Содержание к диссертации
Введение
1. Введение. 4
2. Обзор литературы.
2.1. Роль Cro-репрессора в жизненном цикле бактериофага X. 6
2.2. Организация пространственной структуры Сго. 14
2.3. Молекулярные основы взаимодействия Сго и ДНК. 22
3. Материалы и методы.
З.1. Используемые материалы и реактивы. 37
3.2. Выделение и очистка препаративных количеств Сго и CroVC. 40
3.3. Модификация SH-групп CroVC. 45
3.4. Физические методы исследования структурной и термодинамической организации Сго и CroVC. 45
3.5. Методы определения параметров связывания Сго и CroVC с синтетическими аналогами операторных ДНК. 49
4. Результаты и обсуждение.
4.1. Оптимизация условий выделения Сго и CroVC. 52
4.2. Сравнительные термодинамические и структурные исследования Сго и CroVC. 52
4.3. Изучение влияния замены Val55^Cys на ДНК-связывающую активность Сго. 62
Выводы. 91
- Организация пространственной структуры Сго.
- Молекулярные основы взаимодействия Сго и ДНК.
- Выделение и очистка препаративных количеств Сго и CroVC.
- Сравнительные термодинамические и структурные исследования Сго и CroVC.
Введение к работе
Выяснение механизмов специфичности ДНК-белкового взаимодействия всегда рассматривалось как фундаментальная проблема молекулярной биологии. В последние годы, в связи с развитием методов генной и белковой инженерии, она получает и определяющее практическое значение. Выяснение структурных и термодинамических характеристик узнавания ДНК белками позволит подойти к управлению процессами переключения генов и к созданию новых терапевтических подходов.
Регуляция экспрессии генов в значительной мере осуществляется посредством избирательного взаимодействия специальных белков -факторов транскрипции - и регуляторных участков ДНК. Белковые факторы транскрипции способны формировать как неспецифические комплексы с двухцепочечными участками ДНК произвольной последовательности, так и специфические комплексы с уникальными последовательностями ДНК в составе определенных регуляторных генов, например, операторов (Ptashne, 2005; Raviscioni et al., 2005). Полученные за последние годы структурные данные показали, что процесс формирования специфического ДНК-белкового комплекса предполагает значительные сопряженные конформационные изменения обоих его компонентов. Таким образом, моделирование и управление специфичностью ДНК-белковых взаимодействий требует понимания деталей структурной и термодинамической организации обоих их участников. Именно поэтому исследование термодинамических свойств относительно просто организованного ДНК-связывающего белка, каким
является Сго-репрессор бактериофага X, и эффекта точечной аминокислотной замены, изменяющей его стабильность и ДНК-
связывающую активность, представляется актуальным и методически
удобным.
Настоящая диссертационная работа посвящена определению структурных и термодинамических свойств мутантной формы Сго-
репрессора бактериофага Л- и выяснению механизма влияния точечной аминокислотной замены Val55-»Cys на стабильность и функциональную активность белка Сго.
Обзор литературы
Организация пространственной структуры Сго.
Молекулярные основы тонкого механизма управления экспрессией генов бактериофага X стали выясняться только после установления пространственной структуры элементов регуляторного аппарата этого фага: репрессора СІ или А,-репрессора, точнее его N-концевого домена, ответственного за специфическое связывание с операторной ДНК (Pabo and Lewis, 1982), и Cro (Anderson et al., 1981; Ohlendorf et al., 1983b). Также были определены пространственные структуры целого ряда прокариотических ДНК-связывающих регуляторов транскрипции: белка активатора катаболизма, CAP (McKay and Steitz, 1981); белка Сго и ДНК-связывающего N-концевого домена репрессора лямбдоидного фага 434 (Montage et al, 1989а; Mondragon et al., 1989b) и других (см., в частности, обзоры: Pabo and Sauer, 1984; Pabo and Sauer, 1992). Оказалось, что все они, а также и многие другие прокариотические и эукариотические ДНК-узнающие белки содержат характерный элемент структуры - "спираль-поворот-спираль", или "Helixurn-Helix motif, — с участием которого и осуществляются, прежде всего, специфические взаимодействия между боковыми группами определенных аминокислотных остатков и доступными участками спаренных нуклеотидов в составе операторной ДНК (Brennan and Matthews, 1989а; Brennan and Matthews, 1989b; Harrison and Aggarwal, 1990; Sauer et al., 1982; Harrison, 1991; Freemont et al., 1991). Белок Cro, наряду с репрессором CI фага X и Lac-репрессором Е. coli, был