Введение к работе
Актуальность проблемы
Воспаление и сопутствующий ему окислительный стресс являются фундаментальными механизмами защиты организма от инфекций. Нарушение функционирования какой-либо из составляющих частей этого сложного и многоступенчатого процесса ведет к развитию серьезных заболеваний. Нейтрофилы являются основными участниками воспалительного процесса. Они секретируют миелопероксидазу (МПО), которая катализирует образование мощного окислителя - гипохлорита. В физиологических условиях гипохлорит окисляет белки и аминокислоты плазмы (Priitz W.A., 1999; Hawkins C.L., et al., 2003). Такое состояние принято называть хлорирующим стрессом. За последние пять лет опубликовано более 5 тысяч работ, посвященных изучению роли гипохлорита и его производных в патогенезе различных заболеваний, в том числе болезни Альцгеймера, атеросклероза, аутоиммунных заболеваний, хронических заболеваний дыхательной системы (Nathan С, 2002; Roman R.M., et al., 2008; Nicholls S.J. and Hazen S.L., 2005). В свете этого очевидно, что существует потребность в разработке новых лекарств и новых методов лечения заболеваний, в патогенезе которых участвует воспаление. В то же время без понимания механизмов функционирования биологических систем на клеточном и молекулярном уровне создание лекарств не возможно.
Данная работа посвящена изучению влияния хлорирующего стресса на апоптоз клеток и последующий их фагоцитоз. Бактерицидная роль гипохлорита (НОСІ) хорошо известна. В то же время НОСІ представляет собой чрезвычайно реакционно-способную молекулу и может окислять клеточные липиды и белки (Carr А.С., et al., 1998; Servaty R., et al., 1998; Rees, M.D., et al., 2003; Panasenko O.M., et al., 2003). В зависимости от окислительно-восстановительного состояния клетки последствия хлорирующего стресса для нее могут быть различными. К примеру, известно, что антиоксидантный статус клеток участвует в регуляции клеточной гибели, и на ранних этапах апоптоза наблюдается снижение антиоксидантов (Franco R. and Cidlowski J.A., 2006; Armstrong J.S„ and Jones D.P., 2002). Большая часть предшествующих работ была посвящена изучению влияния гипохлорита на живые клетки, у которых уровень антиоксидантов высок. В то же время более вероятно, что in vivo воздействию хлорирующего стресса подвергаются как раз погибающие клетки, у которых понижен уровень антиоксидантной защиты. Одной из основных задач данной работы было изучение влияния хлорирующего стресса на развитие в клетках апоптотической программы.
Другим, не менее важным аспектом воспаления, является фагоцитоз поврежденных и мертвых клеток. Известно, что развитие хронических заболеваний тесно связано с нарушением фагоцитоза клеток в очаге воспаления (Rosen and Casciola-Rosen, 1999). Если эффекты влияния гипохлорита на клетки достаточно интенсивно изучаются, то последствия
воздействия хлорирующего стресса на фагоцитоз клеток остаются неизученными. Даннаї работа посвящена изучению последствий воздействия хлорирующего стресса на клетки мишени, находящиеся в различных физиологических состояниях с точки зрени) последующего их фагоцитоза макрофагами.
Окислительный стресс сопровождает различные патологические состояния (например, острые и хронические воспалительные процессы). Однако несмотря на обилие информации, касающейся образования НОСІ в тканях, влияние его на внутриклеточные процессы мало изучено.
Цель и задачи исследования
Целями работы было изучение роли гипохлорита в регуляции апоптоза лейкоцитов млекопитающих и последующего фагоцитоза поврежденных клеток макрофагами. Для этого были поставлены следующие экспериментальные задачи:
Разработать новый автоматизированный метод анализа фагоцитарной активности макрофагов на основе конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Изучить влияние токсичного воздействия хлорирующего стресса (100-500 мкМ гипохлорита в полной среде в течение 16ч) на выживаемость и последующий фагоцитоз клеток макрофагами.
Изучить влияние субтоксичного хлорирующего стресса (100-1000 мкМ гипохлорита в бессывороточной среде в течение 1ч) на фагоцитоз клеток макрофагами.
Изучить влияние субтоксичного хлорирующего стресса на уровень глутатиона и белковых SH-групп в клетках.
Изучить влияние хлорирующего стресса на основные этапы апоптоза клеток.
Изучить влияние хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток.
С помощью липосом изучить роль фосфатидилсериновых рецепторов в фагоцитозе клеток, подвергшихся воздействию хлорирующего стресса
Основные положения, выносимые на защиту Научная новизна работы
В рамках данной работы разработан новый метод анализа фагоцитарной активности макрофагов. Впервые изучено влияние различных биологических окислителей на фагоцитоз апоптотических клеток макрофагами. Впервые показан ингибирующий эффект хлорирующего стресса на фагоцитоз апоптотических клеток. Впервые продемонстрировано,
что под действием гипохлорита снижается уровень экстернализированного на поверхности клеток фосфатидилсерина. Впервые показано, что на фоне снижения содержания восстановленного глутатиона (основного внутриклеточного антиоксвданта) в апоптотических клетках под воздействием хлорирующего стресса происходит окисление SH-групп внутриклеточных белков. Получены косвенные данные, дающие основание полагать, что макрофаги обладают рецепторами для распознавания модифицированного гипохлоритом фосфатидилсерина на поверхности клеток-мишеней.
Теоретическое и практические значение работы
В ходе данной работы был разработан новый метод анализа фагоцитарной активности макрофагов. Данный метод основан на конфокальной флуоресцентной микроскопии, но также обладает всеми преимуществами, характерными для более производительных методов (как например, проточно-цито.метрические методы). Оригинальные макрокоманды для программ Image J и EZ-C1 2.30 Software позволяют анализировать большие популяции клеток в сжатые сроки, благодаря чему обеспечивается статистическая надежность получаемых результатов. Этот подход может в дальнейшем использоваться в работе, связанной с выявлением новых факторов, влияющих на фагоцитоз, или новых фагоцитарных рецепторов.
В работе достигнут значительный прогресс в понимании роли хлорирующего стресса в апоптозе клеток млекопитающих, а также в последующем их фагоцитозе макрофагами. Впервые выявлены эффекты хлорирующего стресса на основные этапы апоптоза. Оказалось, что гипохлорит нарушает течение апоптотической программы в клетках, в результате чего, клетки переходят к стадии вторичного некроза, характеризующейся нарушением целостности плазматической мембраны апоптотической клетки. Такие клетки значительно хуже фагоцитируются макрофагами. Ключевую роль в этом остаточном фагоцитозе играет окисленный фосфатидилсерин цитоплазматической мембраны. В то же время, субтоксичное воздействие хлорирующего стресса на нативные клетки не оказывает влияния на фагоцитоз. Результаты работы открывают новые возможности для исследования механизмов фагоцитоза клеток в условиях окислительного стресса. Они согласуются с общими представлениями о провоспалительной роли миелопероксидазной системы в организме. Представляется перспективным дальнейшее изучение миелопероксидазной системы как возможной мишени фармакологических препаратов, направленных на лечение заболеваний, связанных с воспалением.
Апробация работы
Основные положения диссертации были доложены и обсуждались на научных семинарах группы морфологии и семинарах отдела Молекулярной генетики человека
Института Физико-Химической Медицины Росздрава РФ, а также на ежегодных научных конференциях Института Физико-Химической Медицины Росздрава РФ.
Публикации
По теме диссертации опубликована 1 статья и сделано 2 стендовых сообщения на международных конференциях.
Объем и структура диссертации
