Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Пути появления гипохлорита в организме 8
1.2. Физико-химические свойства хлорноватистой кислоты и гипохлорита 11
1.3. Свободнорадикальные реакции гипохлорита 21
1.4. Гипохлорит - индуцированное ПОЛ 25
1.5. Пути образования гидропероксидов в организме 32
1.5.1. Перекисное окисление липидов 33
1.5.2. Синглетный кислород 33
1.5.3. Озонолиз 35
1.5.4. Катализ липоксигеназой 35
2. Экспериментальная часть 41
2.1. Используемые реагенты 41
2.2. Объекты исследования 42
Приготовление эмульсии жирной кислоты 42
Получение гидропероксида линолевой кислоты 42
Изолирование липопротеинов низкой плотности из крови человека 42
Изолирование нейтрофилов из крови человека 43
2.3. Методы исследования 43
2.3.1. Хемилюминесценция 43
Изучение реакции гипохлорита с mpem-бутилгидропероксидом
Исследование реакции гипохлорита с линолевой кислотой 44
Измерение спектров хеми люминесценции 44
2.3.2. ЭПР спиновых ловушек 44
Исследование реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом 45
Изучение реакции гипохлорита с линолевой кислотой и ее гидропероксидом 46
Образование свободных радикалов при миелопероксидазном катализе 46
Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами 47
2.3.3. Спектрофотометрическое определение концентрации диеновых конъюгатов 47
2.3.4. Статистическая обработка результатов 47
3. Результаты исследований 48
3.1. Изучение реакции гипохлорита с тре/я-бутилгидропероксидом 48
Исследование методом хемилюминесценции 48
Исследование методом спиновых ловушек 56
3.2. Исследование реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты 72
3.3. Образование свободнорадикальных интермедиатов при миелопероксидашом катализе в присутствии т/їг/и-бутилгидропероксида 89
3.4. Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами в присутствии mpe/и-бутилгидропероксида 104
4. Заключение 117
5. Выводы 126
6. Список литературы 128
- Физико-химические свойства хлорноватистой кислоты и гипохлорита
- Катализ липоксигеназой
- Исследование методом хемилюминесценции
- Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами в присутствии mpe/и-бутилгидропероксида
Введение к работе
При активации нейтрофилов и моноцитов во внеклеточную среду секретируется фермент - миелопероксидаза (МПО; донор: НгС^-оксидоредуктаза, КФ 1,11.1.7), который, используя в качестве субстрата пероксид водорода, катализирует двухэлектронное окисление хлорида до хлорноватистой кислоты (НОСІ, ионизированная форма - гипохлорит, ОСГ) по реакции: нго2 + н+ + сг -> н2о + НОСІ
Именно НОСІ/ОСГ принадлежит основная антимикробная, бактерицидная и детоксицирующая функция, которые выполняют нейтрофилы в организме [75]. НОС1/ОСГ - сильный окислитель и хлорирующий агент, вступает в реакцию со многими биологически активными соединениями: нуклеиновыми кислотами [166], углеводами [164], аминокислотами [7], белками [32]. Ранее были исследованы также его реакции с липидами. Оказалось, что НОС1/ОСГ реагирует с ненасыщенными липидами по двум основным механизмам. Первый - молекулярный. По этому механизму в результате присоединения НОСІ по двойной связи в качестве основных продуктов образуются изомеры хлоргидринов, а также их кислород- и хлорсодержащие метаболиты [24,38,165,170,193]. Помимо этого было обнаружено образование лизофосфолипидов [24,38], Второй механизм - свободнорадикальный, характеризуется аккумуляцией известных продуктов перокисидации липидов: гидропероксидов, диеновых конъюгатов, карбонилов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой, а также флюоресцирующих продуктов, являющихся результатом реакции окисленных липидов с белком [10,14-24,127,129-137,170]. Последнее обстоятельство заслуживает особого внимания, поскольку известно, что свободнорадикальные реакции перекисного окисления липидов (ПОЛ) играют важную роль в развитии целого ряда патологических процессов, таких как воспаления, артриты, лучевая болезнь, атеросклероз и др. [3,75].