среди первых выделенных в индивидуальном виде и охарактеризованных ДНК-связывающих регуляторов транскрипции (Folkmanis et al., 1976; Takeda et al., 1977). Первичная структура Сто была определена анализом нуклеотидной последовательности его гена (Roberts et al., 1977) и подтверждена методами белковой химии (Hsiang et al., 1977). Создание рекомбинантной плазмиды для суперпродукции позволило выделять белок Сго в количестве, достаточном для структурных исследований (Roberts et al., 1979), а конструирование синтетических аналогов природного гена его (Eisenbeis et al., 1985; Pakula and Sauer, 1989) сделало этот белок удобным для изучения методами белковой инженерии. По своим физико-химическим характеристикам Сго является небольшим глобулярным белком. Его полипептидная цепь состоит из 66 аминокислотных остатков и имеет молекулярная массу 7351 Да, что характеризует Сго как один из наименьших известных белков. Как и большинство других ДНК- и РНК-связывающих белков, Сго богат остатками Lys и Arg и его изоэлектрическая точка достигается при рН=9,9. Молекула Сго не содержит внутримолекулярных ковалентных сшивок и не связана с какими-либо низкомолекулярными лигандами и кофакторами.
Для дальнейшего важно отметить, что структура белка Сго дикого типа не стабилизирована S—S-связями и вообще не содержит остатков цистеина. Пространственная структура Сго детально исследована рентгеновской кристаллофафиеи и спектральными методами, в том числе и методами двухмерного ЯМР. Рентгеноструктурный анализ показал, что элементарная кристаллическая ячейка белка Сго образуется четырьмя мономерами (Anderson et al., 1981; Ohlendorf et al., 1983b). Конформации этих четырех мономеров практически идентичны, а характер взаимодействий между ними указывает, что белок может находиться в растворе в виде либо димерного, либо тетрамерного комплекса. Регулярная вторичная структура каждого мономера представлена антипараллельным р-складчатым листом, состоящим из трех участков: pi - остатки 2-6; 02 - остатки 39-45 и РЗ - остатки 48-55, и тремя а-спиралями: al - остатки 7-14; а2 - остатки 15-23 и ссЗ -остатки 27-36 (рис. 4). Эти данные в целом совпадают с данными о локализации спиновых систем в молекуле Сго, полученными методами двухмерного ЯМР (Weber et al., 1985а; Weber et al, 1985b; Matsuo et al., 1995; Matsuo et al., 1991), и предсказаниями вторичной структуры белка по аминокислотной последовательности, проведенного О. Б. Птицыным и соавторами (Ptitsyn et al., 1982). Существуют, однако, некоторые расхождения в определении границ элементов вторичной структуры в пределах одного - двух аминокислотных остатков. В растворе Сго находится преимущественно в димерном состоянии (Folkmanis et alM 1976; Takeda et al., 1977). Ось симметрии второго порядка проходит перпендикулярно Р-слою, образуемому в зоне контакта субъединиц димера, в области расположения остатков Val55 обеих полипептидных цепей (Anderson et al, 1981; Ohlendorf et al., 1983b). Анализ структуры Сго в кристалле и в растворе, полученной по данным ЯМР, указывает на формирование общей антипараллельной Р-структуры остатками 53-59 каждой полипептидной цепи. Вероятно, все шесть Р-структурных участков димера - по три от каждого из мономеров - объединены в единый свернутый Р-лист. Так называемый гидрофобный кластер молекулы Сго достаточно велик. В его построении задействованы внутренние участки спиралей al и аЗ, а также внутренние боковые группы участков р2 и РЗ. Следует отметить, что каждая субъединица формирует свой собственный гидрофобный кластер, слабо перекрывающийся с гидрофобным кластером второго мономера. Можно говорить лишь о вовлечении боковых групп остатков Phe58 в формирование гидрофобного кластера противоположной субъединицы (Ohlendorf et al., 1983b). Замена Phe58 на другой аминокислотный остаток или удаление части полипептидной цепи, включающей этот остаток, приводят к существенной дестабилизации структуры Сго и его протеолитической деградации in vivo. Мусинг и Сауэр сконструировали рекомбинантный белок Сго, добавив после остатка Lys56 устойчивый (З-поворот, образуемый дуплетом Asp-Gly, и С-концевую последовательность второй полипептидной цепи димера - остатки 54-66 (Mossing and Sauer, 1990). Белок, представляющий, по сути, стабильную мономерную форму Сго, имел более высокую стабильность и обладал достаточной ДНК-связывающей активностью. В этой работе был также проведен случайный мутагенез участка 52-58 для адаптации аминокислотной последовательности р-поворота к структуре репрессора.
