257-263), Trp 149, Serl80 и Glu220 находятся в контакте с А76. Водородные связи показаны пунктирными линиями. Данные воспроизводятся из работы [15].

согласно данным генетических экспериментов ш vivo, эти пары определяют идентичность тРНК ^е Е. соїі [19]. Вполне вероятно, что эти неконсервативные нуклеотиды tPHK^{f с} являются антидетерминантами, препятствующими взаимодействию тРНК ^е с неспецифичными синтетазами. Вклад консервативных нуклеотидных пар А31-и(псевдои)39 и G30-C40 в каталитическую эффективность аминоацилирования сильно варьирует для разных организмов и является минорным в термофильной системе. Филогенетически консервативный нуклеотид в 20-ом положении (U в прокариотических и G в эукариотических PHK^Phe) также является общим элементом узнавания. Наибольший эффект его мутаций наблюдался в человеческой системе, в других системах эффекты были минорными или средними. Некоторые отличия в наблюдаемых эффектах для одних и тех же нуклеотидов в разных системах могут быть обусловлены неодинаковыми условиями экспериментов. Так, относительный вклад элементов узнавания в специфичность зависит от концентрации ионов Mg ⁺ [25,241].

Важная роль в процессе узнавания тРНК^РНе принадлежит N-концевому биспиральному (coiled-coil) фрагменту а-субъединицы: обширная сеть неспецифических взаимодействий с пространственно разобщенными участками тРНК^РЬе, включая третичные нуклеотиды, служит для узнавания общей структуры тРНК^РИе. Правильная конформация тРНК ^е, стабилизируемая в первую очередь третичными взаимодействиями, абсолютно необходима для эффективного аминоацилирования во всех изученных системах [20-23, 25, 26, 242]; мутации третичных нуклеотидов, нарушающие общую структуру тРНК^№е, приводят к наиболее сильным эффектам. Подобный N-концевой биспиральный фрагмент SerRS (класса Па) вносит основеюй вклад в узнавание tPHK^{s, образуя многочисленные неспецифические контакты с длинной вариабельной петлей [64].}

Результаты экспериментов с использованием йод-индуцируемого гидролиза тиофосфат-замещенных аналогов тРНК [17] и s U-индуцируемого аффинного мечения [18] в основном согласуются с данными рентгеноструктурного анализа и обнаружили дополнительные взаимодействия, обусловленные конформационной динамикой комплекса. Эффективность расщепления йодом увеличивалась в участках тРНК ^е {в позициях 15, 16, 22, 44, 65 и 66), претерпевающих значительную деформацию при связывании. Большинство нуклеотидов в антикодоновой и вариабельной петлях и D-ветви, защищаемых от расщепления, находятся в близких контактах с белком. Нуклеотиды, образующие з⁴и-индуцируемые сшивки, локализованы в конформационно подвижных районах тРНК, претерпевающих структурные изменения при связывании с PheRS, или их основания не участвуют в стэкинг-взаимодействиях. Конформационная подвижность тРНК и соответствующих доменов белка могут благоприятствовать

образованию сшивок. Нуклеотиды в 8-, 20-, 39- и 45-ом положениях, образующие "сшивки" [18] и являющиеся элементами узнавания тРНК^РЬе (см. табл. 9), не образуют контактов с ферментом в закристаллизованном комплексе [15]. Эксперименты по аффинному "сшиванию" демонстрируют конформационную подвижность этих нуклеотидов, что позволило предположить механизм их непрямого узнавания: в процессе взаимной адаптации PheRS может деформировать структуру тРНК^РЬе в этих позициях. Подобный механизм был предложен для узнавания неустойчивой пары оснований G3-U70 в тРНК ^а [174, 175, 243]. Роль таких детерминант специфичности состоит в определении локальной конформации тРНК (ее стабилизации или возможности деформации при комплексообразовании).

1.5.3. Структурные основы каталитической функции фермента

Рис. 11. Поверхность белка в области активного центра PheRS и ее комплементарность связанному Phe-AMP. Остаток фенилаланина глубоко проникает в полость белковой поверхности. Рисунок воспроизводится из работы [16].

Отличительной чертой структурной топологии активного центра PheRS является наличие глубокого феншгаланин-связывающего "кармана" (рис. 11) [14, 16]. Нижняя поверхность "кармана", образованная консервативными остатками глицина, параллельна фенильному кольцу субстрата. Одна из боковых стенок состоит полностью из гидрофобных аминокислот, а противоположная - из полярных и заряженных остатков. Такое распределение гидрофобных и гидрофильных остатков в полости обеспечивает точную ориентацию амино- и карбонильной групп фенилаланина (свободного или в составе аденилата). Интересно отметить, что в комплексе PheRS с фенилаланином наблюдаются лишь минорные конформационные изменения по сравнению со структурой свободного фермента. Phe образует 52 вандерваальсовых контакта с PheRS. Специфическое узнавание достигается благодаря взаимодействию фенильного кольца субстрата и двух соседних фенильных колец остатков Phea258 и Phea260, ориентированных под углом -60 друг к другу и образующих сеть ароматических взаимодействий по типу "ребро-грань" (edge-to-face) (рис. 12). Примечательно, что сам активный центр PheRS содержит протяженную сеть ароматических взаимодействий, состоящую из Phea258 => Phea260 => Trpal49 => Pheal34 и Trpal53.

Phc260

Phe260

Phc258

Phe258

Рис. 12. Пространственное представление трех ароматических колец, образующих тройственное взаимодействие по типу "ребро-грань" в активном центре PheRS: фенильное кольцо Phe-AMP взаимодействует с Phea258 и Phea260. Рисунок воспроизводится из статьи [16].