Как любая свободнорадикальная цепная реакция гипохлорит-индуцированное ПОЛ имеет стадию инициирования. Согласно одной из гипотез [127,131-136], на роль стадии инициирования в этом случае может претендовать реакция НОС1/ОСГ с органическими гидропероксидами, которые всегда присутствуют in vivo в некотором количестве в составе ненасыщенного липида [147]. В пользу этого предположения указывает ряд имеющихся в настоящее время экспериментальных фактов: гипохлорит реагирует с гидропероксидной группой, но не с диалкил-, алкил-ацилпероксидами или эпоксидами, причем стехиометрическое соотношение реакции превышает 1 [132]; в указанной реакции не образуется синглетный кислород [17,132], как это установлено для реакции гипохлорита с пероксидом водорода [101]:
НОСІ + HjOj -+ '02 + СІ + Н+ + Н20; реакция гипохлорита с гидропероксидом сопровождается хемилюминесцениией [133], что свойственно свободнорадикальным реакциям [3]; присутствие гидропероксидов приводит к дополнительной аккумуляции продуктов ПОЛ в фосфолипидных липосомах, инкубируемых с гипохлоритом или в системе МПО+Н2О2+СГ, катализирую щей образование гипохлорита [127,133]; аккумуляция продуктов ПОЛ при действии гипохлорита на фосфолипидные липосомы, содержащие гидропероксиды, подавляется известными перехватчиками свободных радикалов [127,133]; основным молекулярным продуктом реакции гипохлорита с трет~ бутилгидропероксидом является ди-треж-бутилпероксид, образование которого можно объяснить лишь исходя из предположения о возникновении свободных радикалов в ходе указанной реакции [132,17].
Все эти данные хоть косвенно, но свидетельствуют в пользу того, что реакция гипохлорита с гидропероксидной группой протекает с образованием свободнорадикальных интермедиатов, наиболее вероятными из которых следует признать алкоксильный или пероксильный радикалы.
Однако до начала данной работы в литературе отсутствовали сведения о регистрации прямыми методами свободных радикалов, образующихся в реакции гипохлорита с гидропероксидами. Между тем, можно полагать, что знание механизма указанной реакции, с одной стороны, позволит пролить свет на развитие ранних стадий многих заболеваний, сопровождающихся активацией фагоцитов, а с другой - даст возможность оптимизировать применение гипохлорита в клинической практике в качестве детоксицирующего средства.
Цели работы: изучить механизм реакции гипохлорита и гипохлорит-образующих систем (миелопероксидаза, активированные нейтрофилы) с органическими гидропероксидами; попытаться зарегистрировать и идентифицировать свободнорадикальные интермедиаты, образующиеся в ходе указанных реакций.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
Используя методы хемилюминесценции и ЭПР спиновых ловушек попытаться зарегистрировать и идентифицировать свободные радикалы, образующиеся при взаимодействии гипохлорита с mpem-бутилгидропероксидом.
Методами хемилюминесценции и ЭПР спиновых ловушек изучить закономерности реакции гипохлорита с гидропероксидом линолевой кислоты.
Методом ЭПР спиновых ловушек исследовать свободнорадикальные интермедиаты, образующиеся в ходе инкубации гидропероксида в присутствии систем, продуцирующих гипохлорит: МПО+Н2О2+СГ и активированные нейтрофилы крови человека.
Путем ингибиторного анализа с использованием ловушек гипохлорита, перехватчиков свободных радикалов и ингибиторов МПО выяснить роль МПО и гипохлорита, образующегося в результате МПО-катализа, в разрушении гидропероксидной группы в присутствии изолированной МПО или активированных нейтрофилов,
Физико-химические свойства хлорноватистой кислоты и гипохлорита
Позднее Winterbourn с соавт. [193] показали, что НОС1/ОСГ действительно реагирует с двойными связями жирных кислот и фосфолипидов. Однако они не обнаружили среди продуктов реакции присутствия соединений, которые обычно образуются при свободнорадикальных процессах ПОЛ. Более того, ими были получены данные, свидетельствующие об ингибируїощем действии гипохлорита в отношении аккумуляции ТБК-реактивных продуктов (продуктов ПОЛ, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой) при окислении фосфолипидных липосом в системе гипоксантин + ксантиноксидаза или Fe2+ + аскорбат [195]. Сейчас уже ясно, что такой результат можно объяснить способностью НОС1/ОСГ реагировать с аскорбатом (см. табл. 3), Fe2+ [44,45], ТБК-реактивными продуктами [15,194], а также инактивировать ксантиноксидазу [176].
