Введение к работе
Актуальность проблемы
Идея ниши, как специфического микроокружения, модулирующего поведение стволовых клеток, была предложена Шофилдом в 1978 году, что дало начало бурно развивающейся сегодня области исследования – ниш стволовых клеток (Schofield et al., 1978). Судьбу гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) определяет кроветворная ниша, расположенная в костном мозге. Клеточные и неклеточные компоненты микроокружения поддерживают состояние покоя, деления, самообновления или дифференцировки ГСК. Известно, что в костном мозге более примитивные гемопоэтические клетки находятся при 1 – 2% кислорода в окружении остеобластов и клеток стромы, в то время как более зрелые предшественники расположены в сосудистой нише, где уровень кислорода выше (Parmar et al., 2007). Показано, что в условиях in vitro содержание кислорода может влиять на гемопоэтические клетки, оказывая существенный эффект на предшественников одного уровня иерархии и оставаясь индифферентным для других (Cipolleschi et al., 1993).
Известно, что свойства стромальных клеток – основного клеточного компонента костномозговой ниши, также зависят от уровня кислорода. В опытах in vitro показано, что при гипоксии увеличивается их пролиферативная активность и число КОЕ-Ф, замедляется дифференцировка в остео- и адипогенном направлении, а в хондрогенном усиливается (Буравкова и др., 2009; Grayson et al., 2007; Fehrer et al., 2007; Nekanti et al., 2010). К сожалению, влиянию концентрации кислорода на взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток до сих пор уделяется недостаточно внимания. В нашей лаборатории впервые было показано, что при совместном культивировании мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) и ГСК происходит увеличение продукции медаторов, опосредующих взаимодействие гемопоэтичеких и стромальных клеток (Жамбалова и др., 2009). В более поздних работах других авторов продемонстрировано, что, в отличие от стандартных условий культивирования, низкие концентрации кислорода способствуют поддержанию ранних гемопоэтических клеток, находящихся в состоянии покоя (Hammoud et al., 2011; Jing et al., 2012).
Большая часть исследований по взаимодействию ММСК и ГСК до недавнего времени проводилась на стромальных и гемопоэтических предшественниках, выделенных из костного мозга (Arai & Suda, 2007; Valtieri & Sorrentino, 2008). В результате было показано, что ММСК, использованные в качестве фидерного подслоя, могут существенным образом влиять на сокультивируемые с ними ГСК, в частности, изменяя соотношение коммитированных и малодифференцированных предшественников, обеспечивающих длительное восстановление кроветворения (Петрова и др., 2006; Moore et al., 1997; Punzel et al., 2003; McNiece et al., 2004; Freund et al., 2006; Hofmeister et al., 2007; Wagner et al., 2007). ММСК из жировой ткани человека (жтММСК), также как и ММСК из костного мозга могут поддерживать гемопоэз in vitro (Corre et al., 2006). Однако, несмотря на близкое родство, ММСК из жировой ткани с меньшей эффективностью, чем ММСК из других источников способствуют пролиферации примитивных гемопоэтических предшественников (Wagner et al., 2007). Аналогичные результаты получены и в других работах, где показано, что при сокультивировании ГСК и МСК из жировой ткани образуется меньшее количество CD34+ клеток, чем при сокультивировании с костномозговыми ММСК (Kirloy et al., 2007; de Toni et al., 2011). С другой стороны, ММСК из жировой ткани способствуют дифференцировке ГСК и более эффективно поддерживают дифференцированные гемопоэтические предшественники (Nakao et al., 2010).
Как альтернативу гемопоэтическим клеткам костного мозга все чаще используют мононуклеары пуповинной крови (пкМНК) (Maniani et al., 1998). Несмотря на то, что это перспективный и легкодоступный источник ГСК, существенным недостатком применения является ограниченное количество стволовых клеток. С целью обогащения ранними гемопоэтическими предшественниками используют различные варианты культивирования клеток пуповинной крови (Bridell et al., 1997, Mayani et al., 1998, McNiece et al., 2004). Основное внимание исследователей при этом сосредоточено на подборе компонентов ростовых сред и методов изоляции малодифференцированных клеток. Между тем, в большинстве существующих моделей культивирования ГСК из пуповинной крови остается недооцененной роль локального микроокружения: взаимодействия со стромальными элементами, паракринной регуляции и концентрации кислорода.