Правильная ориентация Phe-субстрата

Phe-ЛМР

(благоприятная для его активации) достигается за счет формирования водородных связей его а-амино- и карбоксильной групп с полярными и заряженными остатками PheRS (часть контактов приведена в табл. 10). В комплексе PheRS с Phe-AMP (рис. 13) а-аминогруппа лиганда взаимодействует с остатком Serai80, а также через молекулу воды (S9) с остатками Glna218, Glua220 и Thral79, а карбонильная группа - с остатками Trpal49, Hisal78 и Arga204, консервативного для синтетаз Н-ого класса. Как показано для AspRS и SerRS [30 и 244], этот остаток стабилизирует переходное состояние в процессе синтеза аминоациладенилата. Структурный анализ комплексов PheRS Т. thermophilus с аминоалкиладенилатом (PheOH-AMP) [14] и истинным интермедиатом (Phe-AMP) [16] показал, что связывание нуклеотидной части приводит к конформационному сдвигу петли мотива 2 без изменений ее общей структуры, хорошо стабилизированной в нативном белке. Изменения в структуре PheRS, индуцируемые взаимодействием с нуклеотидным субстратом, выражены гораздо слабее по сравнению с изменениями, происходящими в SerRS [33] и AspRS [30]. Боковая цепь Arga204 принимает полностью вытянутую конформацию, необходимую для образования контактов с a-фосфатной и карбонильной группами Phe-AMP (рис. 14).

Рис. 13. Фрагмент структуры комплекса
PheRS с Phe-AMP. Два остатка Phe из
Phe-связывающей петли (а257-263),
Trpl49, Serl80 и Glu220 находятся в
контакте как с Phe-субстратом, так и с
А76 (см. рис. 8). Петля мотива 2 (а206-
213) и консервативные остатки мотивов 2
(Phea216) и 3 (Arga321)

взаимодействуют с нуклеотидным субстратом. Рисунок воспроизводится из статьи [16].

Таблица 10. Взаимодействия PheRS с функциональными лигандами³

'Данные РСА двойных комплексов PheRS Т. thermophilic с тРНК ^е, Phe или Phe-AMP [14-16]. ⁶Аминокислотные остатки, консервативные для PheRS, отмечены полужирным шрифтом, для И-ого класса синтетаз - звездочкой; в скобках указана принадлежность остатков доменам. "Верхним индексом указаны типы взаимодействий: es - электростатическое; hb - водородная связь; vdw - вандерваальсовы контакты; аа - взаимодействие ароматических остатков; ^гмежсубъединичные взаимодействия, в том числе опосредованные ионом магния.

Рис. 14. Схема основных взаимодействий между PheRS и фенилаланиладенилатом в активном центре (по данным PC А [16]). Пунктирными линиями показаны водородные связи, стрелками -вандерваальсовы взаимодействия.

Второе существенное изменение в структуре комплекса с Phe-AMP обусловлено конформационным сдвигом (около 1,6 А) фрагмента 138-151, содержащего Тгра149, который образует контакты (с участием индольного кольца) с карбонильной и фосфатной группами. Подобных изменений не обнаружено в комплексе с синтетическим аналогом PheOH-AMP: отсутствие взаимодействия Тгра149 (разупорядоченного в этой структуре) с карбонильной группой, замененной на метиленовую, приводит к нарушению сети водородных связей. Связывание адениновой части Phe-AMP имеет много общего со способами, обнаруженными в комплексах других синтетаз II класса. Аденин расположен между фенильным кольцом Phea216 и алифатической частью боковой цепи Arga321 (см. рис. 13, табл. 10). Эти консервативные для П-ого класса остатки относятся к мотивам 2 и 3, соответственно. Формирование комплекса PheRS с Phe-AMP сопровождается сильным изменением конформации боковой цепи Arga321 со смещением гуанидиниевой группы более чем на 4,5 А. Адениновая часть Phe-AMP стабилизирована водородными связями между N6 и N1 атомами и остатками Glua206 и Glua213; три непрямые водородные связи (с участием молекул воды) с N3 и N7 атомами образованы остатками Glya318, Arga321 и Arga204. Остаток рибозы удерживается водородными связями с остатками Leua280,

GIya281 и Arga204 и двумя молекулами воды, связывающими 2'-ОН группу с остатками Arga321 и GIya318 и З'-ОН группу - с остатком Glua279, консервативным для П-ого класса. Такой способ связывания остатка рибозы является специфичным для PheRS. В комплексе HisRS Е coli с гистидиладенилатом З'-ОН группа свободна от контактов с белком [245], а в случае AspRS, SerRS и LysRS эквивалентный остаток Glu взаимодействует непосредственно с З'-ОН группой аденилата [16].

На основе структурного анализа комплексов PheRS с Phe и Phe-AMP предложены основные принципы реакции активации [16]. Позиция Phe сохраняется в обоих комплексах. В соответствии с механизмом активации аминокислоты, описанным для синтетаз класса II [50], геометрия и заряд пентаковалентного переходного состояния должны стабилизироваться положительно заряженными аминокислотами и ионами металла (Mg²⁺ или Мп²⁺). В то же время в His-специфичной системе [245] функцию дивалентного катиона выполняют два остатка Arg, взаимодействующие напрямую с а-фосфатом аденилата: специфичный для HisRS Arg259 и консервативный для класса II ArgU3 увеличивают электрофильность a-фосфатной группы АТР, что способствует нуклеофилыюй атаке ее карбоксильной группой аминокислоты и освобождению пирофосфата. Подобно His-системе, формирование стабильного интермедиата может происходить без участия дивалентного(ых) катиона(ов), не обнаруженного в комплексе PheRS с Phe-AMP (см. рис. 13). Отрицательный заряд карбонильного атома кислорода в переходном состоянии может стабилизироваться положительно заряженным Arga204 (консервативным для класса II) и полярными остатками Hisal78 (замененного на Gin в некоторых PheRS) и Trpal49 (замененного на His или Gin в других PheRS).

