Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на изучение явления энзиматического метилирования ДНК эукариот в течение шестидесяти лет, мы ещё далеки от полного понимания функциональной роли этой модификации генома. В клетках эукариотических организмов метилирование ДНК участвует в регуляции генетической экспрессии, клеточной дифференцировки и морфогенеза, эпигенетическом контроле геномного импринтинга и инактивации мобильных генетических элементов. Эти функции установлены как у млекопитающих, так и у высших растений. Нарушение нормальной картины метилирования ДНК сопровождает канцерогенез и генетические заболевания человека. В настоящее время установлено, что большинство своих функций метилирование ДНК осуществляет в качестве интегральной части механизма модификации и ремоделирования структуры хроматина. В этом процессе участвуют многочисленные белки, осуществляющие различные ковалентные модификации гистонов, а также короткие некодирующие РНК. Согласно современным взглядам, метилирование ДНК служит эпигенетической меткой, позволяющей регуляторным факторам транскрипции отличать метилированные последовательности генома от гомологичных, но не метилированных последовательностей. Существенные успехи в исследовании метилирования ДНК получены после открытия белков, связывающихся с метилированной ДНК. В настоящее время особое внимание уделено белкам, связывающимся с метилированными CpG-последовательностями ДНК и мобилизующими в эти участки гис-тоновые деацетилазы и другие гистон-модифицирующие белки, формирующие транскрипционно неактивную структуру хроматина. Картина сложноразветвлённой сети многочисленных взаимосвязанных реакций модификации и ремоделирования структуры хроматина только устанавливается, в том числе устанавливается специфичность функций индивидуальных ДНК-метилтрансфераз эукариотической клетки. В структурно-функциональном исследовании энзиматического метилирования эукариотических ДНК существует значительный пробел, связанный с изучением только CpG-типа этой модификации. Однако у эукариот обнаружен второй симметричный тип метилирования ДНК CpNpG (N — любой нуклеозид) и несимметричный тип метилирования CpN. Растущее внимание к картине метилирования эукариотического генома, на фоне которой развиваются нормальные и нарушенные процессы жизнедеятельности, ставит вопрос о раздельном анализе каждого из этих типов метилирования ДНК. Исследование различных типов сайт-специфического метилирования ДНК имеет фундаментальное значение для понимания функциональной роли этой модификации эукариотического генома.
Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение CpG- и CpNpG-типов метилирования ДНК высших эукариот в условиях изменения метаболизма и клеточ-
ной дифференцировки и при трансген-индуцированном метилировании генома, а также разработка новых методических приёмов анализа метилирования ДНК и применения ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях. В число основных экспериментальных задач входили:
разработка метода определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG (W = А или Т) генома;
исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования (CpNpG-тип) ДНК клеток растений Nicotiana tabacum;
анализ метилирования генома растений Mesembryanthemum crystalUnum в условиях солевого стресса и переключения метаболизма на С4-путь фотосинтеза;
анализ метилирования 5'-концевой области гена кальцитонина человека в норме и при лейкозах;
исследование эффекта трансген-индуцированного CCWGG-метилирования ДНК клеток НК293 культуры эпителиального слоя почек человека;
разработка приёмов применения цитозиновых ДНК-метилтрансфераз в новых биотехнологиях.
Научная новизна. На основе особенностей каталитической активности ДНК-метилтрансфераз BstNI и EcoRll разработан метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG.
Впервые осуществлён перенос в клетки растений гена гетерологичной ДНК-метилтрансферазы ЕсоШ[ (M-EcoRII) в составе Т-ДНК агробактериальной Ti-плазмиды дикого типа и в модифицированной форме NLS-M-fcoRII в составе обезоруженной Т-ДНК. Обнаружено, что неэкспрессируемый ген M-coRII индуцирует у первичной трансформированной клеточной ткани N. tabacum образование новых морфологических и биохимических фенотипов. Установлен пониженный уровень метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в ДНК этих клеток. Показано, что экспрессия гена NLS-M-coRII индуцирует новый морфологический фенотип целого растения и вызывает в его геноме дополнительное метилирование последовательностей CCWGG. Установлено, что в условиях засоления, при переключении Сз-фотосинтеза на С4-путь фотосинтеза, наблюдается двукратное повышение уровня метилирования последовательностей CCWGG в ДНК растений М. crystalUnum, связанное с гиперметилированием фракции повторяющейся ДНК. Полученные данные могут свидетельствовать о новой специфической функциональной роли CpNpG-метилирования повторяющейся ДНК в образовании специализированной структуры хроматина в клетках М. crystalUnum при их адаптации к солевому стрессу и переключении на С^фотосинтез.