Впоследствии систематические исследования по изучению гипохлорит-индуцированного ПОЛ, проведенные разными методами, показали, что в ходе инкубации фосфолипидных липосом или липопротеинов крови в присутствии НОС1/ОСГ аккумурируются все основные виды продуктов ПОЛ: первичные (гидропероксиды и диеновые коньюгаты), вторичные (альдегидной природы, реагирующие с ТБК) и конечные (флуоресцирующие), являющие продуктом реакции окисленных липидов с белком [14,17-24,128-134,137]. Известные перехватчики свободных радикалов - ВНТ и сс-токоферол в низких концентрациях (0,7 и 10 мкМ соответственно) полностью предотвращали накопление продуктов ПОЛ в липосомах, инкубированных в присутствии гипохлорита. Это доказывает свободнорадикальную природу реакций, протекающих при введении гипохлорита в суспензию липосом из ненасыщенного фосфолипида.
Всякая свободнорадикальная реакция имеет стадию инициирования. Можно полагать, что инициация перекисного окисления липидов фосфолипидных липосом под действием НОСІ/ОСГ осуществляется в водной или липидной фазах суспензии. В водной фазе в качестве реакции, приводящей к образованию инициатора ПОЛ, могут быть реакции гипохлорита с Fe +, супероксидом или пероксидом водорода. Как было показано в разделе 2.3, гипохлорит реагирует с указанными соединениями с образованием гидроксильного радикала (реакции 14 и 15) или синглетного кислорода (реакция 16). Оба являются эффективными инициаторами реакций ПОЛ. В то же время, присутствие перечисленных выше водорастворимых агентов в качестве примеси в реакционной среде нельзя исключить полностью.
Тем не менее, специально проведенные эксперименты показали, что предварительное добавление в среду инкубации фосфолипидных липосом с гипохлоритом ионов железа, СОД, Н2О2 никак не сказалось на уровне регистрируемых после инкубации продуктов ПОЛ [18,19,23,131]. Это значит, что ни один из водорастворимых интермедиатов, присутствие которых можно было бы предположить в среде инкубации липосом с гипохлоритом (Н2О2, Fe2+, Fe3+, "О2"). не принимает участия в гипохлорит-индуцированном ПОЛ на стадии инициирования. Вероятно, эта стадия реализуется в липидной фазе липосом.
В липидной фазе фосфатидилхолиновых липосом инициирование ПОЛ может быть обусловлено взаимодействием НОС1/ОСГ с фосфохолиновой группой, с насыщенными (-Н2С-СН2-) и ненасыщенными (-НОСН-) связями, а также с минорными компонентами, в основном с продуктами ПОЛ, которые всегда присутствуют в следовых количествах в ненасыщенном липиде [16,20,131].
Методом хемилюминесценции удалось показать, что НОСІ/ОСТ не вступает в реакцию с липосомами из насыщенного фосфатидилхолина (димиристоилфосфатидилхолина), однако эффективно реагирует с двойными связями яичного фосфатидилхолина [22]. Поскольку яичный фосфатиди лхо лин отличается от DMPC наличием ненасыщенных связей, то данные результаты позволяют заключить, что гипохлорит не реагирует с фосфохолиновой группой и насыщенными связями. Реакция же с ненасыщенными связями протекает по молекулярному механизму с образованием хлоргидринов, (см. реакцию (11)) и не может быть источником свободнорадикальных интермедиатов.
