Введение к работе
Актуальность работы.
Одна из актуальных проблем современной нейрофизиологии — изучение функций глиальных клеток (ГК) в их взаимодействии с нейронами ГК обеспечивают нейроны энергией, поддерживают концентрацию ионов и рН в межклеточной среде, регулируют развитие синаптических связей и проведение нервных импульсов, защищают нейроны от окислительного стресса и т д Однако полностью функции глии, а также нейроглиальные взаимодействия еще недостаточно изучены (Laming et al, 2000, Никколс и соавт, 2003) Между тем, нейроглиальные взаимодействия особенно важны в критические периоды развития и при повреждении нервной системы Исследования последних лет показывают, что нейроны и ГК взаимно поддерживают функционирование и выживание друг друга с помощью межклеточных адгезионных контактов и различных молекулярных сигналов. Такими сигнальными молекулами служат нейротрофические факторы и нейромедиаторы (Barres and Barde, 2000, Thippeswamy et al, 2005, Manesh et al, 2006).
Важнейшим повреждающим фактором для клеток нервной системы является окислительный стресс Он лежит в основе действия ишемии/гипоксии, нейродегенеративных заболеваний, различных физико-химических воздействий и травм (Storz et al., 1999, Chong et al, 2005) Эффективным индуктором окислительного стресса является фотодинамическое (ФД) воздействие. В его основе лежит образование активных форм кислорода (в частности, весьма токсичного синглетного кислорода) при освещении окрашенных клеіок в присутствии кислорода Это вызывает окислительный стресс и клеточную гибель (Dougherty et al., 1998). ФД эффект лежит в основе фотодинамической терапии (ФДТ), применяемой в онкологии, в частности, для разрушения опухолей мозга При этом могут повреждаться здоровые нейроны и ГК, окружающие опухоль. Но если влияние ФД-воздействия на опухолевую ткань подробно изучено (Dougherty et al, 1998, Dolmans et al., 2003, Oleinik et al,
2002), то реакции неповрежденной нервной ткани на ФД-повреждение и роль в них нейроглиальных взаимодействий практически не исследованы Между тем, выяснение механизмов устойчивости здоровой нервной ткани к ФД-воздействию помогло бы оптимизировать его режимы при клиническом применении и разработать способы как усиления ФД-повреждения опухолевых клеток, так и защиты здоровых
В устойчивости нейронов и ПС к фотоокислительному стрессу особую роль играют процессы меж- и внутриклеточной сигнальной трансдукции, которые регулируют процессы функциональной инактивации и смерти нейронов и ГК (Barres and Barde, 2000, Oleinik et al, 2002, Bragm et al, 2003; Uzdensky et al, 2005,). Поэтому изучение клеточно-молекулярных механизмов повреждения и устойчивости нейронов и ГК к фотоокислительному стрессу является важной физиологической задачей
Цель работы: Изучить реакции нейронов и глиальных клеток на фотоокислительный стресс, генерируемый фотодинамическим воздействием и выяснить роль происходящих при этом нейроглиальных взаимодействий, обеспечиваемых нейротрофическими факторами и поверхностными и межклеточными белками, а также изучить роль Са2+-зависимых сигнальных белков и влияния импульсной гиперактивности нейронов на процессы фотодй-намического повреждения нейронов и глиальных клеток
Задачи исследования: 1. Изучить изменения функциональной активности механорецепторных нейронов речного рака, а также процессы смерти нейронов и окружающих глиальных клеток под влиянием фотодинамического воздействия
2 Изучить роль межклеточных и поверхностных белков-мишеней проте-олитических ферментов, обеспечивающих нейроглиальные взаимодействия, нейротрофических факторов (NGF, GDNF и HRGl-pl), а также Са2+-зависимых сигнальных белков (кальмодулина и кальмодулин-зависимой ки-назы II, фосфатидилинозитол- и фосфатидитхолин-специфических изоформ
фосфолипазы С, Са -АТФаз ЭПР) в регуляции устойчивости нейронов и глиальных клеток к фотоиндуцированному некрозу
3. Изучить участие данных сигнальных путей в регуляции устойчивости глиальных клеток к фотоиндуцированному апоптозу.
4 Изучить влияние этих межклеточных и внутриклеточных сигнальных
механизмов на фотоиндуцированное прекращения импульсной активности
механорецепторного нейрона. , , -,
Научная новизна результатов исследования.