Все остатки, ответственные за связывание концевого аденозина в структуре двойного комплекса PheRS-TPHK^Phe, участвуют в связывании фенилаланина (см. табл. 10). В комплексе PheRS с Phe-AMP боковая цепь Glua220 сильно меняет свою ориентацию по сравнению с ее положением в комплексе с тРНК^РЬе, образуя непрямой контакт с аминогруппой Phe-остатка. Тгра149 смещается от своего положения в сторону атома кислорода карбонильной группы интермедиата для образования водородной связи. Меняется ориентация фенильных колец остатков Phea258 и Phea260. Только конформация Serai 80 сохраняется в обоих комплексах PheRS. Из анализа этих данных следует необходимость перестройки концевого аденозина тРНК ^е в присутствии аденилата. Вопрос о функциональной ориентации акцепторного конца тРНК ^е, контролируемой низкомолекулярными лигандами и соответствующей структуре продуктивного комплекса, требует дополнительных исследований.

Относительный вклад элементов узнавания в кинетические параметры аминоацилирования

Замены элементов узнавания могут по-разному влиять на параметры реакции аминоацилирования. В исследованиях in vitro оценивают потерю кинетической специфичности (L) в результате мутаций (отношение величины каталитической эффективности аминоацилирования KJKu для тРНК дикого типа к соответствующему значению для мутанта). Вклад отдельных элементов в узнавание отличается для тРНК различной специфичности. Величина L может изменяться от средних (L 10) до Рис. 5. Сравнение структур комплексов GlnRS (а) и AspRS (б) с соответствующими тРНК. Нуклеотиды, образующие по данным РСА [55, 66] контакты с ферментом или находящиеся в непосредственной близости к белку, отмечены сферами сиреневого цвета (являются элементами специфичности) или желтого цвета (не участвуют в узнавании). Рисунок воспроизводится из обзора [1]. значительных (L 1000) эффектов. Различия в силе детерминант узнавания наблюдаются и для тРНК одной и той же специфичности из разных видов организмов. Например, потеря специфичности Asp-системы в результате мутаций антикодона и дискриминаторного основания не превышает 103 в эукариотах и более 103 в прокариотах [см. обзор 1]. Кроме этого, в системах с несколькими элементами узнавания их индивидуальные вклады в общую специфичность относительно низки. Например, в дрожжевой Asp- и Phe-системах эффекты отдельных замен не превышают 103. И, наоборот, когда количество элементов узнавания мало, их вклад в специфичность максимален. Яркими примерами являются основные элементы узнавания тРНК 8 Е. coli (пара G3-U70), и TPHKHIS Е. coli (С73 и дополнительный нуклеотид G1 ,см. табл. 5); величина L в случае их замен превышает 103. Относительные вклады величин ксЛ и Км в кинетическую специфичность отличаются для разных элементов. Очевидно, что замена элементов узнавания может оказывать влияние на каталитическую эффективность тремя способами: за счет преимущественного изменения параметра fcCat или параметра Км или за счет смешанных эффектов &cat и Км- Наибольшие эффекты (чаще всего за счет изменения ксгЛ и влияния на катализ аминоацилирования) проявляются для нуклеотидов, находящихся вблизи или в контакте с ферментом. Мутации элементов узнавания, отвечающих за формирование правильной структуры тРНК, чаще вызывают изменение Кт. В ряде случаев, элементы специфичности действуют косвенно, способствуя созданию специфической конформации РНК, которая узнается синтетазой. Так, например, мутация пары G10-U25 в тРНК , не образующей прямых контактов с AspRS [192], приводит к іСп-зависимому снижению эффективности аминоацилирования из-за нарушения третичного взаимодействия (N10-N25)-45 в мутантах [169].

Узнавание тРНК не является процессом изолированного взаимодействия отдельных нуклеотидов с соответствующими аминокислотами. Поскольку элементы идентичности чаще всего расположены в трех доменах тРНК (антикодоновой и акцепторной ветвях и центральной части молекулы), возникает вопрос, как же они действуют вместе, обеспечивая общую специфичность. При исследовании аминоацилирования двойных мутантов тРНКР1,е дрожжевой PheRS было обнаружено, что три элемента специфичности (антикодон, А73 и G20) функционируют независимо друг от друга [23]. 2-3-х кратное различие экспериментальных и вычисленных значений kcti/Km для двойных мутантов G20A/A73U и G34A/A73U существенно меньше эффектов индивидуальных мутаций. Функциональную взаимосвязь детерминант специфичности дрожжевой тРНК р (G73, G34, Ш5, С36 и G10 U25) изучали с помощью транскриптов с двумя или более мутациями в этих позициях [193]: множественные мутации оказывают влияние на эффективность аминоацилирования в основном на уровне Acat. Значительные различия в экспериментальных и вычисленных значениях kzJKm для двойных мутаций с попарными замещениями в антикодоне и акцепторной ветви, а также в D- и акцепторной или D- и антикодоновой ветвях показали, что нуклеотиды, расположенные далеко друг от друга в трехмерной структуре тРНКА р, действуют кооперативно, тогда как нуклеотиды антикодонового триплета действуют аддитивно или антикооперативно. Подобные свойства обнаружены и для элементов узнавания тРНК Т. thermophilus [168]. Наличие кооперативных эффектов в Asp-системе позволяет предположить, что в формировании функционально активного комплекса TPHKAsp-AspRS играют важную роль конформационные изменения макромолекул.

