Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
-
Методы идентификации экзогенной ДНК ... 9
-
Поглощение ДНК растительной клеткой ... 18
-
Механизм проникновения ДНК в растительную
клетку 28
-
Состояние экзогенной ДНК в клетке и взаимодействие ее с реципиентным геномом ... 35
-
Заключение. Выбор модельной растительной
системы 45
ГЛАВА 2. Материал и методы 48
-
Материал 48
-
Выделение ядерной фракции из проростков и
анализ полученных препаратов 49
-
Выделение ядер 49
-
Оценка препаратов ядер 50
2.3. Выделение ДНК 56
-
Выделение ДНК из проростков 56
-
Выделение ДНК из изолированных ядер . . 57 2.4.- Методы исследования и модификации ДНК . . 57
-
Спектрофотометрирование 57
-
Электрофорез 58
-
Фрагментирование 58
-
ДНКазная обработка препаратов .... 59
-
Иодирование 59
-
Обработка ДНК актиномицином Д .... 60
2.5. Методы изучения поглощения Н-тимидина про
ростками 60
-
Определение динамики включения в ДНК . . 60
-
Определение эффективности использования пог-
лощенного тимидина в синтезе ДНК .... 60
2.6. Иммунологические методы 61
-
Препараты для иммунизации 61
-
Иммунизация животных и получение антисывороток 61
-
Реакция связывания комплемента .... 62
-
Осаждение комплекса ДНК-антитело сульфатом аммония 64
2.7. Определение поглощения ДНК изолированными
ядрами 64
-
Определение распада эндогенной ДНК в ядрах . 65
-
Определение радиоактивности 66
2.10. Математическая обработка данных .... 67
ГЛАВА 3. Характеристика донорного материала (ДНК) и реципиента (изолированных клеточных ядер) .... 70
-
ДНК 70
-
Характеристика препаратов ядер 71
-
Изучение состояния изолированных ядер при длительной экспозиции 71
ГЛАВА 4. Разработка методов идентификации экзогенной ДНК 88
4.1. Мечение ДНК 88
4.1.1. Подбор концентраций основных ингредиентов
среды 90
-
Динамика включения и эффективность использования Н-тимидина в синтезе ДНК. Влияние ами-ноптерина и удаления эндосперма .... 92
-
Обсуждение і . 93
4.1.4. Метод мечения Н-тимидином ДНК проростков
кукурузы 98
4.2. Иммунологическое изучение ДНК 99
-
Изучение специфичности к ДНК полученных антисывороток 101
-
Изучение видовой иммуноспецифичности . . 102
4.2.3. Обсуждение 104
4.3. Методы идентификации экзогенной ДНК . . . 112
ГЛАВА 5. Взаимодействие ДНК с изолированными ядрами . . 119
5.1. Динамика поглощения и состояния экзогенной
гомологичной ДНК 119
-
Анализ методики определения поглощения ДНК 119
-
Динамика поглощения ДНК 119
-
Сохранность и состояние поглощенной Н-ДНК
в ядрах 122
-
Изменение ДНКазной активности ядер при инкубации 127
-
Обсуждение 131
5.2. Изучение механизма проникновения ДНК в изоли
рованные ядра 140
-
Кинетика поглощения Н-ДНК 140
-
Влияние некоторых химических агентов на кинетику поглощения нативной ДНК .... 141
-
Влияние температуры на поглощение нативной
ДНК 145
-
Зависимость поглощения ДНК от ионной силы инкубационной среды 151
-
Изучение скорости и стадий поглощения нативной ДНК изолированными ядрами . . . 151
-
Обсуждение 153
5.3. Изучение возможности экспрессии экзогенной ДНК 165
-
Влияние экзогенной гомологичной ДНК на транскрипционную активность ядер .... 165
-
Влияние экзогенной ДНК на "выход" метки из 3Н-ядер 167
5.3.3. Обсуждение 167
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 175
ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ 180
ЛИТЕРАТУРА 183
Введение к работе
Неотъемлемой частью материально-технической базы коммунизма, непременным условием подъема жизненного уровня населения является высокоразвитое сельское хозяйство. Интенсификация сельского хозяйства выступает одним из главных условий осуществления Продовольственной программы. Основное направление в выполнении этой задачи состоит во всемерном повышении урожайности сельскохозяйственных культур и дальнейшем повышении качества продуктов сельскохозяйственного производства.
