Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Пространственная организация днк в ядре 8
1.1.1. Уровни компактизации ДНК 8
1.1.2. Доменная структура генома 14
1.1.2.1. Ядерный матрикс 15
1.1.2.2. Прикрепленная к ядерному матриксу ДНК 16
1.1.2.3. Функции ДНК ядерного матрикса 19
1.1.3. Хромосомные территории 23
1.2. Незаконная рекомбинация и хромосомные перестройки 28
1.2.1. Двухчепочечные разрывы ДНК (ДЦР) и их репарация 28
1.2.2. Кластеризация точек разрыва при транслокациях, ассоциированных с лейкозами 34
1.2.3. Структура хроматина как причина кластеризации первичных точек разрыва 36
1.2.4. Участие топоизомеразы II в незаконной рекомбинации 37
1.2.5. Пространственная организация ядра способствует образованию определённых транслокаций 39
Постановка задачи и методические подходы 41
2. Материалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.1.1. Клеточные линии 43
2.1.2. Антитела 43
2.1.3. Химические реактивы 44
2.2. Методы 45
2.2.1. Культивирование человеческих клеток 45
2.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле 45
2.2.3. Приготовление препаратов ядерных матриксов in situ 46
2.2.4. Иммуноцитохшшя 47
2.2.5. Определение относительной представленности различных участков ДНК во фракции ДНК ядерного матрикса 47
2.2.6. Метод остановки полимеразной цепной реакции (PCR-stop assay) 48
2.2.7. Иммунопреципитация хроматина 50
2.2.7.1. Растворы: 50
2.2.7.2. Методика 51
3. Результаты исследований 54
3.1. Подавление активности днк-топоизомеразы ii приводит к образованию двухцепочечных разрывов ДНК 54
3.1.1. Обработка клеток этопозидом приводит к образованию ДЦР . 54
3.1.2. Количество ДЦР зависит от концентрации этопозида 57
3.1.3. Индуцированные monollДЦР эффективно репарируются 57
3.2. Роль ядерного матрикса в репарации дцр, индуцированных ДНК-топоизомеразой 60
3.2.1. Индуцированные этопозидом фокусы гистона уН2АХассоциированы с ядерным матриксом 60
3.2.2. Участки кластеризации то чек разрыва (Ьсг) ассоциированы с ядерным матриксом 64
3.3. Негомологичное соединение концов днк, как механизм хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой
3.3.1. Цитологический подход 66
3.3.2. Молекулярно-биологический подход 69
3.3.2.1. Выбор геномной модели 693.3.2.2. Контрольные эксперименты 71
3.3.2.3. Иммунопреципитация хроматина 74
4. Обсуждение результатов 77
Выводы 83
Список литературы
- Незаконная рекомбинация и хромосомные перестройки
- Химические реактивы
- Обработка клеток этопозидом приводит к образованию ДЦР
- Негомологичное соединение концов днк, как механизм хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой
Введение к работе
Уже достаточно давно в химиотерапии различных опухолей используются ингибиторы ДНК-топоизомеразы II, и нередки случаи, когда использование этих препаратов приводит к развитию вторичных лейкозов, в основе которых лежат те или иные хромосомные перестройки (Auxenfants et al., 1992; Super et al., 1993). Известно также, что обработка клеток высших эукариот ингибиторами топоизомеразы II (например, этопозидом или амсакрином) может приводить к возникновению таких перестроек, как делеции, инсерции и транслокации (Maraschin et al., 1990; Shibuya et al., 1994). Более того, показано, что топоизомераза II обладает межмолекулярной ДНК-лигазной активностью и может осуществлять незаконную рекомбинацию ДНК in vitro (Gale, 1992). Не менее важным нам представляется тот факт, что образование ковалентных комплексов топоизомеразы и ДНК, вызванное подавлением лигирующей активности топоизомеразы II, может приводить к запуску систем репарации двухцепочечных разрывов ДНК. В клетках эукариот существуют два основных пути репарации ДЦР: гомологичная рекомбинация, играющая большую роль в клетках низших эукариот, и негомологичное соединение концов ДНК (NHEJ, non-homologous end joining). Существует множество косвенных данных о том, что именно NHEJ является основным механизмом репарации ДЦР, индуцированных топоизомеразой II (Adachi et al., 2003; Adachi et al., 2004).