Для выяснения роли общей структуры тРНК и отдельных элементов в узнавании, а также для выявления взаимосвязи элементов узнавания, находящихся в разных участках структуры, широкое распространение получили методы с использованием укороченных РНК, имитирующих тРНК-субстрат и содержащих важный фрагмент структуры тРНК. L-образная форма молекулы тРНК позволяет представить ее в виде двух двуспиральных структур, ограниченных Т- или антикодоновой петлями. Функциональная активность тРНК-минисубстратов, имитирующих акцепторный стебель (состоящих из акцепторного и Т-стеблей) и содержащих элементы узнавания, впервые была предсказана и проверена Шиммелем и др. на аланиновой системе [194]. Впоследствии было исследовано множество других минисубстратов с короткими спиральными или одно цеп очечными участками (4 неспаренных нуклеотида вместо 7 в Т-петле). Такие министруктуры оказались хорошими субстратами для AlaRS и HisRS Е. coli, но плохими для SerRS Е. coli (несмотря на локализацию элементов узнавания в акцепторном стебле и отсутствие детерминант в антикодоновой петле тРНКег Е. colt). Низкая активность тРНК ег-минисубстрата определяется, по-видимому, отсутствием главного элемента узнавания — длинной вариабельной ветви [195]. Министруктуры, имитирующие акцепторную ветвь тРНК, специфичность которой определяется антико доном, a proiri должны быть не активны. Однако, такие тРНК аминоацилируются, хотя в большинстве случаев с более низкой эффективностью по сравнению с полноразмерной тРНК. Гипотеза о существовании "оперативного кода тРНК" в акцепторном стебле, обеспечивающего селективный отбор тРНК, предполагает, что подобные минисубстраты являются эволюционными предшественниками тРНК, и существует антикодон-независимая взаимосвязь между тРНК и специфичными аминокислотами [196]. На ранних этапах эволюции синтетазы имели, скорее всего, только каталитический домен (характерный для своего класса), и позднее, с приобретением ими дополнительных функциональных доменов, произошло образование второго домена тРНК, содержащего антикодон. Использование тРНК-минисубстратов позволило продемонстрировать, что информация может передаваться от антикодон-связывающего домена в активный центр синтетазы даже в отсутствие целостной L-структуры тРНК, хотя и не очень эффективно. Добавление фрагмента антикодонового стебля увеличивает эффективность аминоацилирования фрагментов акцепторного-ТТС стебля тРНКІІе Е. coli и дрожжевой TPHKVal в 1,6 раза [см. обзор 2]. Однако, в других системах для аналогичных Gin-, Cys-, Asp- и Met-специфичных фрагментов не наблюдалось увеличения эффективности аминоацилирования в присутствии соответствующих антикодоновых шпилек. В совокупности эти эксперименты показали, что правильная общая структура тРНК в большинстве систем не только соединяет функциональные антикодоновую и акцепторную ветви, но также важна для оптимального аминоацилирования.

Механизмы контроля продуктивного связывания З-конца тРНК

К настоящему времени известны кристаллические структуры четырнадцати комплексов синтетаз с соответствующими гомологичными тРНК и четырех - с гетерологичными (см. табл. 2). Для многих комплексов (дрожжевых AspRS [184, 222, 223], ArgRS [224], PheRS [225], ValRS [96, 52, 225, 226], TyrRS [227] и SerRS [228], IleRS [100], SerRS [229] и ThrRS E. colt [230], PheRS T. thermophilus [17, 18], CysRS E. coli и человека [231]) получены данные РНКазного картирования (футпринтинга). В совокупности результаты этих исследований очень важны для понимания структурных основ узнавания тРНК синтетазами, поскольку позволяют выявить специфические контакты двух макромолекул. На рисунке 5 а, б приведено сравнение трехмерных структур комплексов GlnRS и AspRS, представителей разных классов, со специфичными тРНК. Нуклеотидные остатки, находящиеся в контакте с ферментом, обозначены сферами (фиолетового цвета - используются для узнавания, желтого цвета - не являются элементами узнавания). В основном сиитетазы образуют контакты с двумя удаленными частями молекулы тРНК: акцепторной и антикодоновой ветвями, при этом сиитетазы I класса (GlnRS) взаимодействуют с нуклеотидными остатками 5 -конца тРНК, а класса II (AspRS) - с З -концом, Лишь некоторые нуклеотидные остатки акцепторной ветви, образующие контакты с ферментом, важны для узнавания. Большинство же остатков антикодоновой ветви (особенно в Gin-системе), взаимодействующих с ферментом, являются элементами узнавания. Взаимодействие тРНК с aaRS сопровождается конформационными изменениями обеих макромолекул [для обзора см. 51]. Кристаллографические данные о структуре комплексов GlnRS (класс I) и AspRS (класс II) со специфичными тРНК наглядно показали значительную деформацию антикодоновых петель обеих тРНК, а в случае тРНКС1п структурные изменения происходят также в акцепторном стебле. В аспартатной системе общая структура тРНК Р, находящейся в комплексе с ферментом, становится более компактной, чем в свободной молекуле тРНК р, за счет уменьшения угла между двумя непрерывными спиралями L-формы. ССА-конец в тРНК принимает U-образную конформациго, и первая пара акцепторного стебля разрушается (см. рис. 5 а). Изгиб акцепторной ветви в районе N73 характерен для комплексов синтетаз 1-ого класса и необходим, по-видимому, для правильного расположения акцепторного конца в активном центре. Разрушение первой пары не является универсальным для этого класса. Так, по данным "F-ЯМР [232] и PC А [52] в комплексе ValRS с тРНКУа] пара G1-C72 сохраняется. В тРНКмр концевая ССА-последовательность является целостным продолжением акцепторного стебля и ориентирована в каталитический центр AspRS (см. рис 5 б). Такое структурное различие обусловлено разными способами связывания акцепторного стебля тРНК-субстрата синтетазами I и II классов: со стороны малой бороздки тРНК и большой бороздки тРНК р.