В результате, Phe58 был охарактеризован как наиболее консервативный остаток, имеющий только одно замещение на близкий по свойствам Тгр. Другой вариант мономерной стабильной формы Сго был получен путем замещения АІаЗЗ на Тгр. Такая замена приводит к заполнению лакуны в гидрофобном кластере, которая в Сго дикого типа заполняется, как было указано выше, Phe58 противоположной субъединицы димера (Hall et ah, 2005; LeFevre and Cordes, 2003; Newlove et al, 2006). Авторами выдвинута концепция баланса между стабильностью мономерных форм Сго и устойчивостью его димерных форм. С-концевые остатки, 62-66 каждой полипептидной цепи Сго не локализованы на картах электронной плотности. Андерсон и соавторы предположили, что эта часть белка не структурирована (Anderson et al., 1981). В спектрах Н-ЯМР пики, соответствующие сигналам метальных дублетов: Thr64, Thr65 и Аіабб аномально узки, что говорит о высокой подвижности боковых групп этих остатков и об отсутствии фиксированной конформации у этого участка полипептидной цепи (Weber etal., 1985а). Детальное исследование роли С-концевых аминокислотных остатков Сго позволило установить, что не вовлеченные в регулярную структуру остатки 62-66 играют важную роль при связывании этого белка с ДНК. Авторы первых рентгеноструктурных работ по Сго (Anderson et al., 1981; Ohlendorf et al., 1983b) указывали, что наличие неструктурированного положительно заряженного С-концевого участка полипептидной цепи Сго связано с его способностью формировать электростатические контакты и, вероятно, водородные связи в малом желобке ДНК (см. рис. 4). Однако эти шесть С-концевых аминокислотных остатков Сго играют и определенную структурную роль собственно в белке, так удаление Lys62 ведет к потере стабильности и необратимой агрегации Сго в растворе (Leighton and Lu, 1987). Исследование стабильности Сго методом спектроскопии кругового дихроизма в растворе в диапазоне рН 2,0 - 12,5 показало, что белок сохраняет свою нативную структуру при значениях рН от 4,5 до 10,5. Выше и ниже этого диапазона доля регулярных вторичных структур в белке резко уменьшается, причем уменьшение доли вторичной и третичной структур носит симбатный характер (Bolotina et al, 1983).
Молекулярные основы взаимодействия Сго и ДНК.
Взаимное соответствие топологии некоторых элементов регулярной структуры белка и двойной спирали В-формы ДНК было подчеркнуто уже в первых работах по определению пространственной структуры Cro-репрессора (Anderson et al., 1981; Ohlendorf et al., 1982; Ohlendorf et al., 1983a; Ohlendorf et al., 1983b) и послужило основой построения модели взаимодействия Сго с операторной ДНК. Основываясь на симметрии димера Сго и операторных участков, а также на экспериментах по защите фосфатных групп остова операторной ДНК связанным с нею Сго от этилирования (Johnson et al., 1978; Ptashne et al, 1980), Брайн Мэтьюз и сотрудники предположили, что ключевую роль в специфичном узнавании операторной ДНК молекулами Сго, играют два спиральных элемента: а2 и аЗ, соединенные поворотом - участком полипептидной цепи из четырех аминокислотных остатков (Ohlendorf et al., 1982), Симметричный димер Сго содержит две такие пары спиралей: а2 - осЗ и а2 - аЗ , расположенные на расстоянии, соответствующем длине одного витка двойной спирали ДНК - «34А. В каждой паре а-спирали расположены под углом «90 относительно друг друга и соединены поворотом полипептидной цепи. Спирали ссЗ и аЗ повернуты к оси двойной спирали ДНК под углом, совпадающим с углом наклона проекции большого желобка ДНК к ее продольной оси -»32, Эти так называемые "узнающие спирали" могут укладываться в большой желобок ДНК, образуя внутри него сеть межмолекулярных контактов. Спирали а2 и а2 фиксируют положение узнающих спиралей посредством электростатического взаимодействия заряженных боковых групп остатков Lys21 и Lys2T с фосфатами остова ДНК. Остатки Lys56 и Lys56 , располагающиеся на внешней стороне общей [3-складки, формируемой в области межсубъединичного контакта обоими мономерами, а также остатки: Lys62, Lys62 и Lys63, Lys63 , находящиеся в подвижной С-концевой части полипептидных цепей Сто, также участвуют в электростатических взаимодействиях с фосфатными группами остова ДНК. Лабильные участки цепей в области остатков 62-66 каждого из мономеров будут при этом располагаться вдоль малого желобка на поверхности ДНК. В соответствие с моделью линейной диффузии, предложенной и разработанной Петером фон Хиппелем и сотрудниками (Berg and von Hippel, 1987; Berg and von Hippel, 1988a; Berg and von Hippel, 1988b; Berg et al., 1981; von Hippel and Berg, 1986; von Hippel and Berg, 1989), молекула репрессорного белка может неспецифично связываться с произвольным участком ДНК, а затем скользить вдоль нее до нахождения наиболее выгодных контактов с обращенной в большой желобок поверхностью нуклеотидных пар.