Однако хлоргидрины могут претерпевать дальнейшее превращение с образованием эпоксидов [13], которые являются типичными молекулярными продуктами ПОЛ и в свою очередь быстро гидролизуются до гликолей:
Их количественное содержание иногда принимают в качестве меры интенсивности ПОЛ. Реакция дегидрохлорирования (19) должна протекать при щелочных значениях рН. В работе [16] было показано, что скорость образования продуктов ПОЛ в фосфолипидных липосомах, инкубируемых в присутствии гипохлорита, увеличивается с ростом рН среды в диапазоне 6,50 - 8,15. Этот экспериментальный факт позволяет предположить, что реакция (19) может играть определенную роль в инициировании ПОЛ липосом в присутствии гипохлорита.
Однако эксперименты, результаты которых представлены в работе [20], показали, что эпокси-группа (в составе 1/ис-9,10-эпоксистеариновой кислоты; 5а, 6а-эпоксида холестерина; цис- или транс-2,3-эпоксибутана) не определяется ни иодометрическим методом, ни методом Fe +-индуцированной хемилюминесценции и, в добавок к этому, не взаимодействует с НОСІ/ОСТ. Перечисленные факты свидетельствуют о том, что эпоксиды не являются тем интермедиатом, который образуется в ходе гипохлорит-индуцированного ПОЛ, или является инициатором свободнорадикальных реакций.
Из других кислород-содержащих продуктов ПОЛ, которые могли бы присутствовать в ненасыщенном фосфатидилхолине, следует выделить пероксидные соединения: гидропероксиды, диалкил-, диацил- и алкилацилпероксиды. Исследование реакции между гипохлоритом и органическими пероксидами, проведенное авторами работы [17], показало, что диалкил-, диацил- и алкилацилпероксидные группы не вступают в реакцию с гипохлоритом. В то же время, гидропероксидная группа, как в составе гидропероксида кумола, так и /ирет-бутилгидропероксида, эффективно реагировала с НОС1/ОСГ. Более того, эта реакция сопровождалась хемилюминесценцией.
Что касается механизма реакции гипохлорита с гидропероксидом, то здесь можно высказать, по крайней мере, два предположения. Во-первых, процесс может протекать через стадию образования синглетного кислорода (как это имеет место при взаимодействии гипохлорита с гидропероксидом водорода) [131].
Катализ липоксигеназой
Приготовление эмульсии жирной кислоты осуществляли следующим образом: к 3 мл 50 мМ фосфатного буфера, рН 12,0 добавляли 10 мкл линолевой кислоты (конечная концентрация 10 мМ), перемешивали на вортексе до образования прозрачного раствора, затем рН снижали до 9,0. Эмульсию использовали для получения гидропероксида линолевой кислоты.
Получение гидропероксида линолевой кислоты осуществляли путем ферментативного окисления линолевой кислоты в присутствии липоксигеназы при рН 9.0 [114,138]. Для этого к полученной эмульсии линолевой кислоты добавляли (0,6 -0,006 мг/мл) липоксигеназы. Смесь инкубировали 40 мин при комнатной температуре (рН 9,0). По окончании инкубации в тех случаях, когда это было необходимо, рН снижали до 7,4. Концентрацию гидропероксида линолевой кислоты определяли спектрофотометрически по содержанию диеновых конъюгатов (єгз4 = 2,95 104М"1см 1).
