Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 5
1. ВВЕДЕНИЕ 6
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
2.1. Базовые элементы эукариотических промоторов 8
2.2. Проксимальные и дистальные регуляторные элементы эукариотических генов 9
2.2.1. CpG островки 9
2.2.2. UAS/URS элементы 10
2.2.3. Энхансеры 11
2.3. Регуляторные элементы ДНК, влияющие на экспрессию гена 13
2.3.1. Пограничные последовательности 13
2.3.2. Регуляторные области локусов (LCR) 15
2.3.3. Инсуляторы 18
Su(Hw)-HHcynflTop 20
Инсуляторы регуляторной области Abd-B гена 21
р-глобиновый инсулятор 24
2.4. Модели влияния инсуляторов на взаимодействие между энхансером и промотором ...25
2.5. Примеры взаимодействия энхансера и промотора на расстоянии 27
2.5.1. Трансвекция 27
2.5.2. Кооперативное действие цис-регуляторных элементов. GAGA-фактор 31
2.5.3. Цис-регуляторные элементы в сложных локусах генов 32
2.6. Исследование взаимодействия хроматина на больших дистанциях... 35
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 41
3.1. Генетические методы 41
3.1.1. Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные в данной работе...41
3.1.2. Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий 42
3.1.3. Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях 42
3.1.4. Генетические скрещивания 44
3.2. Программное обеспечение. Базы данных 44
3.3. Биохимические методы 45
3.3.1. Выделение ДНК из дрозофилы 45
3.3.2. Саузерн-блотанализ 45
3.3.3. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) 46
3.3.4. Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов 48
3.3.5. Молекулярное клонирование 48
3.3.6. Трансформация бактериальных клеток плазмидами 49
3.3.7. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса 49
3.3.8. Создание конструкций 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ 57
4.1.1. Анализ нуклеотидной последовательности 5* регуляторной области гена yellow Drosophila melanogaster 57
4.1.2. Анализ цис-регуляторных элементов в области промотора гена yellow 62
4.1.3. Роль регуляторных элементов промоторной области гена.уе11ом> в присутствии промотора гена white... 68
4.2.1. Анализ нуклеотидной последовательности 5' регуляторной области гена white Drosophila melanogaster 73
4.2.2. Значение белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite Drosophila melanogaster зависит от расстояния между регуляторными элементами 75
4.2.3. Роль белка Zeste во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite при делении в регуляторной области гена 81
4.2.4. Su(Hw) инсуляторов недостаточно для осуществления взаимодействия между энхансером и промотором гена miniwhite при делении в регуляторной области гена 83
4.2.4. Роль цис-регуляторных элементов во взаимодействии между энхансером и промотором гена miniwhite 85
5.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 90
5.1. Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена yellow , 90
5.2. Изучение взаимодействия между энхансером и промотором в модельной системе гена white 92
6. ВЫВОДЫ 95
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96
Введение к работе
Координированная работа (экспрессия) большого числа генов у эукариот возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов. Для того чтобы экспрессия гена была регулируемой, он должен содержать индивидуальные последовательности ДНК, по которым компоненты генетической системы клетки могли бы безошибочно оказать на него необходимое воздействие. Благодаря факторам транскрипции и регуляторным последовательностям генов становится возможным специфический синтез РНК и осуществляется регуляция экспрессии генов на уровне транскрипции (Levine et al., 2003; Butler et al., 2002). Цис-регуляторные элементы генов эукариот - это последовательности ДНК, расположенные вблизи промотора (от 30 до нескольких сотен пар оснований перед точкой инициации), а также дистальные элементы (энхансеры и сайленсеры). Оба класса таких последовательностей содержат сайты связывания белков, модулирующих транскрипцию (Cosma, 2002; Патрушев, 2000). Одной из особенностей регуляции транскрипции высших эукариот является способность энхансеров активировать транскрипцию гена независимо от ориентации, и находясь от промотора на расстоянии, которое может достигать нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (Dorsett, 1999). Многие энхансеры не имеют специфичности к определенному промотору и способны активировать транскрипцию целого ряда генов (Butler et al., 2001). Так как в геноме гены располагаются часто достаточно близко друг к другу, возникает вопрос, каким образом энхансер взаимодействует с промотором своего гена и как предотвращается активация нежелательных промоторов, которые могут находиться в непосредственной близости от энхансера. Несмотря на большое количество информации о различных уровнях регуляции транскрипции, механизм взаимодействия между энхансером и промотором на больших дистанциях остается до конца невыясненным.
Известно, что в ряде случаев в обеспечении коммуникации между энхансером и промотором важную роль играют цис-регуляторные последовательности ДНК, найденные в промоторных областях эукариотических генов (Hapgood et al., 2001). Характеристика таких цис-регуляторных последовательностей и связывающихся с ними белковых факторов поможет лучше понять механизм энхансер-зависимой тканеспецифичной активации генов.
В данной работе была поставлена задача картировать и изучить цис-регуляторные последователыюсти ДНК промоторных областей генов yellow и miniwhite Drosophila melanogaster, которые могут отвечать за взаимодействие с энхансерами.