Прямое взаимодействие с детерминантами специфичности является общим свойством синтетаз, как показано с помощью кристаллографических исследований. Так, основные элементы узнавания в антикодоне Arg-, Не-, Val-, Gin-, GIu-, Туг-, Pro-, Thr-, Asp-, Lys- и Phe-овой тРНК [для ссылок см. табл. 2] образуют контакты с аминокислотными остатками соответствующих ферментов. Для специфических взаимодействий используются чаще всего водородные связи. Мутации элементов узнавания тРНК приводят к утрате части или всех водородных связей и снижают эффективность аминоацилирования. Кроме прямого взаимодействия с детерминантами специфичности существуют способы непрямого узнавания локальной или общей конформации тРНК. Например, механизм узнавания дискриминаторного основания различен в Asp- и Gin-системах. G73 дрожжевой тРИК образует прямые контакты с

аминокислотными остатками гомологичной AspRS [66]. В то же время в глутаминовой системе Е. coli G73 не образует взаимодействий с синтетазой; водородная связь между 2 аминогруппой G73 и фосфатной группой А72 стабилизирует функционально активную конформацню акцепторного конца [55, 56]. Третичные нуклеотиды также, по-видимому, непрямым способом участвуют в узнавании тРНК, поскольку в большинстве закристаллизованных комплексов не обнаружено специфических взаимодействий белков с нуклеотидами центральной части молекулы тРНК [52, 55, 56 и др. из табл. 2]. Мутации нуклеотидов, образующих третичные взаимодействия, оказывают меньшее влияние на эффективность аминоацилирования (обычно Ю-100-кратное уменьшение), по сравнению с заменами нуклеотидов, образующих специфические контакты (уменьшение на 3-5 порядков величины). Функциональная роль этих взаимодействий состоит в стабилизации общей конфигурации тРНК, необходимой для оптимального неспецифического связывания рибозо-фосфатного скелета и структурной взаимосвязи прямых элементов узнавания. Так, относительный вклад необычной третичной пары оснований G15-G48 в эффективность аминоацилирования TPHKCys Е. coli зависит от природы нуклеотидов в соседних позициях D-петли, модулирующих ее конформацню [117]. Ключевую роль в узнавании тРНК1" LeuRS играют нуклеотиды A15-U48, А20а и GI8G19, ответственные за формирование пространственной структуры и конфигурации отдельных её районов [104]. SerRS Г. thertnophilus узнает конформацню тРНК благодаря неспецифическим взаимодействиям с рибозо-фосфатным скелетом длинной вариабельной ветви без каких либо контактов с антикодоном [64]. Для узнавания тРНКАа и тРНКС1п Е. соїі, тРНК уг из архебактерии Methanococcus jannaschii и дрожжевых тРНКег и тРНК е длина вариабельной и/или D-петель важнее, чем их последовательность [1, 129, 132, 142]. Для идентичности человека большое значение имеют последовательность и ориентация удлиненной вариабельной петли [108]. Результаты многочисленных биохимических исследований Ala-системы Е. coli находятся в противоречии: некоторые из них свидетельствуют о прямом узнавании основной детерминанты специфичности, wobble пары G3-U70, а другие - о ее структурной роли в создании уникальной конформации акцепторного стебля [76, 77,173-175, 177]. Окончательное решение вопроса о механизме дискриминации тРНК 3 требует кристаллографического анализа комплекса.

Выделение плазмидных ДНК

В работе использовали ATP, UTP, GTP, СТР, EDTA, L-фенилаланин, периодат натрия, набор окрашенных белков-маркеров молекулярной массы (36-193 кДа), кумасси ярко-голубой R-250, питательную среду LB производства фирмы "Sigma" (США), акриламид, І,М -метиленбисакршіамид, Р-меркаптоэтанол, Tris и Hepes фирмы "Fluka" (Швейцария); Ds-Na ("USB", США); глицин, дитиотреитол, спермидин, цианборгидрид натрия и агарозу ("Serva", Германия); персульфат аммония ("Merck", Германия); мочевину ("ICN", США); агар ("DIFCO", США); смолу Sepharose CL 4В ("Pharmacia Fine Chemicals", Швеция). Прочие реактивы были отечественного производства марки "о.с.ч" или "х.ч."

Из радиоактивных материалов использовали Ь-фенил-[2,3-3Н]аланин (1,96 ТБк/ммоль) производства Института прикладной химии (Россия); [Y-32P]ATP ( 140 ТБк/ммоль), [а-32Р]АТР (13-30 ТБк/ммоль) производства "Биосан" (Россия) или "ICN" (США).

s4UTP бьш синтезирован В. С. Богачевым (НИБХ СО РАН) из s4UMP ("Serva"). s6GTP был синтезирован В. А. Власовым (ИЦИГ СО РАН). 4-тиоуридин-3 ,5 (2,,51)-дифосфат (ps4Up) синтезирован из 4-тиоуридина производства "Serva" (Германия) В. С. Богачевым по описанному методу [246] с модификациями. Полученную смесь 4-тиоуридин-3 ,5 - и 2 ,5 -дифосфатов использовали без разделения, поскольку субстратами Т4 РНК-лигазы являются только нуклеозид-3 ,5 -дифосфаты [247]. Препарат «-(N-акрилиламино)фенилмеркурхлорида (АРМ) предоставлен проф. Г. Иглой (Университет Фрайбурга, Германия). L-фенилаланиниладенилат (PheOH-AMP) синтезирован Н. А. Моор как описано ранее [248].