Изолирование липопротеинов низкой плотности из сыворотки крови человека осуществляли методом препаративного ультрацентрифугирования в растворах NaBr определенной плотности, как описано в работе [112]. Сыворотку получали центрифугированием крови в течение 30 мин при 1500g через час после забора крови. Для выделения липопротеинов использовали следующие растворы: А - 185 мМ NaCI, 0,01% EDTA, плотность 1,006 г/мл. В - 77,3 г NaBr в 1 л раствора А, плотность 1,065 г/мл. В центрифужную пробирку помещали 6,6 мл сыворотки, сверху осторожно наслаивали 3,4 мл раствора А. Центрифугировали при 105000g в течении 18 часов при 6С, после чего осторожно отбирали сверху 3,4 мл препарата липопротеинов очень низкой плотности. К остатку добавляли 523 мг NaBr, растворяли, перемешивали, доводя плотность до 1,065 г/мл, и осторожно наслаивали 3,4 мл раствора В. Центрифугировали вновь при 105000g в течении 18 часов при 6С, после чего отбирали сверху 3,4 мл препарата ЛНП. Полученные ЛНП диализовали против 145 мМ NaCI, 10 мМ фосфатного буфера, рН 7,4 в течение 18 часов при 4 С. Изолирование нейтрофилов из крови человека проводили, как описано в работе [42,43]. Кровь собирали в пластиковую посуду, содержащую 10 ед. гепарина на 1 мл крови. Кровь отстаивалась в течении 1 часа при комнатной температуре, в результате чего основная часть эритроцитов оседала. Супернатант, содержащий лейкоциты и тромбоциты, отбирали пипеткой, и осторожно наслаивали 2 мл супернатанта на 3 мл раствора фиколл-верографин с удельной плотностью 1,078; затем центрифугировали в течение 25 мин. при 400g. К осадку добавляли 1 мл дистилированной воды и пипетировапием в течение 40 секунд производили лизис оставшихся в осадке эритроцитов; затем добавляли 10 мл раствора Хенкса (несодержащего Са2+, Mg 2+), рН 7,4, перемешивали и осаждали клетки центрифугированием в течение 10 минут при 400g. К осадку добавляли 10 мл раствора Хенкса, рН 7,4, перемешивали и вновь центрифугировали 10 мин. при 400g. Затем, осадок осторожно ресуспендировали в 1 мл раствора Хенкса, рН 7,4 и определяли количество нейтрофилов в камере Горяева. Все процедуры проводили при температуре 4 С в пластиковой посуде. 2.3. Методы исследования 2.3,1. Хемилюминесценция Изучение реакции гипохлорита с трет-бутилгидропероксидом проводили на компьютеризированном хемилюминометре ХЛМ-3, изготовленном в ИРЭ РАН (Россия). Для этого при комнатной температуре к 1 мл раствора (СНз)зСООН в 50 мМ фосфатном буфере, рН 7,4 через инжектор добавляли 0,2 мл раствора гипохлорита, Fe или Се + необходимой концентрации в том же буфере. Далее регистрировали кинетику свечения в течение 30-40 с. В случае Fe + использовали свежеприготовленный раствор FeCl2 4H20, в который для предотвращения окисления Fe + добавляли одну каплю 0,1 н HC1 на 10 мл раствора. В качестве параметра, характеризующего интенсивность вспышки хемилюминесценции, использовали амплитуду. Исследование реакции гипохлорита с линолевой кислотой и ЛНП проводили на компьютеризированном хемилюминометре LKB 1251, произведенным WALL АС, в Финляндии, следующим образом: к 0,5 мл линолевой кислоты или суспензии ЛНП через синхронизированный с компьютером диспенсер добавляли НОСІ, в присутствии или отсутствии флуоресцентного красителя кумарин С-525, Добавление гипохлорита индуцировало быструю вспышку хемилюминесценции. Содержимое кювет интенсивно перемешивалось и термостатировалось при 25С. Кумарин С-525 добавляли к суспензии линолевой кислоты и ЛНП в виде этанольного раствора так, чтобы конечная концентрация этанола в кювете не превышала 4 об. %. Из литературных данных известно, что в таких концентрациях этанол не оказывает заметного влияния на кинетику процесса ПОЛ [156]. Измерение спектров хемилюминесценции проводили на хемилюминометре ХЛМ-3, с помощью набора граничных адсорционных светофильтров, помещая их непосредственно между кюветой и фотоэлектронным умножителем, как описано в работе [158]. Используемый фотоэлектронный умножитель имел спектральную чувствительность в области 170-800 нм с максимумом при 350-450 нм. Интенсивность каждого спектра нормировали к 1 с учетом спектральной чувствительности фотоэлектронного умножителя. Изучение короткоживущих радикалов, образующихся в реакции гипохлорита с органическим гидропероксидом, проводили, используя метод спиновых ловушек. Суть метода заключается в том, что спиновая ловушка взаимодействует с короткоживущим радикалом и превращается в долгоживущий нитроксильный радикал (спиновый аддукт). Это дает возможность зарегистрировать спектр ЭПР, который имеет характерные параметры для данного радикала. В качестве спиновых ловушек в работе были использованы С-фенил-NtJ/wm-бутилнитрон (ФБН) и 4-пиридил-1-оксид-К-т/?ет-бутил нитрон (4-ПОБН), относящиеся к классу нитронов. Реакция образования спинового аддукта радикала R" и ловушки ФБН описывается следующим уравнением:
Исследование методом хемилюминесценции
При добавлении Се4+ к (СНз)зСООН в присутствии или в отсутствие этанола регистрировались спектры ЭПР идентичных спиновых аддуктов (см. табл. 7). Это связано с тем, что образующийся в ходе исследуемой реакции (23) пероксильный радикал не способен отрывать атом водорода от этанола, вследствие этого образование гидроксиэтильного радикала невозможно.