Приведенная выше модель узнавания димерами Сго операторной ДНК получила ряд экспериментальных подтверждений. Такеда и соавторы (Takeda et al., 1986) определили области контакта Сго с ДНК в экспериментах по защите от химической модификации боковых групп остатков лизина в составе комплекса. Они, в частности, показали, что Lys32, находящийся на поверхности глобулы в составе спирали аЗ, и внутренний Lys56 полностью, a Lys21, принадлежащий спирали а2, Lys62 и Lys63, принадлежащие С-концевым неструктурированным участкам полипептидной цепи Сго, частично защищены. В этой работе удалось прямо показать, что природа специфичного и неспецифичного ДНК-белкового взаимодействия различна. Хотя при неспецифичном взаимодействии защищены те же самые остатки лизина, что и при специфичном, неспецифичное связывание очень чувствительно к ионной силе и носит, в основном, электростатический характер. Более подробно взаимодействия между боковыми группами аминокислотных остатков Сго и нуклеотидами оператора исследовались при помощи методов ЯМР-спектроскопии. После соотнесения большинства резонансных сигналов спектров Н-ЯМР в свободном белке (Kirpichnikov et al., 1982; Iwahashi et al., 1982; Arndt et al., 1983), а также исследования Сго с помощью динамических (Shirakawa et al., 1985) и двухмерных методов ЯМР-спектроскопии (Weber et al., 1985а; Weber et al., 1985b), стало возможным непосредственно наблюдать изменения сигналов от различных групп белка при формировании специфического и неспецифического комплексов. Было, в частности, показано, что основные водородные связи и гидрофобные контакты между боковыми группами аминокислотных остатков и парами оснований, а также электростатические контакты между полярными группами белка и фосфатами остова ДНК, предсказываемые моделью Мэтьюза, действительно обнаруживаются в специфическом комплексе. Однако эти исследования выявили и определенные отличия между моделью и реальной структурой комплекса. Детальный анализ данных указывает на локальные изменения во взаимном расположении отдельных спиновых систем Сго и ДНК в составе специфического комплекса по сравнению со свободными белком и ДНК и на взаимное структурное влияние этих макромолекул (Kyogoku et al., 1995). Прежде всего, существенные конформационные изменения при связывании с Сго претерпевает операторный участок ДНК. Мэттью и Олендорф, используя минимизацию свободной энергии электростатических взаимодействий, предложили модель комплекса, в которой операторная ДНК изогнута с радиусом изгиба «75 (Matthew and Ohlendorf, 1985). В дальнейшем, сопоставив сдвиги сигналов центральной пары оператора GC-9 при формировании комплекса и ее доступность для химической модификации, Ли и соавторы предположили, что ДНК изменяет свою конформацию преимущественно в центральной части операторного участка, изгибаясь на достаточно большой угол (Lee et al., 1987).