Известно, что транслокации, ассоциированные с развитием некоторых лейкозов, имеют характерную черту - точки разрыва сосредоточены в достаточно узких участках генома, названных кластерами точек разрыва (bcr, breakpoint cluster region). Во многих из этих участков обнаружены сайты гиперчувствительности к
ДНКазе I и топоП. Ранее было показано, что основной мишенью ингибиторов топоизомеразы II является нерастворимая форма фермента, связанная с ядерным матриксом и взаимодействующая с участками прикрепления ДНК к матриксу. Исходя из представленных данных логично предположить, что связанная с ядерным матриксом топоизомераза может играть важную роль в запуске систем репарации ДЦР, в результате действия которых возможно появление различных транслокаций.
Настоящая работа посвящена определению и изучению механизма возникновения хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой II. Отдельное внимание уделяется роли ядерного матрикса в этом процессе.
Незаконная рекомбинация и хромосомные перестройки
Двухцепочечные разрывы в ДНК могут образовываться под влиянием как экзогенных, так и эндогенных факторов. Примерами экзогенных агентов являются ионизирующее излучение, которое напрямую приводит к разрывам и другим повреждениям ДНК, или, например, некоторые противораковые препараты, которые вызывают двухцепочечные разрывы вследствие ингибирования лигирующей активности топоизомеразы II (Morgan et al., 1998; Olive, 2000). Эндогенные клеточные процессы, приводящие к ДЦР, включают окислительный метаболизм, продуцирующий свободные радикалы, блокирование репликативной вилки или механический стресс, наконец, запрограмированные хромосомные перестройки в специфических тканях, такие как V(D)J- или мейотические рекомбинации (Schar, 2001; Sekiguchi & Alt, 1999). Как правило, образуются "ступенчатые" разрывы. В ядре они могут претерпевать различные изменения. Так, если образовался 5 -выступающий двухцепочечный разрыв, то он может процессироваться 5 — 3 экзонуклсазами или ДНК-пол имеразой, приводя, соответственно, к делеции или дупликации (Elliott & Jasin, 2001).
Повреждённые ядра долгое время рассматривались просто как "мешок разорванных хромосом", где возможно свободное движение оборванных концов и воссоединение со случайно встреченным партнёром. На самом деле, существование прикреплённых к ядерному матриксу хроматиновых доменов и хромосомных территорий (см раздел 1.1). предполагает довольно ограниченное движение хроматина.
У всех организмов существуют системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Если разрыв не ликвидируется, то это ведёт к утрате всех генов, теломерных к точке разрыва, что, как правило, летально для организма (Philip & Pedersen-Bjergaard, 1988; Nakanishi et al., 1999; Geary et al., 2001). С помощью гомологичной рекомбинации (HR, homologous recombination) разрыв репарируется очень точно, но такой способ репарации играет центральную роль только для сохранения целостности маленьких геномов. У низших эукариот, таких как дрожжи или Trypanosoma brucei, HR доминирует над незаконной рекомбинацией, называемой таюке негомологичным соединением концов ДНК (NHEJ, non-homologous end joining). При повышении сложности организма соотношение смещается в сторону NHEJ. Так, у Dictyostelium отношение HR к NHEJ составляет 1:5, а у млекопитающих - 1:1000 (Taylor & Lehmann, 1998). Однако, недавно было показано, что HR является не менее важным путём репарации ДЦР и у высших эукариот, и то, какой путь будет реализовываться, зависит от природы двухцепочечных разрывов, особенностей клеточного цикла и стадии развития клетки. В общем, можно сказать, что HR и NHEJ являются конкурирующими путями репарации двунитевых разрывов (Couedel et al., 2004).
Репарация двунитевых разрывов с помощью HR требует присутствия оригинальной последовательности, которая была представлена до внесения разрыва. В качестве такой последовательности может выступать участок сестринской хроматиды, который служит шаблоном для репарационного синтеза ДНК (см обзоры Sung & Klein, 2006; Wyman et al., 2004). Если же ДЦР репарируются с помощью NHEJ, происходит объединение тех концов ДНК, которые просто оказались сближенными, при этом происхождение концов не учитывается. В результате такого объединения нередко происходят хромосомные перестройки, в том числе транслокации (Richardson & Jasin, 2000; Rothkamm & Lobrich, 2002; Kuhne et al., 2002).
