Введение к работе
Актуальность темы. Сахарный диабет (СД) является одной из актуальнейших проблем здравоохранения. Самыми опасными последствиями СД являются его системные сосудистые осложнения - нефропатия, атеросклероз кровеносных сосудов сердца, головного мозга и нижних конечностей (Шестакова М.В., Дедов И.И. 2006, 2009, 2011). Именно клетки сосудистой стенки служат основной мишенью для повреждения при СД. Основным повреждающим фактором при СД является гипергликемия, которая посредством активации сорбитолового пути, протеинкиназы С и гликирования белков приводит к развитию окислительного стресса, уменьшению образования оксида азота NO и увеличению синтеза белков внеклеточного матрикса клетками сосудистой стенки, что, с одной стороны, способствует ускоренному развитию атеросклероза и прогрессированию макроангиопатий, а с другой — вызывает повреждение микрососудистого русла. Нарушение процессов неоваскуляризации в сетчатке глаза проявляется избыточным ангиогенезом с образованием неполноценных высокопроницаемых сосудов, что приводит к диабетической ретинопатии (Шестакова М.В., Дедов И.И. 2011). В сердце и мышцах нижних конечностей нарушения неоваскуляризации, напротив, проявляются недостаточным адаптивным ангио-артериогенезом, что способствует развитию тяжелой ишемии, незаживающих трофических язв и отягощено последующими ампутациями (Удовиченко О. В., Грекова Н. М., 2010).
Неоваскуляризация ишемизированных тканей опосредована участием нескольких типов клеток сосудистой стенки, а именно эндотелиальных и прогениторных, включая резидентные мезенхимальные стволовые клетки (МСК), локализующиеся в стенке сосуда (Potente М, Gerhardt Н, Carmeliet Р, 2011). Репарация сосудистой стенки и неоваскуляризация также опосредованы циркулирующими предшественниками эндотелиальных клеток (ЦПЭК), мобилизующимися из костного мозга в ответ на ишемию и повреждение сосудов (Chavakis Е, Dimmeler S.,2011; Dimmeler S.,2010)
Процесс ангиогенеза начинается с активации эндотелиальных клеток (ЭК) при возникновении локальной ишемии тканей за счет того, что в условиях гипоксии в клетках тканей повышается продукция ангиогенных факторов, прежде всего фактора роста эндотелия сосудов (VEGF), рецепторы к которому селективно экспрессированы на ЭК. Взаимодействие VEGF с рецепторами 1 и 2 типов на поверхности ЭК запускает внутриклеточный сигнальный каскад, ведущий к
активации пролиферации и миграции этих клеток, что в конечном итоге приводит к формированию нового сосудистого отростка. Для дальнейшего роста новых кровеносных сосудов необходимо участие резидентных МСК, которые в значительной степени представлены перицитами. Они продуцируют ангиогенные факторы роста, включая VEGF, bFGF, HGF и TGF-P и отвечают за стабилизацию новых сосудов и формирование зрелой сосудистой сети (Potente М, Gerhardt Н, Carmeliet Р, 2011). Помимо этого в процессах неоваскуляризации ишемизированных тканей участвуют и циркулирующие предшественники эндотелиальных клеток, которые мобилизуются из костного мозга в ответ на ишемию тканей и повреждение эндотелия сосудов, мигрируют в участок повреждения, где замещают поврежденные ЭК и участвуют в формировании новых сосудов (Dimmeler S.,2010). При нарушениях мобилизации предшественников эндотелиальных клеток из костного мозга их количество в крови и их участие в процессах репарации и неоваскуляризации может нарушаться.
Для понимания молекулярных механизмов нарушенной неоваскуляризации при сахарном диабете необходимо исследование влияния гипергликемии на все типы клеток, участвующие в формировании новой сосудистой сети.
Цель исследования: изучить влияние высокого уровня глюкозы на функциональные свойства основных типов клеток, участвующих в процессах роста и восстановления кровеносных сосудов, и исследовать влияние нарушения углеводного обмена на количество циркулирующих прогениторных клеток у больных ишемической болезнью сердца.
Задачи исследования:
Проанализировать влияние высокой концентрации глюкозы на уровень экспрессии рецепторов VEGF-A 1 и 2 типов на эндотелиальных клетках, направленную миграцию и формирование этими клетками капилляроподобных структур in vitro.