Эксперименты по электрофоретической подвижности (Lyubchenko et al., 1991) и уже первые рентгеноструктурные данные по строению комплекса Сго -операторная ДНК (Brennan et al., 1990) показали, что молекула ДНК в комплексе с Сго действительно "надламывается" на угол 35 - 40. Наличие существенных изгибов ДНК при связывании с Сго было продемонстрировано также сканирующей атомной силовой микроскопией (Erie et al., 1994), Значительные изменения происходят и в структуре белкового компонента. Исследования комплексов Сго со специфической и неспецифической ДНК выявили высокую лабильность внутренних областей структуры белка. Ширакава и соавторы предположили на основе увеличения экспонированности остатка Туг51 в составе специфического комплекса, что Сго при связывании с операторной ДНК переходит в существенно иное конформационное состояние (Shirakawa et al., 1987). В частности, изменяется взаимная ориентация мономеров белка. В то время как остатки 7-50 не изменяют своих положений относительно друг друга, составляя стабильную структурную единицу, в области остатков 52-56 и 52 -56 полипептидные цепи поворачиваются на угол 35-50 друг относительно друга. Эта же группа авторов предложила рассматривать взаимодействие Сго с ДНК как специфичное - с взаимным изменением конформаций ДНК и белка, - или как неспецифичное, происходящее без существенных информационных изменений (Lee et ah, 1987). В 1986 году были опубликованы предварительные рентгенострук-турные данные о строении комплекса Сго - оператор (Brerman et al., 1986), а в 1990 появились данные о его полной структуре с разрешением 3,9А (Brennan et al., 1990). Согласно результатам этих работ, и оператор, и репрессор в составе комплекса имеют конформаций, отличные от конформаций ДНК и белка Сго в свободном состоянии. Для продолжения рассмотрения работ по структуре комплексов Сго и ДНК, а также для дальнейшего анализа функциональной активности Сго, важно ввести понятие "консенсусный оператор". Все шесть вышеупомянутых природных операторных участков ДНК бактериофага X (Х-операторы) представляют собой 17-членные несовершенные палиндромы, отличающиеся сродством как к репрессору Сго, так и к функционально альтернативному ему репрессору CI или -репрессору (рис. 5). В Х-операторах можно выделить консервативное "левое" плечо и вариабельное "правое". Из природных операторов наибольшее сродство к Сго имеет оператор правого оперона фага X - 0R3, максимальное же сродство к Сго демонстрирует искусственно сконструированный так называемый "консенсусный оператор" - почти полностью симметричный дуплекс, составленный из двух консервативных "левых" плеч оператора.
Выделение и очистка препаративных количеств Сго и CroVC.
Перед выращиванием биомассы в препаративных количествах клетки, несущие плазмиды-суперпродуценты, тестировали в миникультуре. Для этого одиночную колонию с чашки Петри с минимальным агаром вносили в 3 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Клетки выращивали при 37С с интенсивной аэрацией до достижения середины логарифмической фазы роста, после чего экспрессию генов его, находящихся под контролем tac-промотора, индуцировали ОД мМ ИПТГ. Бактериальную культуру подращивали в течение трех часов, биомассу осаждали центрифугированием и гомогенизировали на ультразвуковом дезинтеграторе. Гомогенат тестировали электрофоретически на наличие индуцированного синтеза Сго. Для препаративного выделения в четыре двухлитровые колбы Эрленмайера, содержащих по 0,8 л среды LB или LA, вносили ночную культуру с разведением 1:100 - 1:1000, полученную из отобранной колонии. Выращивание проводили при 37С с интенсивной аэрацией в течение 8-12 часов. Индукцию производили в зависимости от генотипа штамма - либо лактозой до концентрации 50 мМ, либо ИПТГ до концетрации 0,32 мМ. Культуру подращивали после индукции 4-6 часов при 37С, после чего клетки собирали центрифугированием 15-20 мин при 3500 об/мин, при 4С на центрифуге K-26D. Собранные клетки ресуспендировали в 1,5 объемах - по отношению к массе клеток -буфера L. Разрушение клеток производили порциями по 5-7 мл на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН- 1УЧ.2 при частоте 22 кГц в течение 3,5 мин. К гомогенату для ингибирования части клеточных протеиназ добавляли 2,5 мкл 1М раствора ФМСФ в диметилсульфоксиде на 1 мл гомогената, а также ДНКазу и РНКазу - до концентрации 10 мкг/мл, MgCl2 - до 20 мМ. Гомогенат выдерживали 1 час для деградации ДНК Е. coll, после чего к нему добавляли КС1 до концентрации 0,54 М и проводили центрифугирование при 30 тыс. об/мин в течение 2-2,5 ч на ультрацентрифуге «Beckman L5-75» (ротор 50.2ТІ). Супернатант, содержащий Сго, тщательно собирали и, при необходимости, сохраняли в замороженном виде при -70С. Для разрушения биомассы, полученной в промышленных ферментерных установках объемом 100 л, применяли пресс Френча: 150-200 г биомассы суспендировали в 300 400 мл буфера L при 4С и продавливали суспензию через предварительно охлажденную установку.