В узнавании и репарации ДЦР по механизму NHEJ принимает участие большое количество белков. Три белка являются компонентами ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK, DNA-dependent protein kinase) — это Ku70 (69 kDa) и Ku80 (83kDa), формирующие Ku комплекс соединяющий концы ДНК (Gravel et al., 1998), и каталитическая субъединица DNA-PK (DNA-PKcs). Ku-белки присоединяются к концам ДНК в месте разрыва, ремоделируя повреждённые концы и привлекая остальные факторы, участвующие в NHEJ. Анализ кристаллической структуры Ku-комплекса с ДНК показал, что гетеродимер имеет форму кольца, центральное отверстие в котором достаточно для размещения дуплекса ДНК (Walker et al., 2001; Zhang et al., 2001).
Химические реактивы
Реактивы общего назначения: NaCl, КС1, LiCl, MgCl2, CaCl2, CuS04, NaHC03, Na2HP04, NaH2P04, KH2P04, EDTA, EGTA, дезоксихолат Na, HEPES, PIPES, трис, додецилсульфат Na, борная кислота, бромистый этидий, Тритон Х-100, Tween 20, неионный детергент Р-40 (NP-40), этопозид (VP16), блеомицин, сахароза, параформальдегид, раствор формальдегида, бычий сывороточный альбумин (БСА), фенилметилсульфонилфторид, ДНК спермы лосося ("Sigma"), коктейль ингибиторов протеаз ("Roche"), конъюгированные с белком А магнитные шарики (protein A dynabeads, "Dynal").
Реактивы для культивирования клеток: среды RPMI 1640 и модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM); раствор Версена, раствор трипсина ("Панэко"); фетальная сыворотка теленка ("Hyclone"); антибиотики канамицин, ампицилин и стрептомицин; пируват натрия; глутамат натрия ("Sigma") Ферменты: дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I, "Sigma"), нуклеаза микрококков ("Fermentas"), Taq-полимераза ("Fermentas", "Силекс"), протеиназа К ("Sigma"). Наборы: набор для выделения и очистки ДНК Gel Extraction/PCR Purification Kit ("Qiagen"), набор для выделения геномной ДНК GenElute Mammalian Total DNA Miniprep Kit ("Sigma").
Линии человеческих клеток К562, Неї и Jurkat культивировали в среде RPMI 1640 с 10%-ной фетальной сывороткой теленка. Линию клеток HeLa, культивировали в модифицированной Дульбекко среде Игла с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка. Для обработки этопозидом или,, блеомицином использовали клетки в экспоненциальной стадии роста. Перед обработкой клетки промывали свежей средой. В ряде экспериментов клетки HeLa облучали жестким у-излучением (l37Cs).
После обработки этопозидом или блеомицином клетки К562 собирали центрифугированием (800 g) и ресуспендировали в среде без сыворотки (14 х 106 клеток/мл). Затем клетки смешивали с равным объемом 2%-ной легкоплавкой агарозы, после чего 100 мкл этого раствора помещали в специальные заливочные блочки. После застывания агарозы блочки, содержащие клетки, инкубировали 24 ч при 56С в лизирующем буфере (0.2 M EDTA, 1% додецилсульфата натрия (SDS) , 0.5 мг/мл протеиназы К). Затем блочки промывали 4-5 раз в буфере ТЕ (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ EDTA, рН 8) при комнатной температуре и использовали для проведения гель-электрофореза в пульсирующем поле. ДНК разделяли в 1%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в 0.5х буфере ТВЕ (їх ТВЕ: 89 мМ Трис, 89 мМ борной кислоты и 2 мМ EDTA, рН 8) при напряженности поля 6 В/см с временем пульса, меняющимся от 10 до 90 с, в течение 18 ч при 14С. Гели окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл, 30 мин).
Для приготовления препаратов ядерных матриксов in situ использовали . клетки HeLa, выращенные на покровных стеклах. Клетки промывали 2 раза буфером ТМ (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 3 мМ MgCb) и затем инкубировали" 10 мин на льду в буфере для вскрытия (10 мМ PIPES, рН 7.8, 0.5%-ный Тритон Х-100, 100 мМ NaCl, 0.3 М сахароза, 0.2 мМ фенилметилсульфонилфторид и 3 мМ MgCb). Затем клетки промывали 3 раза буфером ТМ и обрабатывали ДНКазой I (1 мкг/мл) ("Sigma") в течение 30 мин при 37С. После этого буфер, содержащий ДНКазу, удаляли, клетки инкубировали 30 мин на льду в буфере ТМ с добавлением 0.5 М раствора хлорида натрия. Полученные таким образом ядерные матриксы промывали дважды буфером ТМ, фиксировали 30 мин 4%-ным параформальдегидом при комнатной температуре и использовали для иммуноокрашивания.