Обнаружено, что при лейкозах гиперметилирование цитозина в последовательностях CpG в 5'-концевой области гена кальцитонина человека не распространяется на близлежащие последовательности CpNpG. Сформулировано положение о существовании особого безальтернативного CpG-метилирования генома высших эукариот. Впервые осуществлён перенос в клетки НК293 культуры эпителиального слоя почек человека гена ДНК-метилтрансферазы EcoRU в модифицированной форме NLS-MEcoRll-GFP. Установлено, что трансген-индуцированное CCWGG-метилирование ДНК клеток НК293 не влияет на CpG-метилирование их генома. Показано отсутствие влияния CCWGG-метилирования промотора гена АРС на его экспрессию в клетках НК293. Установлено отсутствие эффекта CCWGG-метилирования олигодезоксинук-леотидных субстратов на активность ДНК-метилтрансферазы DNMT1 in vitro.
Выявлены особенности частоты встречаемости сайтов CWG и CCWGG в геноме человека, указывающие на их возможную различную структурно-функциональную роль.
Для применения в нанобиотехнологии и ингибирования цитозиновых ДНК-метилтрансфераз in vivo сконструированы и исследованы олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRU.
Праісгическая ценность работы. Разработанный метод определения уровня метилирования внутреннего цитозина в последовательностях CCWGG в геномной ДНК может применяться при анализе динамики сайт-специфического метилирования генома различных организмов в процессе их жизнедеятельности.
Получены генетические конструкции для экспрессии модифицированных форм гена ДНК-метилтрансферазы EcoRU: NLS-M-coRII и NLS-M-coRII-GFP в клетках растений и млекопитающих.
Экспрессию в клетках растений гетерологичных генов цитозиновых ДНК-метилтрансфераз можно использовать для получения эпигенетического разнообразия клеточных культур растений, а полученные клетки и ткани использовать в качестве новых удобных объектов для исследования функциональной роли энзиматического метилирования ДНК.
Клетки млекопитающих, экспрессирующие гетерологичные гены цитозиновых ДНК-метилтрансфераз могут использоваться как удобные модели для изучения особенностей эпигенетических модификаций ДНК.
Сконструированные на основе модифицированных производных цитозина и ДНК-метилтрансферазы EcoRU олигодезоксинуклеотиды и олигодезоксинуклеотид-белковые комплексы перспективны для восстановления нормальной картины метилирования ДНК эукариотической клетки.
Полученные в работе оригинальные экспериментальные данные могут быть использованы в теоретических и практических курсах современной молекулярной и клеточной биологии высших эукариот.
Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из ведения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 226 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка и 11 таблиц. Библиография включает 432 источника. Апробация результатов работы. Результаты данной работы были представлены на 4th New England Biolabs Workshop on Biological DNA Modification, (Австрия, 1997); Annual Oncologycal Congress of American Urologic Association, (США, 2002); Scholarship of Anticancer Drug Design, (США, 2003); FEBS-CNRS Workshop on DNA and RNA modification enzymes: Comparative Stracure, Mechanism, Function and Evolution, (Франция, 2007); 12th Congress of the European Hematology Association, (Австрия, 2007); VI Съезде Гематологов и трансфузиологов Республики Беларусь (Минск, 2007); III Съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); VI Съезде Общества Физиологов растений России (Сыктывкар, 2007); Международном симпозиуме по физико-химической биологии (Москва, 2004); IV съезде Общества Биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, (Пущино, 2006); IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и программы Президиума РАН «Динамика генофондов растений, животных и человека»
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 печатных работ. Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в выборе стратегии исследования, разработке новых подходов к решению экспериментальных задач, в обсуждении и обобщении полученных результатов и написании публикаций. Все основные эксперименты, проведённые в работе, выполнены лично автором, а также руководимыми им сотрудниками и студентами. В работах, выполненных в соавторстве с сотрудниками ФИБХ РАН, сотрудниками других институтов РАН и с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, прямом участии в проведении экспериментов и получении результатов, их обсуждении и оформлении в виде публикаций.
Автор выражает особую признательность профессору Я.И. Бурьянову, в лаборатории которого были выполнены приоритетные исследования, положенные в основу настоящей работы. Автор благодарит всех сотрудников и студентов своей группы, а также всех зарубежных коллег за плодотворное сотрудничество.
