Введение к работе
Актуальность проблемы. Стволовые клетки, обладающие способностью к самообновлению и высоким дифференцировочным потенциалом, заслужили пристальное внимание исследователей в связи с возможным использованием их в терапевтических целях. Мезенхималыше стволовые клетки, входящие в состав стромы костного мозга, главного кроветворного органа в постнатальном периоде онтогенеза, относятся к важным компонентам ниши гемопоэтических клеток, являющихся родоначалышми элементами кроветворения (Фриденштейн и др. 1976, 1980; Чертков и др., 1984, 1998, 2005; Сухих и др., 2002; Паюшина и др., 2004; Fridenshtein et al., 1970, 1987). Несмотря на то, что к настоящему времени и мезенхимальные, и гемопоэтические стволовые клетки достаточно подробно охарактеризованы (Андреева и др., 1999, 2002; Романов и др., 2005; Тепляшин и др., 2005; Трактуев и др., 2006; Owen et al., 1987, 1988; Caplan, 1991; Pittenger et al., 1999; Muraglia et al., 2000; Colter et al., 2000; Prockop et al., 2001; Sekia et al., 2002; Gronthos et al., 2003; Shmelkov et al., 2005; Dominici et al., 2006; Montgomery et al., 2009), исследований, посвященных взаимодействию этих двух типов стволовых клеток, значительно меньше (McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Muguruma et al., 2006; Wagner et al., 2007", 2008). Известно, что комплекс межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий регулируется различными сигнальными молекулами (мембранно-ассоциированными рецепторами, цитокинами, факторами роста) (Пальцев, Иванов, 1995). При нормальном гемопоэзе так же важна непосредственная кооперация гемопоэтических клеток-предшественников с элементами кроветворного микроокружения, межмембранное связывание служит при этом для переноса регуляторной информации, передачи необходимых веществ, миграции, хоминга и представления ростовых факторов в биологически доступной форме (Гольдберг и др., 1999). Следует отметить, что используемые в настоящее время экспериментальные модели дают неполное представление о реальных биологических эффектах от действия сигнальных молекул, поскольку не воспроизводят физиологические особенности происходящих при гемопоэзе процессов. Функциональные и структурные изменения элементов микроокружения под действием различных эндогенных факторов могут быть причиной нарушений кроветворения, однако исследования в этой области немногочисленны. Кроме того, традиционно, культуральные исследования проводят в нормоксических условиях, при 20% Ог, в то время как, например, при эмбриональном развитии человека содержание кислорода в тканях не превышает 3% (Rodesch et al., 1992; Burton, Jaunaiux, 2001), в артериальной крови - 12%, венозной - 5,3%, в гипоталамусе - 1,4-2,1%, в костном мозге -
3-7% (Ishikava, Ito, 1988; Mostafa et al., 2000). Участие мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в создании микроокружения, способного поддерживать рост и развитие гемопоэгических клеток, показано во многих работах (Clausen et al., 2000; Shimakura et al., 2000; Kusadasi et al., 2001; Kadereit et al., 2002; Majumdar et al., 2003; McNiece et al., 2004; Maitra et al., 2004; Mugurama et al., 2006; Wagner et al., 2007, 2008; Walenda et al., 2009). Однако функциональные особенности и тесные клеточные взаимодействия элементов кроветворного микроокружения с учетом парциального давления кислорода во внеклеточном пространстве костного мозга практически не исследованы. Таким образом, несомненный научный и практический интерес представляет не только юучение некоторых аспектов взаимодействия прогениторных клеток различных типов в условиях максимально приближенных in vivo, но и воссоздание гемопоэзиндуцирующей ниши, позволяющей оптимизировать рост и развитие кроветворных стволовых клеток в культуре.