В работе использовали спектрофотометр "Милихром" (НПО "Научприбор", г. Орел, Россия), вакуумную сушку для акриламидных гелей "Hoefer GD 2000" (США), рН-метр "ОР 211/1" (Венгрия), счетчик радиоактивности "Электроника D2-10M" (Россия), центрифуги "Centricon Т-42К" (Италия) и "Eppendorf 5415" (Германия), Гели радиоавтографировали с использованием рентгеновской пленки "Kodak" (США).

Для приготовления всех буферных растворов и реакционных проб использовали дважды дистиллированную воду, обработанную диэтилпирокарбонатом и деионизованную с помощью смолы Serdolit МВ-3 ("Serva", Германия). Воду и все буферы подвергали стерилизации автоклавированием или фильтрованием через поливиниловый или нитроцеллюлозный фильтр (0,22 мкм) производства "Nalgene" или "МШіроге" (США).

В работе использовали штамм Е. coli DH-5a для трансформации плазмидными ДНК и выделения ДНК-матриц для транскрипции. Компетентные клетки были приготовлены в лаборатории и предоставлены Л. И. Медведевой. Рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие ген TPHKPhe Е. coli (дикого типа или мутантные) или человека под контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7, сконструированы в лаборатории проф. О. Уленбека (Университет Колорадо, США). Плазмида для in vitro транскрипции гена тРНКАа Е. coli предоставлена проф. П. Шиммелем (Институт химической биологии, Скагс, США). тРНК n Е. coli (акцепторная активность 1200 пмоль/ед Агео) — производства фирмы "Boehringer Mannheim Biochemica" (Германия). Дрожжевая TPHKASP предоставлена проф. А. Буториным (Париж, Франция). Суммарная тРНК из Е. coli MRE-600 - производства "РЕАХИМ" (Россия). Суммарная тРНК и тРНКРНе из Т. thermophilus НВ8 выделены в лаборатории как описано ранее [13] и предоставлены С. Н. Ходыревой и В. Г, Степановым. Акцепторная активность тРНК е составляла 1800 пмоль/ед Азбо Щелочная фосфатаза из кишечника теленка, Т4 полинуклеотидкиназа и Т4 РНК-лигаза - производства "Pharmacia Biotech" (США); бензоназа фирмы "Merck" (Германия), ингибитор рибонуклеаз ("Promega", США); эндонуклеаза рестрикции Bst2Ul ("Сибэнзим", Россия). Фенилаланил-тРНК-синтетаза (КФ 6.1.1.20) из Т. thermophilus НВ8 с удельной активностью 350 ед/мг (37) выделена как описано ранее [249] и предоставлена В, Н. Анкиловой. Концевая СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансфераза (КФ 2.7.7.25) из Е. coli MRE-600 с удельной активностью 30 ед/мг (37) получена по описанному ранее методу В. Н. Анкиловой [250]. За единицу активности принято количество фенилаланил-тРНК-синтетазы или СТР(АТР):тРНК-нуклеотидилтрансферазы катализирующее включение 1 нмоль меченого субстрата (фенилаланина или АТР) в тРНК за 1 мин. Т7 РНК-полимераза была выделена из клеток Е. coli BL21, несущих плазмиду pAR1219, и предоставлена В. Н. Анкиловой. а) Трансформация клеток Е. coli тазмидной ДНК. Компетентные клетки (Е coli, штамм DH-5a), приготовленные с применением СаСЬ, предварительно размораживали во льду в течение 15 мин. Для трансформации к 200 мкл клеточной суспензии добавляли 30 нг плазмидной ДНК и инкубировали в течение 30 мин во льду и 2 мин при 42. После добавления 1 мл среды LB клетки инкубировали без аэрации в течение 1 ч при 37. Затем клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 30 сек. Супернатант удаляли, оставив 50 мкл над осадком. Клетки суспендировали и высеивали на чашки с агаризованной средой, содержащей ампицилин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали 16 ч при 37. б) Выделение плазмидной ДНК Бактериальные клетки, содержащие плазм идные ДНК, выращивали в 3 мл среды LB в присутствии 100 мкг/мл ампициллина в течение ночи при 37 с интенсивной аэрацией. В приготовленные колбы со средой LB (3x100 мл) и ампициллином (100 мкг/мл) переносили ночную культуру (1мл на 100 мл среды) и проводили наращивание при 37 и интенсивной аэрации в течение 12 ч. Клетки осаждали центрифугированием при 4 (4000 об/мин; 15 мин). После удаления супернатанта осадок суспендировали в 30 мл буфера, содержащего 50 мМ глюкозу и 10 мМ EDTA, добавляли лизоцим (0,3 мл до 0,2 мг/мл) и инкубировали 10 мин при 0, осторожно перемешивая. Затем к смеси добавляли 30 мл свежеприготовленного раствора, содержащего 0,2 М NaOH и 1%-ный Ds-Na, и инкубировали 20 мин во льду, плавно перемешивая через каждые 6-7 мин. После наступления лизиса клеток к смеси добавляли 30 мл холодного раствора З М NH4AC (рН 4,9), мягко перемешивали и оставляли во льду на 30 мин, плавно перемешивая каждые 6-7 мин. Суспензию центрифугировали при 4 (12500 об/мин; 40 мин). К супернатанту добавляли 0,7 объема изопропанола, хорошо перемешивали, выдерживали 20 мин при 0 и центрифугировали при 4 (12000 об/мин; 20 мин). Осадок промывали этанолом и высушивали на воздухе при комнатной температуре; затем растворяли в 1 мл буфера ТЕ (10 мМ Tris-HCl-буфер (рН 7,8) и 1 мМ EDTA), к раствору добавляли равный объем 5 М LiCl, перемешивали и выдерживали во льду 2 ч; после чего центрифугировали при 4 (12000 об/мин; 10 мин). К супернатанту добавляли 2 объема 96%-ного этанола и перемешивали; после осаждения при -20 (2 ч) осадок отделяли центрифугированием при 4 (12000 об/мин; 10 мин). Осадок высушивали и растворяли в 0,5 мл буфера ТЕ; к раствору добавляли 1/10 объема 3 М NaAc (рН 4,9) и 2,5-3 объема 96%-ного этанола. После выдерживания при -20 (2 ч) осадок отделяли центрифугированием при 4 (12000 об/мин; 10 мин) и высушивали. ДНК очищали от примеси РНК гель-фильтрацией на колонке (1,0x35 см) со смолой Sepharose CL 4В, используя 50 мМ Tris-HCl-буфер (рН 7,4), содержащий 0,15 М NaCl и 1 мМ EDTA, для элюции и спектрофотометр "Милихром" для УФ-детекции материала. Скорость элюции составляла 0,2 мл/мин.