Сразу же после разрушения клеток в гомогенат добавляли 2,3 мкл 1М раствора ФМСФ на 1 мл гомогената. Деградацию ДНК Е. coli осуществляли, как описано выше. Большое количество биомассы потребовало введения дополнительной стадии центрифугирования - перед ультрацентрифугированием клеточный дебрис удаляли центрифугированием гомогената в центрифуге L-10 при скорости 12 тыс. об/мин. Супернатант переносили в стаканы «Beckman» для ультрацентрифугирования и оставшийся дебрис осаждали как и в случае небольших количеств биомассы. Полученный супернатант разводили буфером "С" до величины ионной силы, примерно соответствующей ионной силе буфера "С"+0Л М KCL Величина ионной силы оценивалась по проводимости раствора кондуктометром ОК-102/1, «Radelkis», Дания, Для буфера "С"+0.1 М КС1 проводимость составляла 7-9 mS при 4С. Разведенный супернатант наносили на систему из двух последовательно соединенных колонок, предварительно уравновешенных буфером "С"+0.1 М KCI: преколонки размером 8x2,3 см с DEAE-Sephadex А-25 (использовалась для очистки экстракта от компонентов, несущих отрицательный заряд, и фильтрации крупных частиц) и рабочей колонки - 9,5x3,5 см с SP-Sephadex С-25, - со скоростью 72 мл/ч. Объемы наносимых препаратов с учетом разведения буфером "С", составляли 400-500 мл (при работе с большими количествами биомассы преколонку не меняли, а рабочую колонку заменяли на колонку размером 50x5 см. Общий объем наносимого препарата в таких случаях достигал 1,5-2,0 л. После этого колонки промывали буфером "С+0.1 М КС1 в количестве 2-3 объемов колонки С-25 до восстановления оптической плотности элюата на уровне оптической плотности "С" + 0.1 М КС1. Элюцию проводили солевым градиентом в буфере "С" от ОД до 0,8 М КС1 с рабочей колонки С-25 при скорости 72 мл/ч. Оптическая плотность элюата - профиль элюции - записывалась по поглощению на длине волны 280 нм проточным УФ-детектором. Общее содержание белка во фракциях проверяли по оптической плотности раствора при длине волны 276 нм, соответствующей максимуму поглощения для Сго. Состав белков во фракциях определяли электрофоретически. Фракции, полученные после элюции с колонки С-25 и содержащие Сго, объединяли и диализовали против 10-тикратного объема буфера "А". Диализат наносили на колонку 18x1,8 см с СМrisacryl, уравновешенную буфером "А"+0.1 М КС1, со скоростью 60 мл/ч. За один раз через колонку пропускали не более 100 мг белка, что соответствовало 1/5-ой общей емкости этой колонки. После нанесения колонку промывали двумя объемами буфера "А"+0Л М КС1. Элюцию проводили линейным градиентом "А"+0,1 - "А "+ 0,8 М КС1 (общий объем - 600 мл). Содержание белка во фракциях определяли, как описано выше. На этой стадии очистки некоторые фракции содержали Сго высокой степени чистоты, что доказывается отсутствием дополнительных полос в двух используемых электрофоретических системах при нагрузке 40-50 мкг белка на дорожку, с окрашиванием Coumassi G-250 в НСЮ4. Эти фракции объединяли и диализовали против дистиллированной воды (не менее трех смен) до проводимости, близкой к проводимости воды - не выше 10 mS при 20С - с последующей лиофилизацией в случае длительного хранения, или сохранением в замороженном виде при -70С. Фракции, содержащие примеси других белков, объединяли и переводили диализом в буфер "А"+0.1 М КС1 для последующей рехроматографии. Непосредственно перед использованием в экспериментах препараты белков подвергали дополнительной очистке на колонке "Mono S" в системе FPLC. За один раз на колонку наносили не более 5 мг белка (1/4 общей емкости колонки). Элюцию проводили линейным градиентом "А "+0.1 М КС1 - "А "+ 0.8 М КС1. Для использования в экспериментах препараты белка переводили в соответствующий буфер исчерпывающим диализом. Общая схема выделения и очистки представлена на рис. 8. Контроль содержания Сго на всех стадиях выделения и очистки осуществлялся электрофоретически в системе Шпихера с кислой мочевиной. Для определения гомогенности препаратов, кроме системы Шпихера использовалась система Леммли с ДСН в качестве денатурирующего агента.