Цель работы: Изучение роли мезенхимальных стволовых клеток костного мозга в создании гемопоэзиндуцирующего микроокружения при совместном культивировании с гемопоэтическими стволовыми клетками человека при различном содержании кислорода.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи исследования:
Изучить влияние пониженного содержания кислорода (1% и 5%) на морфофункциональные особенности культивируемых МСК;
Разработать экспериментальную модель совместного культивирования МСК и ГСК в нормоксии и в условиях пониженного содержания кислорода;
Оценить функциональную активность (способность поддерживать гемопоэз) МСК при сокультивировании с ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;
Изучить колониеобразующую функцию ГСК после совместного культивирования с МСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;
Исследовать иммунофенотип совместно культивируемых МСК с ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода;
Проанализировать продукцию цитокинов в культурах МСК, ГСК и совместно культивируемых МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода.
Научная новизна. Проанализировано влияние пониженного содержания кислорода (1% и 5%) на совокупность морфофункциональных параметров культивируемых МСК костного мозга человека. Впервые показано, что при культивировании МСК костного мозга человека в условиях пониженного содержания кислорода происходит снижение доли клеток, несущих рецепторы адгезии (VCAM-1), на фоне устойчивости основного иммунофенотипа Проведенные сравнительные исследования позволили установить, что при пониженном содержании кислорода на определенных этапах культивирования (96 ч, 5% Ог) МСК костного мозга человека скорость пролиферации возрастает по сравнению с нормоксией и снижается при 1% 02 на всех этапах субкультивирования. Показано, что при культивировании МСК в условиях пониженного содержания кислорода морфология и жизнеспособность клеток не меняется.
Оценено значение МСК костного мозга в регуляции гемопоэзиндуцирующего микроокружения, проявляющееся в межмембранном связывании с гемопоэтическими предшественниками и способности к секреции важных гемопоэтических ростовых факторов. Впервые показано, что в условиях пониженного содержания кислорода культивируемые МСК костного мозга человека способны к поддержанию гемопоэза, что выражается в активации образования очагов кроветворения. Впервые установлено, что при совместном культивировании МСК и ГСК в нормоксии и при пониженном содержании кислорода повышается доля клеток, экспрессирующих VCAM-1 и активируется продукция интерлейкинов (IL-6, IL-8).
Полученные экспериментальные данные расширяют существующие представления о функционировании системы «МСК-ГСК» в нормоксических условиях и при пониженном содержании кислорода.
Научно-практическая значимость работы. Представленные результаты являются важным шагом на пути к пониманию механизмов регуляции гемопоэза при пониженном содержании кислорода in vitro. Предложенная и успешно апробированная экспериментальная модель для изучения процессов экспансии и дифференцировки гемопоэтических предшественников дает возможность не только рассмотреть основные функциональные закономерности кроветворения, но и оценить вклад мезенхимальных стволовых клеток в формирование гемопоэзиндуцирующего микроокружения.
Проведенные сравнительные исследования позволяют рекомендовать использование совместно культивируемых МСК и ГСК при пониженном содержании кислорода, а именно при 5% Ог, как наиболее приближенную к естественным условиям экспериментальную модель гемопоэза.
Положения, выносимые на зашиту:
В условиях пониженного содержания кислорода функциональная активность культивируемых мезенхимальных стволовых клеток, выражающаяся в изменении скорости роста, способности к дифференцировке и продукции цитокинов, модифицировалась, при этом их основные морфологические и фенотипические особенности сохранялись.
Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека способны in vitro к созданию кроветворного микроокружения и поддержанию гемопоэза путем прямых межклеточных контактов с кроветворными элементами и посредством продукции гемопозтических ростовых факторов.
При совместном культивировании мезенхимальных стволовых клеток костного мозга человека и гемопозтических стволовых клеток пуповидной крови человека при 5% содержании кислорода происходит стимуляция гемопоэза, которая проявляется в увеличении числа кроветворных островков.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на V, VI и VII Конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2006-2008); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007); Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008); XII Симпозиуме студентов биологов Европы «SymBioSE'2008» (Коимбра-Авейро, Португалия, 2008); V Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008); XXII Международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 08.12.2009 г.
Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке программы ОБНРАНигос. контракта Роснауки№ 02.552.11.2006.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 151 страницах, иллюстрирован 28 рисунками и 6 таблицами. Список литературы содержит 334 цитируемых источников, из которых 32 на русском и 302 на иностранном языке.
