Содержание к диссертации
Введение
1. ЛИТЕРАТУРНАЯ ЧАСТЬ
1.1. Химические сощинения-радиопротекторы и антимутагены 10
1.2. Потешмальные изменения хромосом и реализация му-тагешого поражения в структурные мутацш 32
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материал и методы исследования 51
2.2. Действие радиопротектора цйстамина на структурные мутации хромосом
2.2.1. Естественно возникшие перестройки хромосом 53
2.2.2. Перестройки хромосом, вызванные облучением сухих семян 56
2.2.2.1. Влияние цистамина в момент облучения 56
2.2.2.2. Влияние цистамина в период пострадиационного проращивания семян 57
2 2.3 Перестройки хромосом, вызванные облучением предсинтетической фазы клеточного цикла клеток замоченных- семян 58
2.2.4. Влияние цистамина яа структурные мутации хромосом, вызванные облучением в постсинтетической { Ctz ) фазе клеточного цикла 59
2.3. Волновая кинетика радиационного мутагенеза в условиях действия радиопротектора цйстамина
2.3.1. Обработка цистамияом в момент облучения 64
2.3.2. Обработка цистамином после облучения в течение всего клеточного цикла 71
2.4. Явление надутости кольцевых хромосом в условиях действия радиопротектора цйстамина
2.4.1, Влияние цистамина яа частоту надетых колец,выз-ванных облучением предсинтетической фазы v G- I клеток сухих семян 78
2.4.2, Модификация типов надетых колец 79
3. ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫШХ РЕЗУЛЬТАТОВ 83
4. ВЫВОДЫ 97
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 99
- Химические сощинения-радиопротекторы и антимутагены
- Действие радиопротектора цйстамина на структурные мутации хромосом
- ОБСУЖДЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЫШХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Химические сощинения-радиопротекторы и антимутагены
В связи с загрязнением окружающей среды мутагенными факторами проблема защиты наследственности живых организмов приобретает все большую актуальность. Вопрос о мутагенах среды выдвигается в качестве крупнейшей проблемы, работа над которой насущно необходима для : современного и будущего человечества ( Дубинин, Пашин, 1979). Загрязнение среды мутагенами увеличивает число пораженных генов, объем генетического груза возрастает и соответственно в будущих поколениях возрастает доля людей с наследственными болезнями и новыми предрасположениями к болезням экзогенного происхождения. Если загрязнение среды не будет контролироваться, то в условиях научно-технического прогресса мы можем оказаться не только перед экологической, но и перед генетической катастрофой. Нынешнее поколение людей является свидетелем бурного развития атомной энергетики. Если в первой четверти нынепшего столетия во всем мире было всего лишь несколько сот граммов радия, то в настоящее время производится такое количество радиоактивных веществ, которое эквивалентно сотням тысяч тонн радия С Дубинин, Пашин,1978).
Всем организмам ,.:, свойственны репарационные системы, в функцию которых входит защита генетического аппарата от повреждающих действий различных мутагенов. Однако живые организмы отличаются друг от друга по стабильности генетического аппарата к мутагенным факторам В поисках защиты от лучевого поражения живых организмов еще в 40-х годах начали испытывать химические вещества. Впервые защита была получена в 1943 году при введении в организм мышей гормона эстрадиола до облучения. В дальнейшем радиозащитные соединения были обнаружены в различных классах химических веществ, из которых более перспективными оказались аминтиолы и их производные ( Бак, 1968; Мозжухин, Рачинский,. 1979).
Исследование этой проблемы показало, что защитными свойствами обладают многие химические вещества (Gebhart , 1974):
среди которых обнаружены вещества, повышающие устойчивость организма к радиации- радиопротекторы ( Яшуяский,1975; Суворов, Шашков, 1975; Мозжухин, Рачинский, 1979). Установлено, что при определенных условиях некоторые препараты обеспечивают 100$ выживаемости животных в опытных группах при 100$ гибели в контрольных группах ( Мозжухин, Рачинский, 1979; Стрелков, 1967; Саксонов и др., 1968; Бак, 1968; Ярмояеяко, 1969).