Аналогичные результаты мы получили при добавлении гипохлорита к (СНз)зСООН в присутствии или в отсутствие этанола. В этом случае образовывался спиновый аддукт, сходный по параметрам со спиновым аддуктом, полученным при взаимодействии Се с (СНз)зСООН (см, табл. 7). Присутствие этанола никак не влияло на спектральные параметры аддукта. Этот результат свидетельствует о том, что в ходе реакции гипохлорита с (СНз)зСООН образуется тот же свободный радикал, что и в реакции Се + с (СНз)зСООН, то есть пероксильньгй радикал.
Итак, совокупность результатов, полученных с использованием методов хемилюминесценции и спиновых ловушек, позволяет заключить, что в реакции гипохлорита с (СНз)зСООН в качестве свободнорадикального иитермедиата образуется пероксильный радикал, который, как известно [3,184], является типичным инициатором свободнорадикальных реакций, в частности реакций перекисного окисления липидов.
Результаты предыдущего раздела свидетельствуют о том, что гипохлорит, образующийся при активации нейтрофилов и моноцитов по реакции, катализируемой МПО, реагирует с гидропероксидной группой. Причем, в ходе этой реакции образуются свободные радикалы, а именно, пероксильные радикалы. Вероятнее всего, именно они играют роль инициаторов свободнорадикального ПОЛ, неоднократно зарегистрированного ранее в ненасыщенном липиде при действии на него гипохлорита [127-137]. Для приближения условий наших экспериментов к более естественным, мы в дальнейшем изучали взаимодействие гипохлорита с жирными кислотами и гидропероксидами, полученными на их основе.
Исследование методом хемилюминесценции. На рис. 28. а приведены зависимости интенсивности хемилюминесценции (в относительных единицах) от концентрации гипохлорита при его добавлении в суспензию насыщенной (стеариновой) или ненасыщенной (линолевой) жирной кислоты. Видно, что интенсивность свечения по мере увеличения концентрации гипохлорита хоть и возрастает, но остается весьма слабой и не различается в пределах ошибки эксперимента для двух исследованных жирных кислот. Результаты аналогичного эксперимента, отличающегося лишь тем, что непосредственно перед введением гипохлорита в суспензию жирных кислот был добавлен фотосенсибилизатор - кумарин С-525, приведены на рис. 28 б. Из этого рисунка следует, что при прочих равных условиях добавление гипохлорита к ненасыщенной жирной кислоте в присутствии кумарина С-525 сопровождается значительно более интенсивным свечением по сравнению с насыщенной стеариновой кислотой. Примеры кинетических кривых хемилюминесценции в случае линолевой кислоты в присутствии и в отсутствие кумарина С-525 приведены на рис. 29.
Линолевая кислота отличается от стеариновой лишь наличием в цепи двух ненасыщенных связей. Ранее было установлено, что гипохлорит реагирует с ненасыщенными связями жирнокислотных цепей по механизму электрофильного присоединения с образованием хлоргидринов, но без участия свободных радикалов [24]. Вместе с тем известно, что ненасыщенные жирные кислоты склонны к спонтанному окислению с образованием в качестве первичных молекулярных продуктов эквимолярного количества диеновых конъюгатов и гидропероксидов [75]. Специально проведенные эксперименты показали, что в составе использованной нами линолевой кислоты часть двойных связей была окислена. Содержание диеновых конъюгатов, определенное спектрофотометрическим методом, а значит и содержание гидропероксидов составило около 7 %.