Исследовать влияние культивирования мезенхимальных стволовых клеток при высокой концентрации глюкозы (25 мМ) на способность продуктов секреции этих клеток, стимулировать капиллярогенез in vitro.
Оценить влияние культивирования мезенхимальных стволовых клеток при высокой концентрации глюкозы (25 мМ) на уровень экспрессии генов, кодирующих факторы, регулирующие ангиогенез.
Исследовать влияние сопутствующего сахарного диабета 2 типа на число циркулирующих прогениторных клеток в периферической крови больных ИБС.
5. Оценить связь между показателями углеводного обмена и количеством циркулирующих прогениторных клеток у больных ИБС, сочетающейся с сахарным диабетом и без него.
Научная новизна. Впервые установлено, что культивирование эндотелиальных клеток при высокой концентрации глюкозы (25мМ) подавляет их ангиогенные свойства - способность к миграции на ангиогенные факторы и к формированию капилляроподобных структур, что может быть обусловлено подавлением уровня экспрессии рецепторов к VEGF на этих клетках. Впервые показано, что культивирование мезенхимальных стволовых клеток при высокой концентрации глюкозы (25мМ) изменяет уровень экспрессии генов, регулирующих ангиогенез, и подавляет способность этих клеток стимулировать ангиогенез за счет секреторной активности. Впервые обнаружено, что количество циркулирующих прогениторных клеток (ЦПК) в периферической крови больных ИБС, сочетающейся с СД 2 типа, тесно соотносится с уровнем гипергликемии и состоянием компенсации нарушений углеводного обмена: количество ЦПК значительно снижено при выраженной гипергликемии и декомпенсации диабета.
Практическая значимость. Результаты исследования расширяют представления о влиянии гипергликемии на клетки сосудистой стенки и механизмах нарушения роста и репарации кровеносных сосудов у больных сахарным диабетом. Представленные результаты могут служить основой для дальнейшей разработки методов восстановления кровоснабжения ишемизированных тканей с использованием генной и клеточной терапии у больных ишемической болезнью сердца, отягощенной сахарным диабетом, а также для поиска новых маркеров неблагоприятного прогноза ИБС при ее сочетании с сахарным диабетом. Согласно полученным результатам таким новым прогностическим показателем может стать количество ЦПК в периферической крови больных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Высокая концентрация глюкозы подавляет ангиогенные свойства ЭК: направленную миграцию на факторы ангиогенеза и способность формировать капилляроподобные структуры. Одним из механизмов этого подавления может быть снижение экспрессии рецепторов к VEGF на ЭК.
Культивирование МСК в среде с высокой концентрацией глюкозы снижает способность этих клеток стимулировать ангиогенез in vitro за счет секреторной активности.
У больных ИБС и сопутствующим СД 2 типа количество прогениторных клеток, несущих на поверхности антиген CD34, в периферической крови обратно коррелирует с уровнем глюкозы, инсулина.
При декомпенсированном сахарном диабете 2 типа количество циркулирующих прогениторных клеток в периферической крови снижено.
Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в курсе лекций по клинической биохимии, эндокринологии и кардиологии на Факультете фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на совместном семинаре сотрудников кафедры биохимии и молекулярной медицины, лаборатории генных и клеточных технологий и лаборатории постгеномных технологий Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В.Ломоносова; лабораторий молекулярной эндокринологии и ангиогенеза Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗСР РФ (31 января 2012 г.).
Материалы диссертации доложены на Всероссийском симпозиуме «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009г.); 3-ей Всероссийской молодежной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010г.); 9-ом Международном конгрессе по болезням коронарных сосудов (Венеция, Италия, 2011г.), Научной сессии «Сахарный диабет: инновационные технологии диагностики, лечения и профилактики» Общего собрания РАМН (Москва, 2011г.) и 5-ой Всероссийской школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012г.).
Работа выполнялась в рамках Государственных контрактов № 16.512.12.2005 от «16» июня 2011 г. и № 16.512.11.2262 от «14» сентября 2011 г. в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 5 статей в центральных рецензируемых журналах и 2 главы в сборнике статей.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, клинической
характеристики пациентов и методов их исследования, результатов исследования, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 29 отечественных и 273 зарубежных источников. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 17 рисунками.
