Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
I. Аппарат транскрипции у эукариот. 7
1. Промоторы генов класса II 7
TATA-БОКС 8
ИНИЦИАТОР 9
DPE 10
BRE 10
-
РНК-полимераза II 11
-
Транскрипционные факторы 12
ТВР 12
TFIID 13
TFIIB 14
TFIIF 15
TFIIH 15
TFIIE 16
TFIIA 16
МЕДИАТОР 17
4. Представления об инициации транскрипции iv vivo 18
П. Хроматин. Модификация хроматина гистонацетилтрансферазами ...23
1, GNAT суперсемейство 24
Hatl,Elp3,Hpa2,Nutl." 25
GCN5 и его гомологи 26
уНАТ-А2 комплекс 27
ADA-комплекс 28
SAGA-комплекс 29
TFTC 30
2. MYST-семейство 30
SAS2 и SAS3 (YBF2) 31
NuA3-комплекс 32
ESA1 32
NuA4 * 32
MOF 33
ТірбО 34
MOZhMORF 34
HBOl 35
3.P300/CBP семейство 35
4, Основные факторы транскрипции , обладающие HAT активностью 36
TAF1 36
5. Гистонацетилтрансферазы, родственные гормонам... 37
SRC1 37
ACTR(SRC3) 37
III. Гены теплового шока как модельная система 39
-
Строение промотора '. 40
-
Факторы теплового шока 40
3.Транскрипция генов теплового шока на примере гена hsp70 . 42
-
Реинициация транскрипции 44
-
Гранулы теплового шока *. 45
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47
I. Объект и задачи исследования 47
II. Материалы и методы. 48
-
Реактивы 48
-
Антитела 48
-
Работа с дрозофилами 48
-
Выделение геномной ДНК 49
-
ПЦР в реальном времени 49
-
Хроматин-иммунопреципитация (Х-СЫР) 50
-
Выделение РНК и Нозерн-блот анализ 51
-
Иммунопреципитация ; 51
-
Хроматографическая очистка и Вестерн блот анализ 52
10. Иммуноокрашивание политенных хромосом 52
III. Результаты 54
1. Анализ экспрессии генов айа2а и ada2by D. melanogaster. 54
Нозерн-блот анализ полиА-РНК на разных стадиях развития дрозофилы 54
Вестерн-блот анализ 54
2. Анализ комплексов, в состав которых входят dADA2a и dADA2b 55
Имунопреципитация,, 55
Хроматографическая очистка 57
Иммуноокрашивание политенных хромосом 59
3. Исследование участия общих транскрипционных факторов и GCN5-HAT содержащих
комплексов в активации транскрипции на модели гена hsp70 in vivo 59
Иммуноокрашивание политенных хромосом D. melanogaster дикого типа 60
Иммуноокрашивание политенных хромосом трансгенной линии D. melanogaster 64
Хроматин-иммунопреципитация 65
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 67
ВЫВОДЫ 71
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 72
Введение к работе
Активация транскрипции у эукариот - многоступенчатый процесс со сложной координированной регуляцией. Для обеспечения доступности специфических геномных локусов для РНК полимеразы II (RNAPII) в контексте хроматина необходимо взаимодействие основных факторов транскрипции, геноспецифических активаторов и различных кофакторов транскрипции.
Изучение механизма взаимодействия основных компонентов транскрипционного аппарата в процессе экспрессии того или иного геномного локуса является одной из наиболее интересных областей современных исследований в области регуляции транскрипции. В настоящее время установлено, что для инициации транскрипции необходимы так называемые общие факторы транскрипции - комплексы, обладающие постоянным белковым составом и участвующие в транскрипции основной части генов. В частности, в области промотора собирается большой преинициаторный комплекс, в свою очередь состоящий из нескольких мультибелковых комплексов, основным из которых является комплекс TFIID, содержащий в своем составе белок ТВР и ассоциированные с ним белки ТАР (ТВР associated factors). Кроме TFIID в состав преинициаторного комплекса входят: белок TFIIB, необходимый для фиксации TFIID на старте транскрипции; комплекс TFIIF, обеспечивающий вхождение RNAPII в преинициаторный комплекс; комплекс TFHH, обладающий АТФ-азной активностью и гиперфосфорилирующий CTD RNAPII при переходе ее от инициации к элонгации; комплексы TFIIE и TFIIA, стимулирующие сборку преинициаторного комплекса, а также комплекс Медиатор, необходимый для активированной транскрипции.
В активации транскрипции на хроматиновой матрице не менее важную роль играют комплексы, участвующие в посттрансляционной модификации гистонов. Одна из наиболее хорошо изученных модификаций - ацетилирование высококонсервативных N-концов гистонов гистоацетилтрансферазами (HAT). Ацетилирование изменяет высокоорганизованные фибриллы хроматина и таким образом увеличивает афинность транскрипционных факторов к ДНК. Многочисленные исследования выявили прямую связь между ацетнлированием гистонов и активацией транскрипции. Таким образом, исследование белков и комплексов, обладающих HAT активностью, имеет большое значения для понимания процессов, проходящих при активации транскрипции у эукариот. Jb Одним из наиболее хорошо изученных комплексов, является SAGA комплекс дрожжей, содержащий в своем составе GCN5 гистонацетилтрансферазу (GCN5 HAT), Ada белки, Spt белки, а также некоторые из белков ТАР, которые, как было указано выше, одновременно являются компонентами основного преинициаторного комплекса TFIID. Гомологи GCN5 HAT были найдены у дрозофилы и человека. Комплекс, содержащий GCN5 HAT (TFTC) был охарактеризован у человека, однако у дрозофилы, аналогичный комплекс обнаружен не был.
4$І Настоящая работа посвящена исследованию HAT комплекса Drosophila melanogaster и изучению взаимодействия общих факторов транскрипции РНК- полимеразы II, в активации экспрессии локуса Hsp 70.