Сравнительные термодинамические и структурные исследования Сго и CroVC.
Наиболее информативным для понимания влияния точечных аминокислотных замен на структурную организацию белка является исследование его мутантных форм, имеющих существенные отличия в стабильности. Стабильность же Сго дикого типа, как и большинства других ДНК-узнающих регуляторных белков, невелика. Дальнейшее понижение его стабильности привело бы к выходу денатурационного перехода за рамки температурного диапазона, в котором можно осуществлять надежные измерения. Поэтому ожидаемая более высокая стабильность CroVC и определила использование этого мутантного белка на первых этапах термодинамических исследований. Если при введении замен структура белка значительно искажается, то количественная интерпретация термодинамических данных становится затруднительной или вообще невозможной. По результатам анализа спектров кругового дихроизма и Н-ЯМР можно сделать вывод, что пространственная структура CroVC не отличается существенно от структуры белка дикого типа. Исследование Сго и CroVC методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. Для CroVC, в котором вследствие наличия межсубъединичной дисульфидной связи, спонтанно образуемой двумя введенными остатками цистеина, разрушение третичной структуры не сопровождается диссоциацией полипептидных цепей и, как следствие, форма кривых плавления не должна зависеть от концентрации белка. По аналогии с другими небольшими глобулярными белками можно было предположить, что нативная структура ковалентно-перешитой формы Сго должна разрушаться под действием температуры в одну стадию по мономолекулярному механизму: Количественные параметры наблюдаемых переходов следующие. Для Сго - температура середины единственного наблюдаемого в данных условиях перехода Tm = 46,4С. Калориметрическая энтальпия денатурации ДНса1 = 225 кДж/моль. Для отчетливо наблюдаемых двух переходов в случае CroVC температура середины первого перехода Тщ1 = 54,5С, а для второго перехода - Тт2 = 102,0С. Калориметрические энтальпии составляют соответственно -ДН " = 220 кДж/моль и AH"12 = 250 кДж/моль.
Столь высокотемпературный переход со значительной энтальпией для такого небольшого белка, не имеющего дополнительной стабилизации за счет лигандов, наблюдался впервые. Форма кривых плавления CroVC зависит от величины рН и ионной силы среды. С понижением рН пики теплопоглощения сдвигаются в область более низких температур. Однако степень смещения этих пиков различна, так при рН=4,0 для первого пика наблюдается смещение в сторону низкой температуры на 12С, в то время как для второго - на 23С. В условиях низкой ионной силы (20 мМ буферного компонента) температура середины первого перехода Тт! практически не меняется до тех пор, пока температура середины второго перехода Тт2 не сравняется с ней. В этих условиях на кривых плавления наблюдается единый пик теплопоглощения. Модификация йодацетамидом уникальных цистеинов CroVC приводит к радикальной трансформации кривой плавления - она становится похожей на кривую плавления Сго дикого типа. Наблюдается также небольшое снижение стабильности CroVC-S по сравнению с белком дикого типа - Тт= 39С, - что можно объяснить замещением неполярных боковых групп Val55, образующих плотный ван-дер-ваальсов контакт в димерах Сго, полярными S-ацетамидными группами, что может приводить к дестабилизации димеров. Высокотемпературный пик теплопоглощения для CroVC при нейтральных рН лежит в области 100С. Чтобы полностью проследить изменения в спектре ЯМР, связанные со вторым конформационным переходом, и избежать при этом определенных аппаратурных и методических трудностей, можно воспользоваться наблюдаемым при снижении рН смещением этого пика. Однако значительное понижение рН приводит к изменениям, связанным с кислотной денатурацией. Были выбраны компромиссные условия - рН=4,7, - при которых спектры белков как дикого типа, так и мутантного, при 20-30С практически не отличаются от таковых при нейтральном рН. Н-ЯМР спектры Сго и CroVC, снятые при различных температурах