Несмотря на проведение большого количества исследований, направленных на изучение межклеточных взаимодействий в тканевой нише гемопоэтических клеток, конкретные пути реализации влияния ниши на стволовые клетки до сих пор остаются нераскрытыми. Изучение особенностей взаимодействия гемопоэтических и стромальных клеток в условиях тканевых концентраций кислорода позволит расширить представления о влиянии факторов микроокружения на регуляцию гемопоэза, а также может использоваться в дальнейшем при разработке методик обогащения стволовыми и прогениторными клетками трансплантатов кроветворной ткани.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы являлось сравнительное изучение особенностей межклеточного взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях различного содержания кислорода.
В соответствии с указанной целью были поставлены следующие задачи:
-
разработать экспериментальную модель для получения адгезирующих малодифференцированных предшественников пкМНК с использованием жтММСК;
-
оценить влияние сокультивирования с жтММСК при различном содержании кислорода на адгезирующую и суспензионную фракции пкМНК;
-
охарактеризовать функциональные и фенотипические особенности гемопоэтических клеток, образующихся из адгезирующей к жтММСК фракции пкМНК;
-
оценить влияние сокультивирования с жтММСК и различных концентраций кислорода на продукцию паракринных медиаторов пкМНК и полученными из них малодифференцированными гемопоэтическими предшественниками.
Научная новизна
Разработана и апробирована модель совместного культивирования жтММСК и пкМНК, в которой способность адгезирующей фракции пкМНК к экспансии оценивается при культивировании в отсутствие суспензионной фракции.
Впервые показано, что жтММСК в диапазоне концентраций кислорода 1-5-20% в среде при совместном культивировании могут эффективно поддерживать жизнеспособность пкМНК, в том числе малодифференцированных предшественников.
Впервые показано, что адгезирующая к жтММСК фракция пкМНК способна генерировать популяцию клеток, обогащенную гемопоэтическими предшественниками разной степени коммитированности.
Установлено, что в условиях пониженного содержания кислорода из пкМНК образуется большее количество гемопоэтических колоний, а также изменяется соотношение колониеобразующих единиц (КОЕ): увеличивается доля унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшается доля мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ). После кратковременного сокультивирования пкМНК с жтММСК этот эффект более выражен.
Получены новые данные, свидетельствующие о том, что при сокультивировании пкМНК и жтММСК происходит изменение профиля продуцируемых хемокинов IL-8, MIP-1b и МСР-1, опосредующих взаимодействие клеток. Показано, что степень этого изменения может зависеть от уровня кислорода в среде культивирования.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты вносят значительный вклад в существующие представления о влиянии факторов микроокружения на гемопоэтические клетки. Было показано, что жтММСК эффективно поддерживают экспансию гемопоэтических предшественников из пкМНК различной степени коммитированности в пределах 1%–20% кислорода. При тканевых концентрациях кислорода среди пкМНК выявлялось больше КОЕ и изменялся их субпопуляционный состав, что приводило к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).
Впервые для исследования роли кислорода во взаимодействии гемопоэтических и стромальных клеток был использован методический подход, основанный на сокультивировании пкМНК и жтММСК. Проведенное исследование позволило продемонстрировать, что использование жтММСК в качестве стромального подслоя и варьирование содержания кислорода в среде культивирования пкМНК могут быть использованы как факторы, модулирующие свойства гемопоэтических клеток, получаемых при экспансии. Заявка на патент №2013112801 от 22.03.2013 «Способ экспансии мононуклеарных клеток пуповинной крови (пкМНК) ex vivo в присутствии мультипотентных стромальных мезенхимальных клеток (ММСК)».
Положения, выносимые на защиту
1. Разработан методический подход, в котором адгезировавшие к жтММСК пкМНК в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяцию предшественников разной степени коммитированности.
2. При пониженном содержании кислорода (1% и 5%) в сокультуре пкМНК и жтММСК увеличивается общее количество КОЕ и изменяется их субпопуляционный состав, приводя к увеличению доли унипотентных (КОЕ-Г и КОЕ-М) и уменьшению доли мульти- и бипотентных (КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ).
Апробация работы
Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на III съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2012), the 7th Fraunhofer Life Science Symposium (Germany, Leipzig, 2012), XI и XII Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной Дню космонавтики (Москва, 2012, 2013), XXII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Волгоград, 2013), XIV Конференции по космической биологии и авиакосмической медицине с международным участием, посвящённой 50-летию создания ИМБП (Москва, 2013).
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК РФ, 1 статья в сборнике «Стволовые клетки и регенеративная медицина», 7 тезисов докладов.
Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр Российской Федерации – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук» 16.10.2013 г.
Связь работы с научными программами
Работа выполнена при поддержке программ ОБН РАН и РФФИ №10-04-01158-а, 13-04-00791.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 126 страницах, содержит 29 рисунков и 10 таблиц. Список литературы состоит из 202 цитируемых источников, из которых 18 - на русском и 184 - на иностранном языке.
