Содержание к диссертации
Введение. 4
1. Обзор литературы. 7
-
Общие вопросы регуляции экспрессии генов эукариот. 7
-
Определение и общие свойства инсуляторов. 8
-
Структура и функции инсуляторов. 9
-
Инсулятор Su(Hw). 10
-
Инсуляторы локуса теплового шока hsp70 - scs и scs'. 17
-
Инсуляторы регуляторной области гена Abd-B. 19
-
Инсулятор Fab-7. 22
-
Куриный Р-глобиновый инсулятор. 25
1.4 Модели действия инсуляторов. 26
-
Структурные модели. 28
-
Транскрипционные модели. 31
2. Материалы и методы. 34
2.1 Генетические методы. 34
-
Линии и мутации Drosophila melanogaster, использованные при генетических скрещиваниях в работе. 34
-
Трансформация эмбрионов Drosophila melanogaster и получение трансгенных линий. 35
-
Фенотипический анализ экспрессии генов yellow и miniwhite в трансгенных линиях. 35
-
Генетические скрещивания. 37 2.2. Биохимические методы. 39
-
Выделение ДНК из дрозофилы. 3 9
-
Саузерн-блот-анализ. 40
-
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). 40
-
Секвенирование плазмид и ПЦР продуктов. 41
-
Молекулярное клонирование. 42
-
Трансформация бактериальных клеток плазмидами. 42
-
Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса. 43
-
Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля. 43
-
Создание конструкций. 44
3. Результаты. 49
-
Фрагмент Fab-7 , в отличие от фрагмента Fab-7 , обладает свойствами PRE. 49
-
Создание нового метода делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. 52
-
Фрагменты Fab-71103 блокируют взаимодействие между энхансером и промотором и функционально взаимодействуют между собой. 59
-
Элементы PRE не влияют на функциональное взаимодействие инсуляторов Fab-7. 62
-
Фрагменты Fab-7858 блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, функционально взаимодействуют между собой, не обладают полярностью и их инсуляторные свойства зависят от положения в конструкции. 64
-
Фрагмент Fab-7909 способен защитить промотор от негативного действия PRE. 69
-
Идентификация минимального элемента в Fab-7 инсуляторе, который блокирует активность PRE. 72
4. Обсуждение. 74
-
Новая система делеции заданной последовательности в трансгенных линиях Drosophila melanogaster. Перспективы применения для решения различных задач современной биологии. 74
-
Новые свойства и возможный механизм действия регуляторных элементов гена Abd-B. 76
Выводы. 79
Список литературы. 80
Введение к работе
Основными регуляторами активности гена эукариотической клетки являются энхансеры и саиленсеры, которые могут располагаться на больших расстояниях от регулируемого ими гена. Инсуляторы способны ограничивать их влияние и разделять геном эукариот на функциональные домены, содержащие один или несколько генов. Поэтому существенный научный интерес представляет изучение механизмов действия инсуляторов, энхансеров и сайленсеров на молекулярном уровне. Однако, несмотря на многочисленность научных исследований в этой области, существует несколько альтернативных моделей, объясняющих эти процессы.
Энхансерами принято называть последовательности ДНК, которые способны активировать транскрипцию независимо от ориентации и расстояния до точки начала транскрипции. Обнаружение этого класса регуляторных элементов поставило вопрос о том, каким образом клетка ограничивает действие этих регуляторных элементов только определенным набором промоторов, специфическим для различных тканей и периодов жизненного цикла клетки. Как показали эксперименты на трансгенных организмах и линиях трансгенных клеток (далее - трансгенах), лишь небольшая часть энхансеров имеет специфичность к определенным промоторам (Butler and Kadonaga 2001, Smale 2001), тогда как большинство из них могут активировать экспрессию широкого спектра генов. Было предположено, что геном эукариотической клетки организован в функциональные домены. Эта гипотеза предсказала существование граничных элементов, которые не позволяют энхансерам активировать «чужие» промоторы. Такие элементы были найдены и получили название инсуляторы. Инсуляторы способны нарушать взаимодействие между энхансером и промотором, но только в том случае, если находятся между ними. Примером таких инсуляторов является Su(Hw). В то же время не все подобные регуляторные элементы обладают столь очевидными свойствами.
Гомеозисный ген Abd-B участвует в образовании парасегментов дрозофилы (Mihaly et al. 1998). Его регуляторная область размером примерно 50 т.п.н. находится на 3' конце гена и состоит из отдельных регуляторных доменов, каждый из них содержит один энхансер и регулирует экспрессию Abd-B гена только в одном из парасегментов дрозофилы. Предполагается, что инсуляторы окружают каждый энхансер и образуют ряд независимых регуляторных доменов. Например, один из таких доменов окружен инсуляторами Fab-7 и Fab-8. Исходя из определения инсулятора, трудно объяснить каким образом энхансер, окруженный двумя инсуляторами, может активировать транскрипцию гена Abd-B. Следовательно, элемент Fab-7, хоть и проявляет инсуляторные свойства в экспериментах на трансгенах (Hagstrom et al. 1996), имеет более сложную структуру и функции.
Целью настоящей работы было изучение необычных свойств и структуры регуляторного элемента Fab-7. Используя молекулярный анализ мутаций этого элемента и поиск сайтов связывания известных белков с его последовательностью, мы предположили структуру элемента Fab-7 и, используя трансгенных мух, изучили их функции.
Одной из самых больших проблем при исследованиях на трансгенах является эффект положения. Эффект положения генетической конструкции в геноме приводит к тому, что экспрессия генов одной и той же генетической конструкции может существенно различаться у разных трансгенных линий. Причиной этого служит влияние регуляторных элементов, окружающих точку встраивания конструкции в геном.
Следовательно, при исследовании, например, взаимодействия между регуляторними элементами необходимо иметь возможность удалять каждый из этих элементов из генетических конструкций. Для этого используют Cre/loxP и Flp/frt рекомбиназные системы, которые позволяют удалять части конструкций из генома трансгенных мух. Однако, для проведения многих современных исследований, двух этих систем недостаточно. Например, для исследования взаимодействий между инсуляторами, требуется "вырезать" все инсуляторы (не менее двух) и энхансеры маркерных генов конструкции. Следовательно, создание новых систем для in-vivo редактирования последовательностей генетических конструкций позволит облегчить исследования сложных регуляторных систем, например инсуляторов регуляторной области гена Abd-B.
Нами была создана новая система на основе эндонуклеазы I-Scel, которая, наряду с ранее описанными Cre/loxP- и Flp/frt- системами, может быть использована для вырезания части конструкции из трансгенных мух. Наши результаты свидетельствуют о том, что и другие редкощепящие эндонуклеазы также могут быть использованы для этой цели, что открывает возможность создания множества подобных систем.