Клетки К562 и Jurkat осаждали на предметные стекла с помощью центрифуги Cytospin ("Shandon") (800 об/мин, 5 мин), а клетки HeLa выращивали на покровных стеклах. Клетки фиксировали 4%-ным параформальдегідом в течение 20 мин при комнатной температуре, промывали 3 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером (PBS, 7 мМ Na2HP04, 1.5 мМ КН2Р04, 137 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1), пермеабилизировали 1%-ным раствором Тритона Х-100 и снова промывали PBS. Затем стекла с иммобилизованными клетками инкубировали в 1%-ном растворе БСА (бычий сывороточный альбумин) в течение 1 ч (для подавления неспецифической сорбции антител), после чего проводили инкубацию (90 мин при комнатной температуре) с первичными антителами. Клетки промывали 3 раза по 5 мин PBS с добавлением 0.2% БСА и 0.05% Tween 20. Первичные антитела выявляли антителами против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированными с А1еха488 и АІехабЗЗ соответственно. ДНК окрашивали флуоресцентными красителями DAPI (4,6-диамино-2-фенлиндолом) либо То-Рго 3 йодидом ("Molecular Probes"). Препараты анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Leica DRMB и сканирующего конфокального микроскопа Leica TCS.
Обработка клеток этопозидом приводит к образованию ДЦР
Индуцированные этопозидом фокусы гистона уН2АХ ассоциированы с ядерным матриксом. Как уже говорилось выше, скелетная структура, которая сохраняет общую форму клеточного ядра после удаления основной массы ДНК и связанных с ней белков называется ядерным матриксом. В составе ядерного матрикса остаются фрагменты ДНК, прочно связанные с белковым скелетом и устойчивые к действию высоких концентраций солей и нуклеаз (так называемые фрагменты прилежащей к ядерному матриксу ДНК). Основной функцией, приписываемой этим последовательностям, является образование, поддержание и регуляция петлевых доменов интерфазного хроматина. Поскольку основной мишенью ингибиторов топоІІ является топоизомераза II ядерного матрикса (так называемая нерастворимая форма ДНК топоизомеразы II) (Femandes & Catapano, 1995), вполне логично было предположить, что индуцированные этопозидом ДЦР будут возникать преимущественно в участках ДНК, ассоциированной с ядерным матриксом. Для проверки этого предположения мы проводили иммуноокрашивание антителами против гистона уН2АХ препаратов так называемого «in situ ядерного матрикса» (Staufenbiel & Deppert, 1984; Chaly et al., 1985). Согласно классической методике, при получении ядерных матриксов используют экстракцию обработанных нуклеазами ядер 2М раствором NaCl. Понятно, что такая обработка приведет к удалению всех пистонов, в том числе и уН2АХ. По-этому мы получали ядерные матриксы с использованием более «мягкой» экстракции 0.5 М NaCl. Эта экстракция удаляет гистон HI, что обеспечивает возможность солюбилизации отщепившихся фрагментов хроматина. В то же время гистоны нуклеосомного ядра («кора») остаются связанными с ДНК (Rzeszowska-Wolny et al., 1988).
Вопрос о том, остаются ли фокусы уН2АХ связанными с ядерным матриксом после удаления большей части хроматина ( 80%), анализировали с использованием ядерных матриксов, приготовленных in situ, из клеток, обработанных ингибитором топоІІ. Клетки HeLa для получения ядерных матриксов in situ выращивали на покровных стеклах, пермеабилизировали и обрабатывали ДНКазой I. После этого проводили экстракцию раствором 0.5 М хлорида натрия. В ядерных матриксах с помощью иммуноокрашивания выявляли уН2АХ. в которых ДЦР индуцировали у-излучением. Иммуноокрашивание клеток и ядерных матриксов после облучения клеток дозой в 8 Гр (рис. 6) выявило образование в клетках примерно такого же количества фокусов уН2АХ, как и стандартная обработка этопозидом (10 мкг/мл, 1 ч). При этом оказалось, что ничтожно малая часть фокусов уН2АХ, сформировавшихся в ответ на у-излучение, оставалась связанной с ядерным матриксом (рис. 6). Таким образом, можно говорить о том, что индукция ДЦР в ответ на обработку клеток ингибиторами топоП носит достаточно специфичный характер и происходит в основном в участках ДНК, ассоциированых с ядерным матриксом.