Известно, что химический протектор цистамия является высокоэффективным в защите от лучевого поражения на уровне целого организма ( Граевский и др., 1963; Лукашин, Джаракьян,1972; Мозжухин, Павлова, 1972; Гугушвили и др., 1972; Померанцева, 1982). В 1951 году известный бельгийский фармаколог Бак З.М. со своими сотрудниками установил, что декарбоксилированный цистеин (,цис-теамин, бекаптан, - меркаптоэтиламин, МЕА) и его дисульфид (цистамин, дисульфиде- меркаптоэтиламина) обладают выраженным защитным эффектом как при парентеральном, так и при эятераль-ном путях введения.
Действие радиопротектора цйстамина на структурные мутации хромосом
В опытах использованы семена СґеріЬ capillar iS ( L )ША, как удобный объект для точного цитогенетического изучения структурных мутаций хромосом в метафазе митоза ( Немцева, 1970; Дубинина, 1978). Облучение семян производили гамма-излучением Cs на установке ГЛІ0С Института общей генетики АН СССР. Проращивали семена на фильтровальной бумаге в чашках Петри в термостате при там-пературе +26С, в темноте. Раствор радиопротектора цистамина применяли в концентрации 0,1$. Раствор колхицина в концентрации 0,01$ применяли для блокирования цензфов митотического деления клеток , чтобы получить удобное для изучения расположение хромосом. Растворы изготавливали на дистиллированной воде. Фиксировали проростки длиной 0,5-1,5 мм в смеси этилового спирта с ледяной уксусной кислотой (3:1) и в фиксаторе Ныокомера (, изопропиловый спирт-6 частей, пропионовая кислота-3 части, ацетон- I часть, петролейний эфир-I часть и диоксан-I часть).
Специальные вопросы по методике проведенных опытов включены в соответствующие разделы Экспериментальной части.
Структурные мутации хромосом анализировали метафазным методом учета перестроек хромосом (Немцева,1970), Учитывали хромосомные перестройки: асимметричные и симметричные транслокации, кольца,микрофрагменты, инверсии, концевые делеции,и хроматидные перестройки: асимметричные и симметричные хроматидные транслокации, хроматидные инверсии, простые концевые делеции, изохроматид-ные делеции UpitlpftM ,Zl/f !lo MLLpd , хроматидные кольца, трирадиалы.
Сестринские хроматидные обмены были изучены нами с помощью модели надетых кольцевых хромосом в клетках,облученных ионизируицей радиацией в фазе Сг. клеточного цикла. Данная модель позволяет цитологически регистрировать оба направления в соединении фрагментов - с симметричным обменом и в исходном положении. Преобразование надетости путем разных вариантов выскальзывания внутренних линейных структур из колец сопровождается последующим замыканием разрезанных колец или в новом положении с обменом,который приводит к объединению пары колец в единое кольцо удвоенного размера, или в исходном положении, с восстановлением первоначальных двух сестринских колец, цитологическая модель надетого кольца применена нами для изучения процессов восстановления поврежденной структуры хромосомы под влиянием цистамина.
При математической обработке результатов опытов использовались стандартными методами. Определяли частоту клеток с перестройками хромосом С %), частоту перестроек (, число перестроек на сто изученных клеток) и долю перестроек каждого типа в оощем составе перестроек. В процент клеток с перестройками включены и клетки с неразобранными перестройками, идентифицировать которые не удалось из-за сложности или из-за плохого расположения хромосом. Исходя из количества точно идентифицированных перестроек, определяли частоту перестроек.