Из литературных данных [156-158,185] известно, что кумарин С-525 увеличивает вспышку хемилюминесценции процессов, протекающих в гидрофобной фазе с участием пероксильных радикалов. Вероятно, увеличение интенсивности хемилюминесценции происходит по механизму переноса энергии с первичных возбужденных продуктов рекомбинации липидных пероксильных радикалов на флуорофор - кумарин С-525. Основываясь на этих данных, можно предположить, что обнаруженное нами увеличение хемилюминесценции при добавлении гипохлорита к линолевой кислоте в присутствии кумарина С-525 связано с образованием пероксильных радикалов при взаимодействии гипохлорита с гидропероксидами, имеющимися в частично автоокисленной линолевой кислоте.
Для проверки этого предположения мы провели эксперименты, в ходе которых к суспензии линолевой кислоты добавляли различные фиксированные количества m/wtf-бутилгидропероксида. Реакцию запускали введением в смесь гипохлорита и регистрировали вспышку хемилюминесценции. На рис. 30. представлена зависимость интенсивности хемилюминесценции при добавлении гипохлорита к раствору трет-бутилгидропероксида в водной фазе (рис. 30 я) или в суспензию линолевой кислоты (рис. 3 б) от концентрации /ярет-бутилгидропероксида в отсутствие и в присутствии кумарина С-525. Видно, что в гомогенной водной среде зависимости мало различаются. Присутствие кумарина лишь незначительно увеличивает свечение после добавления гипохлорита. Если же гипохлорит вводили в суспензию линолевой кислоты,
Образование свободных радикалов активированными нейтрофилами в присутствии mpe/и-бутилгидропероксида
Активация полиморфноядерных лейкоцитов, как известно из литературных данных [67,76,108,191], сопровождается образованием НОС1/ОСГ по реакции (1), катализируемой ферментом — миелопероксидазой (МПО) (см. главу 1). В этом разделе, нами была создана модельная система наиболее приближенная к условиям ш vivo, использование которой позволило нам изучить образование свободных радикалов при разложении гидроперокснда в присутствии активированных нейтрофилов.
На рис. 49 а приведен экспериментальный спектр ЭПР, полученный в результате инкубации спиновой ловушки 4-ПОБН в присутствии нейтрофилов и опсонизированыого зимозана после добавления гидроперокснда. Наличие сигнала указывает на образование в системе свободных радикалов. Если в среде инкубации отсутствовали нейтрофилы (рис. 49 д) или гидропероксид (рис. 49 б и г), то спектр ЭПР не регистрировался вовсе.
При отсутствие зимозана в исследуемой системе мы регистрировали сигнал ЭПР (рис. 49 6), но интенсивность его была ниже, чем в его присутствии (рис. 49 а). Сам зимозан, добавленный к спиновой ловушке 4-ПОБН и гидропероксиду сигнала не давал (рис. 49 д). Эти результаты позволяют полагать, что для образования свободных радикалов необходимо присутствие нейтрофилов (лучше активированных) и гидроперокснда.
С целью идентификации образующихся свободнорадикальных интермедиатов мы смоделировали экспериментальный спектр, исходя из предположения, что он представляет собой суперпозицию двух сигналов. Этот спектр приведен на рис. 50 а. Его модельный спектр представлен на рис. 50 б. Можно видеть, что он практически полностью совпадает с экспериментальным, что подтверждает наше предположение о существовании двух типов спиновых аддуктов в системе: 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан + (СНз)зСООН. Индивидуальные спектры этих двух компонент были промоделированы и представлены на рис. 50 б и г. Сигнал первого аддукта обладал следующими константами сверхтонкого расщепления: арН= 0,234 мТ; aN= 1,493 мТ, ДНрр= 0,067 мТ. Они очень близки по значению к спектральным параметрам аддуктов, полученных нами при взаимодействии гипохлорита или церия с (СНз)зСООН (см. табл. 6), и идентифицированные ранее как аддукты mpem-бутилпероксильного радикала ((СНз)зСОО ). Его доля в суммарном спектре составляет 55%. Вторая компонента (рис. 104 г) имела следующие спектральные параметры: ар = 0,286 мТ; а = 1,628 мТ, ДНрр= 0,092 мТ, которые близки к параметрам спиновых аддуктов, полученных нами при взаимодействии Fe2+ с (СНз)зСООН (см. таб, 6). Вероятнее всего, это аддукт трет бутоксильного радикала ((СНз)зСО ). Его доля в суммарном спектре равна 45%.