Известно, что транслокации, ассоциированные с развитием некоторых лейкозов, имеют характерную черту - точки разрыва сосредоточены в достаточно узких участках генома, названных кластерами точек разрыва (breakpoint cluster region, bcr). В настоящее время выявлено уже достаточно много таких горячих точек рекомбинации, однако, наиболее хорошо изучены три из них в гене А МЫ - партнере гена ЕТО по транслокациям (в частности, реципрокной 1(8;21)). Нам представлялось интересным определить, взаимодействуют ли эти участки с ядерным матриксом. С этой целью мы использовали полуколичественный ПЦР-анализ. На рис. 7 показано относительное содержание различных участков гена А МЫ (ЬсгЗ и нескольких удаленных транскрибируемых участков) в суммарной ДНК и во фракции ДНК ядерного матрикса. Для ПЦР-амплификации мы использовали одинаковое количество ДНК из обеих фракций. Совершенно очевидно, что обогащение фракции ДНК ядерного матрикса происходит только фрагментом, соответствующим ЬсгЗ гена AML1. Это свидетельствует о том, что горячие точки рекомбинации (по крайней мере, в гене AML1) взаимодействуют с ядерным матриксом.
Несмотря на то, что вопрос о роли ингибиторов топоП в индукции хромосомных перестроек (и, соответственно, вторичных лейкозов) изучается уже достаточно давно, до сих пор не вполне ясно какой молекулярный механизм (-ы) задействован в этом процессе. К моменту начала данной работы в научной литературе существовало некоторое количество косвенных указаний на возможное участие в этих процессах системы негомологичного соединения концов ДНК (non-homologous end joining, NHEJ) (Adachi et al., 2003; Adachi et al., 2004). Поскольку, нам уже было известно, что, подавление активности топоП с одной стороны приводит к индукции ДЦР, причем разрывы возникают преимущественно в участках ДНК, ассоциированных с ядерным матриксом (см. предыдущий раздел), а с другой стороны - может привести к хромосомным перестройкам, лежащим в основе вторичных (ассоциированных с химиотерапией опухолей ингибиторами топоП) лейкозов (Maraschin et al., 1990; Shibuya et al., 1994), оставалось только соединить эти два этапа в логическую цепочку. Как уже говорилось выше, наиболее вероятным кандидатом на роль своеобразного мостика является именно механизм репарации, основанный на негомологичном соединении концов ДНК. Дальнейшие наши исследования были направлены на то, чтобы проверить это предположение, что было сделано с использованием различных методических подходов. Среди белков, участвующих в NHEJ, наиболее изучены Ки70/80, каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs), ДНК-лигаза IV, ее кофактор XRCC4, а также ДНК-полимераза ц и полинуклеотидкиназа/фосфатаза. На этом этапе работы мы решили проверить возможность колокализации основных компонентов системы незаконной рекомбинации ДНК (таких как Ku80, DNA-PKcs, ДНК-лигаза IV) с фокусами гистона уН2АХ, индуцированными путем подавления в клетках активности топоІІ. В первую очередь, мы провели серию .опытов по двойному иммуноокрашиванию клеток, обработанных этопозидом, антителами против уН2АХ и антителами против каждого из перечисленных выше белков (Рис. 8). Как видно из рисунка, мы не обнаружили какой-либо существенной кластеризации и/или перемещения к местам ДЦР белков Ku80, DNA-PKcs, ДНК-лигазы IV, после индукции разрывов ДНК. Флуоресцентная окраска ядра антителами против этих белков носит сплошной характер, что, по-видимому, связано с их многофункциональностью, так как помимо собственно репарации эти белки участвуют во множестве других процессов, что и приводит к их накоплению в ядре.