Исследование стабильности третичной структуры мутантных TPHKphe с нуклеотидными заменами в 19-ом и 56-ом положениях

Эффективность связывания мутантов уменьшается в том же ряду, что и стабильность их третичной структуры, оцененная по изменению скорости накопления продуктов фотопревращения соответствующих тРНКРЬе (как описано в разделе 3.1.2.). Это свидетельствует о том, что на связывание мутантов с PheRS влияют в первую очередь изменения в третичной структуре TPHKphe. Очевидно, что основные структурные изменения относятся к конформациям D- и Т-петель. Отсутствие строгой корреляции между величинами Кц и относительными скоростями УФ-индуцируемого превращения тРНКРЬе свидетельствует о том, что локальные изменения в районе мутаций и нарушения в общей структуре тРНК е могут по-разному влиять на связывание мутантов. Эффекты замен нуклеотидов в 20-ом и 16-ом положениях (обсуждаемые ниже) также наглядно показывают важное значение правильной конформации D-петли. Представленные данные свидетельствуют о том, что образование комплекса PheRSPHKp 6 очень чувствительно к изменениям в крайней угловой структуре L-формы молекулы тРНКРЬе. Эти наблюдения согласуются с данными рентгеноструктурного анализа комплекса: нуклеотиды G19 и С56 образуют неспецифические контакты (через рибозо-фосфатный остов) с ферментом, и эти взаимодействия существенно меняют конформацию D- и Т-петель в связанной тРНК [15]. Все шесть типов замен оказывают умеренный эффект или не влияют вообще на кажущуюся константу скорости реакции аминоацилирования. В основном, более стабильные комплексы более активны в катализе, хотя строгой корреляции между изменениями К ц и ft не наблюдается. Таким образом, основная роль нуклеотидов G19 и С56 состоит в стабилизации правильной структуры тРНК, необходимой для связывания и в меньшей степени для последующих этапов аминоацилирования. Критическая роль пары G19-C56 в распознавании тРНКРКе на стадии связывания показана в экспериментах с PheRS Е. coti: все прочно связывающиеся мутантные TPHKphe содержат нативную пару [261].

Из двух транскриптов с заменами нуклеотидов, образующих тройственное взаимодействие G10-C25-U45, только для мутанта G10A/C25U с измененной третичной структурой (как показано в работе [20]) наблюдалось уменьшение активности как в связывании, так и в аминоацилировании. Замена U45G, не нарушающая третичной укладки тРНК \ не влияет на активность. Сравнимые изменения величин К& и к яи наблюдаемые для первого мутанта, показывают, что эти нуклеотиды вносят одинаковый вклад в формирование правильной конформации тРНКРЬе как на стадии связывания, так и каталитического превращения. Замены в паре оснований A26-G44 приводят к совершенно отличным эффектам в сравнении с другими структурными мутантами. Мутант G44C связывается более прочно, чем двойной мутант A26G/G44A (структурно подобный транскрипту дикого типа [20]), но менее активен в реакции аминоацилирования. Аналогичные эффекты наблюдаются для всех трех мутантов с заменами в 20-ом положении: наиболее сильное уменьшение величины kcat для мутанта U20C сопровождается наименьшим увеличением Aj. Сопоставление величин К& и констант скорости позволило выявить интересную взаимосвязь между ними для этой группы мутантов: чем нестабильнее комплекс, тем он более эффективен в катализе. Таким образом, увеличение конформационной подвижности комплекса способствует формированию правильной конформации, необходимой для переходного состояния реакции аминоацилирования. В отличие от нуклеотидов А26 и G44, которые вовлечены в неспецифические взаимодействия с PheRS (через рибозо-фосфатный остов), U20 не образует контактов с ферментом в структуре комплекса (рис. 15, б и в), и его мутационные эффекты можно объяснить только изменением структуры тРНК. На основании данных РСА комплекса [15] и экспериментов по защите введенных в тРНКРЬе тиофосфатных групп от йод-индуцируемого гидролиза [17], нуклеотиды U20 и G44 расположены в районах, претерпевающих существенные конформационные изменения в тРНКРЬе в процессе связывания с ферментом. Нуклеотиды в 20-ом и 45-ом положениях образуют s U-индуцируемые "сшивки" с PheRS [18], что также свидетельствует о конформационной подвижности их оснований и пластичности соответствующих районов тРНК е. Таким образом, нуклеотиды центральных районов тРНКРЇ,е можно поделить на две группы, в соответствии с их функциональной ролью в формировании правильной конформации тРНК. Третичные нуклеотиды (нуклеотиды, образующие третичные взаимодействия) пары оснований G19-C56 и тройственного взаимодействия G10-C25-U45 стабилизируют, в основном, правильную трехмерную структуру тРНКРЬе (необходимую для оптимального связывания); U20 и третичная пара оснований A26-G44 важны для конформационной подстройки тРНК и фермента в процессе их взаимодействия.