приведены на рис. 12. Соотнесение сигналов выполнено согласно Веберу и соавторам (Weber et al., 1985b), При 30C можно наблюдать очень высокую степень сходства спектров обоих белков. Более детальное сравнение спектров показывает, что в диапазоне от -0,3 до 0,6 м. д. все четыре явно разрешимых метильных сигнала Сго, сдвинутые в сильнопольную область под действием кольцевых токов ароматических групп и принадлежащие Ие40 и Leu42, присутствуют и в спектре CroVC. Так же почти идентичны ароматические области спектров этих белков - от 6,4 до 7,5 м. д. В области сигналов С Н остатков, включенных в р-структуру - от 6,4 до 7,5 м. д., - сигналы А1а52 и Glu54 Сго наблюдаются и в спектре CroVC, а хорошо разрешимый сигнал Val50 и частично разрешимые сигналы: Arg4, Phe41, Leu42, Glu53 и Lys56 в спектре CroVC объединяются в неразрешимый мультиплет с центром при 5,14 м. д. Поскольку вторичные химические сдвиги сигналов индивидуальных групп чрезвычайно чувствительны к их микроокружению, наблюдаемое высокое сходство спектров Сго и CroVC однозначно свидетельствует о высоком сходстве их пространственных структур. При этом незначительные отклонения можно ожидать в районе присутствующего в мутантном белке Cys55 и ближайших к нему остатков. Важно, однако, отметить одно существенное различие, которое говорит о более высокой жесткости структуры CroVC: в области 8,5-10 м. д. в его спектре наблюдается выраженные сигналы необменивающихся амидных протонов, отсутствующие в спектре белка дикого типа.
При повышении температуры изменения, наблюдаемые в спектрах Сго и CroVC, становятся существенными. Как и в сканирующих микрокалориметрических и оптических экспериментах, Сго характеризуется более ранним плавлением, и вторичные химические сдвиги, отражающие наличие устойчивой пространственной структуры, полностью исчезают уже при 60С. В спектре же CroVC при 70С уже не наблюдаются сдвинутые метальные сигналы остатка 11е40 и сигналы ароматических протонов ТугЮ и Phel4. В то же время вплоть до 80С отчетливо видны сигналы ряда протонов групп С Н в области 5 -6 м. д., что указывает на сохранение значительной части исходной Р-структуры. Даже при температуре 82С наблюдается сдвинутый метильный сигнал, принадлежащий Leu42. При дальнейшем повышении температуры до 92С спектр CroVC по виду приближается к спектру эквивалентной смеси аминокислот. Такой же вид начинает принимать и спектр Сго, но уже при значительно более низкой температуре. Использование Н-ЯМР-спектроскопии позволило соотнести второй денатурационный переход, наблюдаемый в CroVC, с плавлением С-концевой р-структурной области белка. Данное соотнесение было непосредственно подтверждено исследованием фрагментов CroVC: обработанного BrCN и расщепленного по остаткам Met 12 обеих полипептидных цепей - BrCN-фрагмент - и обработанного трипсином и расщепленного по остаткам Lys21 - Трип-фрагмент - (исследование выполнено Ю. В. Грико и В. В. Роговым, Институт белка). Полученные таким образом и выделенные С-концевые фрагменты CroVC имели единственный переход с параметрами, характерными для высокотемпературного перехода полноразмерного CroVC (Griko et al, 1992). Проведенные термодинамические и структурные исследования CroVC приводят к выводу, что в этом белке содержатся два домена, существенно различающиеся по стабильности. Вместе с тем, взаимодействие между этими доменами носит сложный характер: в то время как С-концевой участок белка способен самостоятельно формировать и поддерживать высокостабильную третичную структуру, стабильность структуры N-концевых участков зависит от присутствия С-концевого домена. Сопоставление термодинамических и структурных данных позволяет предположить, что домены CroVC сформированы следующим образом: две N-концевые части полипептидных цепей димера образуют единую кооперативную единицу, в то время как остальная часть молекулы, включающая участки 02 и рЗ обоих мономеров, формирует С-концевой домен.
Похожие диссертации на Стабилизация структуры lambda-CRO с заменой Val55-->Cys и специфичность его взаимодействия с ДНК