Негомологичное соединение концов днк, как механизм хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой
ДНК-топоизомеразы - ферменты, позволяющие изменять топологию ДНК за счёт внесения разрывов в цепи ДНК. Такие разрывы сопровождаются образованием ковалентной связи между молекулой белка и одним из концов цепи ДНК. За время существования ковалентного комплекса топология ДНК меняется, после чего разрыв «зашивается», и ДНК высвобождается из промежуточного комплекса с ферментом. Обычно, комплексы топоІІ-ДНК короткоживущие, поскольку являются промежуточным продуктом ферментативной реакции. Однако, если их тем или . иным способом стабилизировать, то они могут стать причиной различных мутационных процессов. Существует две группы ингибиторов топоІІ: первую группу составляют каталитические ингибиторы, которые подавляют ферментативную активность топоІІ; вторую же составляют так называемые "яды" топоІІ - химические вещества, способные стабилизировать промежуточный комплекс топоІІ-ДНК. В химиотерапии различных злокачественных опухолей уже несколько десятилетий используются именно "яды" топоизомеразы II. В середине 1980-х гг впервые было выдвинуто предположение о взаимосвязи лечения пациентов с использованием ингибиторов топоІІ и развитием у этих больных вторичных лейкозов. Таким образом, история вопроса насчитывает примерно два десятка лет. В скором времени было обнаружено, что в основе вторичных лейкозов лежат различные хромосомные перестройки. Однако, несмотря на весьма активное изучение ассоциированных с лейкозами хромосомных перестроек, их молекулярный механизм оставался неясным до начала 2000-х гг. Чтобы пролить свет на эту проблему, ученым надо было лишь связать между собой два фактических наблюдения: подавление лигирующей активности топоІІ и возникновение хромосомных перестроек. Одной из первых была предложена гипотеза "обмена субъединиц" (Gale & Osheroff, 1992), которая предполагала обмен субъединицами двух димеров топоІІ на этапе религирования ДНК, в результате чего участок ДНК одной хромосомы лигировался с участком другой. Однако, не исключая возможности развития событий таким образом in vitro, все таки сложно себе сегодня представить, чтобы данный механизм "работал" в живой , клетке. На момент начала нашей работы наиболее вероятным механизмом возникновения индуцированных топоІІ хромосомных перестроек считался процесс репарации ДНК путем негомологичного соединения концов ДНК. На это указывал ряд косвенных факторов (Adachi et al., 2003; Adachi et al., 2004; Auxenfants et al, 1992; Super et al., 1993 ), однако прямых доказательств этому не существовало. С 2005 по 2007 г работами нескольких лабораторий (в том числе и нашей) в решении этой проблемы был достигнут определенный успех. В эти годы нами и нашими коллегами было показано, что процесс негомологичного соединения концов ДНК (незаконная рекомбинация) является механизмом большинства хромосомных перестроек, индуцированных ДНК-топоизомеразой II.
Первым весьма важным вопросом, который нам удалось решить, был вопрос, об узнавании ДЦР, возникших в результате подавления лигирующей активности топоІІ, клеточными системами мониторинга целостности геномной ДНК. Это действительно важно, поскольку ингибирование топоП приводит к образованию не ДЦР, а комплекса топоІІ-ДНК. Как уже говорилось выше, одним из первых событий в процессе узнавания и репарации ДЦР является фосфорилирование варианта гистона Н2АХ (уН2АХ). Мы использовали метод иммуноокрашивания клеток с помощью антител против уН2АХ, чтобы проследить кинетику возникновения ДЦР. Интересно, что кинетика возникновения разрывов, определенная с помощью иммунофлуоресценции, довольно существенно отличалась от кинетики, определенной с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле. Кроме того, мы показали, что этопозид, в отличие от блеомицина, индуцирует образование фокусов уН2АХ с некоторой задержкой. Все это, а также данные, полученные другими исследователями (Rogakou et al., 1999; , Riballo et al., 2004), позволяет предположить, что комплексы топоП и ДНК не могут непосредственно узнаваться клеточными системами, контролирующими целостность ДНК и, вероятно, необходимо некоторое время для того, чтобы привести такие ДЦР в распознаваемую форму. Очевидно, существуют определенные механизмы преобразования топоІІ-ДНК комплексов в распознаваемые ДЦР. Поскольку "яды" топоП всё еще активно используются в химиотерапии, изучение этих механизмов имеет и абсолютно практическое значение, так как может помочь найти способ уменьшить побочные эффекты топоП - специфичных антираковых препаратов.
Похожие диссертации на Пространственная организация ДНК в ядре и индуцированные ДНК-топоизомеразой II хромосомные перестройки