Кроме нуклеотида U20 в D-петле мы проанализировали эффект замены нуклеотида U16 на связывание тРНКР1,= с PheRS. Мутация U16C вызывает только 2-х кратное увеличение Ко. и не оказывает влияния на константу скорости аминоацилирования (см, табл. 11). Значительная деформация D-петли в районе нуклеотида 16, обнаруженная в структуре кристаллического PheRSPHKPhe комплекса [15], подтверждена с помощью биохимических экспериментов, где наблюдалось усиление йод-индуцируемого гидролиза тРНКРЬс или расщепление ковалентно присоединенной к PheRS тРНКРЬе в указанной позиции [17, IS]. Поскольку U16 не образует контактов с ферментом, скорее всего, эффект его мутации объясняется участием в конформационной перестройке комплекса. Интересно отметить, что прочно связывающиеся с PheRS Е. colt тРНК из библиотеки мутантов, рандомизированных по третичным нуклеотидам, содержат преимущественно Ш6[261].

Все три мутанта тРНК№е с заменами в положении 73 связываются с ферментом также эффективно, как и транскрипт тРНКРЬе дикого типа (см. табл. 11), т.е. специфичность этого нуклеотида не проявляется на стадии связывания. В структуре комплекса PheRS с тРНКРЬе А73 вовлечен в сеть неспецифических взаимодействий наряду с нуклеотидами в положениях 72, 74 и 75, в то время как основание А73 не участвует в связывании (см. рис. 10 и рис. 15, б и в). Небольшое уменьшение at при замене А73 пиримщщновыми остатками позволяет предположить минорную роль этого нуклеотида в стабилизации переходного состояния каталитической реакции за счет влияния на конформацию одноцепочечного участка акцепторного конца.

Кроме сети контактов между белком и сахаро-фосфатным остовом акцепторной ветви тРНКРЬе в структуре комплекса PheRSPHKphc [15] обнаружены специфические взаимодействия 3 -концевого аденозина с тремя консервативными остатками: экзоциклической аминогруппы с Serai80 и Glua220 и ароматического кольца с Phea258. Мы проанализировали связывание тРНК е, укороченной с 3 -конца на один нуклеотид, с PheRS: в результате удаления А76 Кд комплекса увеличивалась лишь в 1,6 раза (см. табл. 11). Небольшой вклад 3 -концевого нуклеотида в прочность комплекса свидетельствует о том, что его взаимодействие с ферментом не является предпосылкой для образования контактов с другими районами тРНК, в том числе с акцепторным стеблем.

Как упоминалось выше, транскрипт тРНКРЬс Е, coli и природная тРНКРКе из 1. thermophilus идентичны по эффективности связывания термофильной синтетазой и имеют близкие значения кинетических характеристик аминоацилирования. Это может свидетельствовать о том, что отличающиеся нуклеотиды двух тРНК, расположенные главным образом в акцепторном, антикодоновом и Т-стеблях, не важны для узнавания па стадии связывания. Действительно, транскрипт тРНК е Е. coli с заменами двух пар в антикодоновом стебле (A27-U43, A28-U42) связывается так же, как и транскрипт дикого типа; эффект мутаций выражается лишь в 1,3-кратном уменьшении каталитической эффективности аминоацилирования. Мы также сравнили связывание PheRS с другими тРНКРЬе с различными последовательностями. Химерные тРНКш-ф1,е и TpHKfttet" phc были синтезированы на основе тРНК К coli и тРНК" К coli трансплантацией в них элементов узнавания тРНКРЬе Е. coli [20].

Похожие диссертации на Механизм специфического отбора тРНК фенилаланил-тРНК-синтетазой: функциональная роль структурных элементов тРНК на различных стадиях взаимодействия

Механизмы взаимодействия гипохлорита и гипохлорит-образующих систем с органическими гидропероксидамиЧеканов Андрей Васильевич

Сравнительное исследование механизмов взаимодействия цитохрома Р450 2В4 и гемового домена монооксигеназы Р450ВМ3 с их партнерами-донорами электроновКарякин Андрей Александрович

Молекулярные механизмы взаимодействия в организме биогенных веществ животного и растительного происхожденияБабичев Александр Витальевич

Механизмы взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с ДНК и иммуноглобулинами ВИЧ-инфицированных больныхБаранова Светлана Владимировна

Анализ биологических наноструктур в системах метаболизма белков и липидов : Строение, дисперсный состав и механизмы равновесных взаимодействий макромолекулТузиков Федор Васильевич

Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животныхСтароверов, Сергей Александрович

Активные формы кислорода и антиоксидантные ферменты на начальных стадиях взаимодействия гороха с клубеньковыми бактериями (Rhizobium leguminosarum) Васильева Галина Геннадьевна

Изучение взаимодействия РНК-полимеразы с нуклеиновыми кислотами на разных стадиях транскрипционного циклаЧленов, Марк Михайлович

Исследование функциональной роли специфических и неспецифических взаимодействий РНК-полимеразы Escherichia coli с ДНК на разных стадиях транскрипцииПупов, Данил Владимирович

Реакции и механизмы взаимодействия лугово-каштановых почв с минерализованными грунтовыми водами в условиях модельного опытаВолодина Ирина Владимировна