Впервые установлена важная роль процессов меж- и внутриклеточной сигнализации в выживаемости нейронов и глии рецептора растяжения рака при фотоокислительном стрессе. Показано, что эти сигнальные механизмы различаются в нейронах и глиальных клетках, а также неодинаковы при фотоокислительном стрессе и смерти клеток при аксотомии и изоляции
Впервые обнаружено влияние нейротрофических факторов на нейроны и ГК ракообразных как в темноте, так и при ФД-воздействии. Продемонстрирована модуляция импульсной активности нейронов нейрегулином HRGl-pi и влияние GDNF и NGF на устойчивость ГК к апоптозу, вызванному аксото-мией или фотоокислительным стрессом
Выявлено участие фосфолипазы С и внеклеточных белков-мишеней протеиназ в фотоиндуцированном апоптозе глиальных клеток Обнаружено, что уровень импульсной активности нейронов влияет на устойчивость сател-литных ГК к проапоптозному действию фотоокислительного стресса
Впервые показано, что фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа II участвуют в ФД-индуцированном некрозе нейронов и глиальных клеток
Показано влияние нейротрофического фактора NGF на фотоиндуциро-ванный некроз глиальных клеток Таким образом, продемонстрировано, что в процессах фотоиндуцированного некроза клеток механорецептора рака участвуют Са2+-зависимые сигнальные белки. Установлено, что в ФД-
индуцированном торможении импульснбй активности механорецепторного
нейрона участвуют белки межклеточного матрикса и фосфолипаза С
Научно-практическая значимость работы. . ' .. ч
Полученные данные 6 фбтодинамич'ескоМ'ПОв^ёйкцений нейронов" и гли-альных клеток могут быть использованы при разработке и'оптимизации способов фотодинамической терапии опухолей мозга.' Данные о фармакологической модуляции сигнальных процессов могут применяться для-разработки методов повышения селективности ФД-воздействия в нейроонкйлогии и экспериментальной нейробиологии, позволяющих усилить фотоиндуцирован-ную смерть перерожденных клеток и защитить нормальные нейроны и ГК Результаты работы использованы при вьшолнении исследований по грантам РФФИ № 02-04-48027 и 05-04-48440, а также в учебном процессе в спецкурсах по фотобиологии и фотомедицине, читаемых на кафедре биофизики и биокибернетики ЮФУ
Основные положения, выносимые на защиту. 1. Реакция нейронов и ГК механорецептора рака на фотодинамическое воздействие регулируется процессами меж- и внутриклеточной сигнализации, различающимися в нейронах и глиальных клетках Фармакологическая модуляция сигнальных процессов может усиливать повреждение клеток или защищать их от фотоокислительного стресса
В обеспечении устойчивости глиальных клеток рецептора растяжения рака к проапоптозному действию фотоокислительного стресса участвуют межклеточные и поверхностные белки-мишени протеиназ, нейротрофические факторы, фосфолипаза С и импульсная активность нейрона
Фосфолипаза С, кальмодулин и кальмодулин-зависимая киназа П снижают устойчивость нейронов и глиальных клеток к некрозу, вызванному фотоокислительным стрессом, a NGF ее повышает.
В процессе функциональной инактивации механорецепторного нейрона при фотодинамическом воздействии участвуют белки внеклеточного матрикса и фосфолипаза С, а также нейрегулин HRG1-P1
Апробация диссертационной работы. Материалы диссертации представлены на всероссийских и международных конференциях. «IV съезд фотобиологов России» (Саратов, 2005), «Биология - наука XXI века». 9-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, 2005), «11th Congress of the European Society for Photobiology» (Aix-Les-Bains, France 2005), «I съезд Физиологов СНГ» (Сочи, 2005), Колосовские чтения, (СпБ, 2006), 2-й Международный Междисциплинарный Конгресс, (Судак, Украина, 2006), «Gha in health and disease» (Cold Spring Harbor Laboratory, USA, 2006), «Simpler Nervous Systems» (Казань, 2006), «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007), «Saratov Fall Meeting» (Саратов, 2007), «12th Congress European Society for photobiology» (London, England, 2007).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ. Личный вклад автора в опубликованном материале в среднем 50%, объем 2,5 п л
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 192 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав (обзор литературы, методика, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 272 отечественных и зарубежных источника Работа иллюстрирована 51 рисунком и 11 таблицами МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