Большая ответственность в связи с этим возлагается на биологические и сельскохозяйственные науки. В решениях 26 съезда КПСС и майского (1982 г.) Пленума ЦК КПСС указано: "сосредоточить усилия на выведении высокопродуктивных сортов растений, познании механизма физиологических, биохимических, генетических и иммунологических процессов". В создании новых форм растений главными методами до сих пор остаются гибридизация и отбор (Алиханян, 1981). Однако традиционные методы селекции существенным образом ограничены барьером межвидовой изоляции. В то же время постоянно растущие требования к создаваемым сортам ставят перед необходимостью введения генов из таксономически далеко отстоящих видов. В связи с этим большой интерес при получении новых исходных форм для селекции вызывают нетрадиционные подходы изменения живых организмов, основанные на непосредственном оперировании генетическим материалом на уровне молекул ДНК или клеток и субклеточных структур. Убедительным примером переноса, интеграции и успешного функционирования чужеродных генов, показывающим принципиальную возможность направленного изменения растительных клеток с помощью ДНК, является трансформация клеток двудольных Ті-плазмидой из Agrobacterium tumefaciens .
Методы генной и клеточной инженерии в определенной мере позволяет обойти нескрещиваемость между таксономически отдаленными видами, что создает возможность получения уникальных исходных форм культурных растений. Это отражено в Продовольственной программе СССР, где указана необходимость "развивать теоретические исследования по проблемам генной инженерии в селекции растений, микроорганизмов и животных".
Для обоснования возможности и практического развития методов генной инженерии высших растений необходима разработка таких общих проблем, как I) исследование механизма проникновения экзогенной ДНК в клетки, 2) изучение сохранности и форм существования донорного материала и 3) его участия в молекулярно-гене-тических процессах. Успешная разработка общих проблем трансформации растений может быть обеспечена удобными модельными системами реципиента и надежными высокоразрешающими методами исследования судьбы экзогенного материала в клетке. Наиболее простой, перспективной системой для изучения вышеуказанных вопросов выступают изолированные клеточные ядра.
Целью работы являлось исследование механизма проникновения и дальнейшей судьбы гомологичной ДНК в изолированных клеточных ядрах из проростков кукурузы ( Zea mays Ь .) и влияние экзогенного материала на состояние реципиентных структур. В связи с этим предстояло решение следующих основных задач: изучить поглощение ДНК и состояние экзогенного материала в зависимости от времени инкубации с ядрами; определить зависимость поглощения ДНК от ее концентрации; изучить влияние физико-химических факторов на поглощение ДНК и значение в этом процессе состояния реципиентных структур; исследовать воздействие экзогенной ДНК на РНК-синтетическую активность реципиентных ядер и степень деструкции эндоген' ной ДНК в процессе их инкубирования.
В настоящей работе при анализе поглощения ДНК ядрами широко использовались методы и математический аппарат химической кинетики.
В результате проведенных исследований составлена картина взаимодействия экзогенной гомологичной ДНК с ядрами, выделенными из проростков кукурузы. Показано, что при поглощении гомологичной ДНК изолированными ядрами не участвуют системы активного транспорта или облегченной диффузии. Большое значение в процессе накопления экзогенного гомологичного материала ядрами имеют сорбционные взаимодействия, в первую очередь электростатической природы. Проникновение и накопление ДНК происходит по ограниченному количеству участков на поверхности и мест связывания в ядре экзогенного материала. Максимальное количество гомологичной ДНК, которое способно поглотить растительное ядро in vitro, соответствует величине реципиентного генома. Выявлены 3 периода в процессе поглощения ДНК изолированными ядрами: накопительный, относительного равновесия и деструктивный. В целом процесс поглощения ДНК ядрами следует рассматривать как физиологический, в котором уровень накопления регулируется реципиентной системой и зависит от ее состояния. Экзогенная ДНК может влиять на жизненно важные процессы, стимулируя РНК-полимеразную активность ядер и индуцируя ДНКазную активность. Впервые для растительной системы показано, что индукция ДНКазной активности затрагивает не только экзогенный, но и эндогенный материал. Индуцированная деструкция эндогенной ДНК специфична в отношении происхождения донорного материала и наиболее выражена в случае инкубации ядер с гомологичной ДНК.
Полученные данные по взаимодействию ДНК с изолированными клеточными ядрами могут быть использованы при разработке теоретических и практических проблем генной инженерии растений.
Предложен метод эффективного мечения ДНК ±п v±v0 при сохранении нормального роста проростков, который может быть применен в исследованиях по физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений.
Вышеизложенные положения диссертации выносятся на защиту.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Всесоюзного селекционно-генетического института под руководством кандидата сельскохозяйственных наук Ю.М.Сиволапа.
Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых (Одесса, 1977), третьем и пятом рабочих совещаниях по генетической инженерии (Киев, 1980, 1982), ІУ съезде ВОГиС (Кишинев, 1981), I конференции молодых генетиков и селекционеров Белоруссии (Минск, 1982), симпозиуме "Ядерные белки и экспрессия генома" (Канев, 1983), научной конференции "Геном растений" (Черновцы, 1983).