Обсуждение эксперименталышх результатов
Результаты проведенных нами опытов на клетках семян и проростков Ovejpts capVLW\s » в которых изучено влияние радиопротектора цистамина на структурные мутации хромосом, показали высокую эффективность этого соединения при облучении гамма-излучением. Таким образом, в нашей работе подтверждено, что цистамин является высокоэффективным радиопротектором от повреждения ионизирукщей радиацией (Baccj, Alexander » 1955, 1964; Граевский и др.1963; Бак, Александер, 1963; Бак, 1968; Лукашин, Джаракьян, 1972, Моз -жухин, Павлова, 1972; Гугушвили и др., 1972; Богатырев и др.,1972; Голубенцев, Титов,. 1973;, что было установлено до начала нашей работы. В наших опытах цистамин вызывал наиболее эффективное понижение частоты индуцированных структурных мутаций хромосом в два и даже более раза { табл.2.2.2.2.1; 2.2.3.1; 2.2.4.1; 2.3.2.1;.При постоянном проращивании семян в растворе цистамина это касалось как хромосомных, так и хроматидных мутаций.
При естественном мутационном процессе цистамин также пони -жал частоту структурных мутаций в два раза табл.2.2.I.I; 2.2.1.2; 2.2.1.3). Постоянное проращивание семян в растворе цистамина приводило к понижению частоты структурных мутаций в два раза как при низком, так и при высоком уровне естественного матирования, который достигал в семенах 10-летнего возраста 19,1 перестройки на сто изученных клеток { табл. 2.2.1.3).
Одинаково эффективное понижающее действие цистамина на естественно возникшие перестройки хромосом, как и на индуцированные, позволяет сделать заключение о неспецифическом влиянии этого радиопротектора на структурные мутации хромосом и предполагать, что механизм его радиопротекторного эффекта связан не с радио -84 биологическими процессами, а с процессами матирования. Тшсим образом, цистамин можно считать высокоэффективным антимутагеном.
Сравнительная оценка эффекта цистамина при обработке семян в момент облучения и при пострадиационной обработке в период проращивания показывает, что цистамин неэффективен в момент облучения ( таол.2.2.2.1.1) и высокоэффективен в пострадиационный период ( табл.2.2.2.1; 2.2.3.1 ). Это свидетельствует, что, по-видимому, вопреки радиобиологическим представлениям о радиопротекторном действии цистамина на первичные радиационные процессы, вызванные облучением, или на первичное повреждение наследственных структур ( см.Литературную часть гл.1,стр. 15-18), цистамин как антимутаген оказывает защиту от мутагенного поражения при реализации мутагенного повреждения в структурные мутации хромосом. Подтверждением служат результаты, полученные в опытах с волновой кинетикой радиационного мутагенез а. Обработка цистамином в момент облучения не оказала существенного влияния на волновой выход структурных мутаций,- небольшое понижение частоты мутаций цистамин вызывал лишь в точках максимзгмов ( рис.1) В то же время действие цистамина в период проращивания семян, хранившихся после облучения разные сроки, оказыва -лось высокоэффективным, - как в точках максимумов, так и почти во всех точках минимумов частота структурных мутаций была понижена в два раза ( рис.2).
Приблизительно одинаково эффективное влияние цистамина на минимумы волновой кинетики, как и на максимумы, указывает, что механизм его действия связан не с начальными С пусковыми ) процессами реализации потенциальных изменений в мутации, а с какими-то внутренними процессами самого становления структурных му -85 таций. Если начальным { пусковым) генетическим процессом реализации потенциальных изменений в мутации служит репарация повреждений ДНК, или первым критическим моментом превращения первичного поражения в структурную мутацию { Немцева, Романов, 1980), и изменение интенсивности ее инициации проявляется в волновом выходе индуцированных структурных мутаций по срокам хранения облученных гамма-излучением семян, то одинаково эффективное понижение частоты структурных мутаций в максимумах и минимумах свидетельствует о влиянии цистамина или вообще не на репарацию иди по крайней мере не на те ферменты репарации, которые обеспечивают инициацию процесса, а на ферменты, связанные с её дальнейшими прохождением или завершением.
