Введение к работе
Актуальность проблемы. Сочетание методов ірансплаї нации эмбрионов, полученных in vitro, криоконсервации гамет и зародышей позволит значительно интенсифицировать селекционный процесс, увеличить число потомков от высокопродуктивных животных, а также от коров, с заболеваниями репродуктивных органов, нарушением гормонального фона и т.д. Технологии трансгенсза и клонирования дают возможность получать особи, резистентные к различным заболеваниям, способные производить биологически активные вещества, используемые в фармакологии, биомедицинских целях. Базовый метод всех этих эмбриотехнологий -получение зрелых яйцеклеток, пригодных к дальнейшему оплодотворению, получению трансгенных, клонированных животных. В связи с этим, начальный этап технологий (дозревание ооцитов in vitro) приобретает особую актуальность. Состав сред для дозревания, используемых различными исследователями неодинаков по своему составу, а интенсификация технологии и необходимость стабильности результатов требует их стандартизации. Ранее показано, что введение в среду созревания ооцитов рекомбинантного бычьего соматотропина (СТГ) совместно с сывороткой и клетками гранулезы или без них при дальнейшем оплодотворении способствует повышению выхода эмбрионов на стадии бластоцисти (Kirzmina Т. I. et al., 2007, Bevers M.M. and Izadyar F, 2002 ). Обнаружено также, что использование бычьего пролактина (ПРЛ) в качестве добавки при созревании ооцитов обеспечивает возрастание числа эмбрионов на завершающих стадиях доимплантационного развития (Kanitz W. et а!., 1996, Torner Н. et al.,1996). Созревание ооцита in vivo - результат сложных межклеточных взаимодействий гаметы и соматических клеток овариального фолликула, в первую очередь, клеток гранулезы (КГ), являющихся продуцентом многих факторов, обеспечивающих нормальное развитие растущего ооцита.
В связи с этим, представляет интерес исследование роли гранулезных клеток при действии пролактина или соматотропина на формирование зрелой яйцеклетки, а также изучение возможности моделирования на этой основе системы дозревания ооцитов с целью повышения эффективности клеточных технологий репродукции.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с программой фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2006-2010 годы по теме: 06.01.03 « Исследовать молекулярно-генетические, биохимические, цитологические и эмбриологические процессы, лежащие в основе трансгенеза, создать генноинженерные конструкции и разработать способы, повышающие эффективность биоинженерных технологий получения животных с заданными свойствами» № гос. регистрации: 15070.7815014664.06.8.001.0.
Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - исследование роли клеток гранулезы из антральных овариальных фолликулов при
мейотическом созревании ооцитов in vitro в присутствии пролактина или соматотропина.
В соответствии с поставленной целью решались следующие конкретные задачи:
-
Исследовать действие пролактина и соматотропина, опосредованное клетками гранулезы, на мейоз ооцитов коров in vitro;
-
Оценить способность к развитию доимплантационных эмбрионов, полученных из ооцитов, созревших в присутствии пролактина и клеток гранулезы in vitro;
3.Охарактеризовать влияние пролактина и соматотропина на морфофункциональное состояние клеток гранулезы коров из овариальных антральных фолликулов диаметром 3-5 мм при их культивировании с учетом:
-жизнеспособности клеток гранулезы (окрашивание прижизненным красителем);
- состояния хроматина гранулезных клеток (уровни дегенерации и пролиферации);
-стероидогенной активности клеток.
4. Проанализировать эффекты пролактина и соматотропина на клетки кумулюса ооцитов коров, созревших в средах, кондиционированных клетками гранулезы в присутствии пролактина или соматотропина.
Научная новизна. Впервые получены следующие данные:
- определена и охарактеризована роль клеток гранулезы из антральных
фолликулов (диаметр 3-5 мм) в реализации действия ПРЛ и СТГ на
завершение мейоза ооцитов коров in vitro, его динамику и способность к
развитию доимплантационных зародышей;
обнаружено, что ингибирующее действие СТГ и ПРЛ на процессы дегенерации КГ при их культивировании, не связано с их стероидогенной активностью;
выявлено, что КГ, не связанные с ооцитами щелевыми контактами, опосредуют ингибирующее действие ПРЛ и СТГ на реинициапию мейоза ооцитов. Тормозящее действие СТГ и ПРЛ на динамику мейоза является обратимым;
обнаружено, что среда, кондиционированная ГК в присутствии СТГ или ПРЛ, оказывает ингибирующее влияние на дегенерацию хроматина в оонитах и окружающих его кумулюсных клетках in vitro;
показано, что в ооцитах коров, созревших в средах, кондиционированных КГ в присутствии ПРЛ или СТГ, снижается уровень кальция во внутриклеточных депо.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе использования модели экстракорпорального дозревания ооцитов обоснована гипотеза об участии клеток гранулезы в формировании зрелой яйцеклетки in vitro при созревании ооцитов коров с пролактином или соматотропином в следующей формулировке - клетки гранулезы из антральных овариальных фолликулов (диаметр 3-5 мм), не связанные с ооцитом щелевыми
контактами, опосредуют действие нролактина и соматотропина на завершение мейотического дозревания яйцеклетки in vitro. Анализ контролируемых параметров мсйоза, выявил положительные эффекты соматотропина и пролактина в присутствии КГ на уровень дегенерации хромосом (снижение) и цитоплазматическое созревание яйцеклетки. Обнаруженное тормозящее влияние СТГ и ПРЛ на реинициацию мейоза ооцитов является обратимым, и не наблюдается при дальнейшем культивировании. Пролонгация дозревания предполагает возможность синхронизации ядерно-цитоплазматического созревания ооцита, что обеспечивает в дальнейшем приобретение яйцеклеткой способности к дальнейшему развитию. При этом повышался процент выхода нормальных эмбрионов, преодолевших блок развития на стадиях 8-16 клеток. Снижение уровня дегенерации хроматина в клетках гранулезы и кумулюса (субпопуляция КГ) под действием ПРЛ или СТГ не было связано с их стероидогенезом (содержанием прогестерона и эстрадиола). Результаты исследования позволяют предположить, что ПРЛ и СТГ влияют на продукцию КГ паракринно действующих факторов, участвующих в регуляции мсйоза. С учетом данных исследований для увеличения выхода зрелых яйцеклеток и нормальных эмбрионов коров in vitro предложена система дозревания ооцитов с использованием КГ (I06 кл/мл), пролактина (50 нг/мл) или соматотропина (10 нг/мл).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены и одобрены на ежегодных аспирантских сессиях и отчетах ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии, на Международных конференциях: 50-й ежегодной конференции Европейской Ассоциации по репродукции в животноводстве, Цюрих, 1999; «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» Боровск, 2000; 54-й ежегодной конференции Европейской ассоциации животноводства, Италия, 2003; на 11-ом международном конгрессе по биотехнологии в репродукции с/х животных, Чехия, сентябрь 2004; «Клеточное ядро» Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 2007.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 нучных работ, в том числе - 6 в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России.
Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследований, их обсуждения, выводов, предложений, списка использованной при написании диссертации литературы, включающего 265 источников, в том числе 235 на иностранном языке. Диссертация изложена на 136 страницах, включает 7 таблиц, 32 рисунка (в том числе 12 микрофотографий).