На рис. 51 приведена кинетическая кривая изменения интенсивности сигнала ЭПР, зарегистрированного в системе: 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан + (СНз)зСООН. Видно, что образующиеся аддукты относительно стабильны. Более того, их содержание в инкубационной среде со временем возрастает. Константы сверхтонкого расщепления спектра ЭПР при этом не менялись. Этот факт свидетельствует о том, что образовавшиеся первичные спиновые аддукты не трансформируются в аддукты другой химической природы.
Для выяснения механизма образования свободнорадикальных интермедиатов в системе: 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан + (СНз)зСООН, мы предварительно добавляли в среду инкубации перехватчики свободных радикалов (ВНТ или маннитол), ингибиторы МПО (салицилгидроксамовую кислоту или гидразид 4-аминобензойной кислоты) и перехватчики гипохлорита (таурин или метионин). Спектры ЭПР образовавшихся спиновых аддуктов приведены на рис. 52, 53 и 54.
Видно, что в присутствии ВНТ и маннитола (рис. 52 б и в соответственно) интенсивность сигнала ЭПР заметно снижается по сравнению с таковым, зарегистрированным в отсутствие указанных перехватчиков свободных радикалов (рис. 52 а). Это означает, что свободные радикалы играют важную роль при распаде гидропероксидной группы в присутствии активированных нейтрофилов.
Введение в инкубационную среду ингибиторов МПО - салицилгидроксамовую кислоту или гидразид 4-аминобензойной кислоты - также приводит к снижению интенсивности сигнала ЭПР (рис. 53 б и в соответственно). Данный факт позволяет утверждать, что образование определенной части аддуктов в системе 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан + (СНз)зСООН обусловлено функционированием фермента -МПО.
Перехватчики гипохлорита - таурин и метионин - также в значительной степени снижают образование спиновых аддуктов активированными нейтрофилами в присутствии гидропероксида (рис. 54 б и в соответственно), что свидетельствует об участии гипохлорита, а стало быть и цикла хлорирования в образовании свободнорадикальных в образовании свободнорадикальных интермедиатов при добавлении гидропероксида к гипохлорит образующей системе (в данном случае -это нейтрофилы).
На рис. 55 а приведен спектр ЭПР, зарегистрированный в системе 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан + (СНз)зСООН, в которую предварительно был добавлен таурин. Смоделированный спектр и отдельные его составляющие представлены на рис. 55 6t в и г. Анализ указанных спектров показал, что добавление таурина в инкубационную смесь, не влияет на значения констант сверхтонкого расщепления спиновых аддуктов и практически не изменяет их процентное сотношение. Это означает, что при добавлении ловушки гипохлорита (таурина) в исследуемую систему образуются те же самые спиновые аддукты, в том же самом процентном соотношении, но в меньшем абсолютном количестве в сравнении со случаем, когда таурин отсутствовал.
На рис. 56 приведены кинетические кривые изменения интенсивности сигнала ЭПР спиновых аддуктов радикалов, зарегистрированных нами после добавления трет-бутилгидропероксида в систему 4-ПОБН + нейтрофилы + зимозан, содержащую ловушки гипохлорита (таурин и метионин) - кривые бив, перехватчик свободных радикалов (ВНТ) - кривая г, или ингибиторы МПО (гидразин 4-аминобензойной кислоты и салицилгидроксамовую кислоту) - кривые д и е. Из рис. 56, (кривая г) видно, что в присутствии ВНТ сигнал ЭПР значительно снижается. Таурин и метионин (рис. 55, кривая бив) также препятствуют образованию спиновых аддуктов.
Наконец, введение в среду инкубации ингибиторов МПО практически полностью блокирует образование спиновых аддуктов по мере инкубации. Данный факт позволяет утверждать, что образование большей части аддуктов обусловленно работой фермента МПО.
