Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 7
1.1. Хромосомные транслокации, ассоциированные с онкологическими заболеваниями 7
1.1.1. Незаконная рекомбинация 7
1.1.2. История изучения механизмов незаконной рекомбинации 8
1.1.3. Хромосомные транслокации и ассоциированные с ними заболевания 9
1.1.4. Семейства химерных белков 11
1.1.5. Гены-партнеры по хромосомным транслокациям и кластеризация точек разрыва ДНК 12
1.1.6. Механизм возникновения хромосомных транслокаций 15
1.1.7. Структура кластеров точек разрыва ДНК как предпосылка для образования хромосомных транслокаций 16
1.2. Двухцепочечные разрывы ДНК и их репарация 18
1.2.1. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК 18
1.2.1. ДНК-топоизомераза II и ее функции в клетке 21
1.2.2. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II как причина образования двухцепочечных разрывов ДНК 23
1.2.3. Ингибирование ДНК-топоизомеразы II как предпосылка для возникновения хромосомных транслокаций 25
1.2.4. Гипотезы возникновения хромосомных транслокаций 27
CLASS 1.3. Позиционирование хромосом в ядре и вероятность возникновения хромосомных транслокаций CLASS 31
1.3.1. Хромосомные территории 31
1.3.2. Пространственная близость хромосомных территорий способствует образованию транслокаций 32
1.3.3. Перемешивание хромосомных территорий 32
1.3.4. Современная модель организации хромосомных территорий 34
1.3.5. Релокализация геномных локусов внутри ядра. Роль ядерных моторных белков в этих процессах 36
Постановка задачи и методические подходы 41
II. Материалы и методы 42
II. 1. Материалы 42
П. 1.1. Клеточные линии 42
П. 1.2. Антитела 42
П. 1.3. Химические реактивы 42
П. 1.4. Программное обеспечение 43
11.2. Методы 44
П.2.1. Культивирование клеточных линий 44
11.2.2. Электрофорез в пульсирующем поле 44
11.2.3. Определение количества мертвых клеток 44
11.2 А. Иммуноокрашивание 45
11.2.5. Флюоресцентная гибридизация in situ (FISH) 45
П.2.5.1. Приготовление двумерных препаратов фиксированных клеток 45
IL2.5.2. Выделение бакмидной ДНК из клеток E.coli 45
И.2.5.3. Синтез пробы 46
П.2.5.4. Гибридизация 46
П.2.5.5. Приготовление трехмерных препаратов клеток Jurkat 47
П.2.5.6. Гибридизация с пробой Vysis 48
11.2.6. Компьютерная обработка изображений 49
11.2.7. Статистический анализ данных 49
П.2.8. Иммунопреципитация хроматина 50
П.2.8.1. Растворы 50
П.2.8.2. Методика 50
П.2.8.3. ПЦР в реальном времени с TaqMan-пробами 51
III. Результаты исследований 53
Піл. Анализ взаимного расположения генов aml1 и ето в культуре первичных эмбриональных фибробластов человека 53
Ш.2. Ингибирование лигирующей активности днк-топоизомеразы ii вызывает перемещение гена ето в направлении центра ядра 57
Ш.з. Ингибирование днк-топоизомеразы ii вызывает релокализацию гена ето в область ядрышка 61
Ш.4. Ингибирование днк-топоизомеразы ii приводит к предпочтительному связыванию нуклеолина с bcr2 гена ето 68
Обсуждение результатов 70
Выводы 78
Список цитируемой литературы
- История изучения механизмов незаконной рекомбинации
- Пространственная близость хромосомных территорий способствует образованию транслокаций
- Электрофорез в пульсирующем поле
- Анализ взаимного расположения генов aml1 и ето в культуре первичных эмбриональных фибробластов человека
Введение к работе
Лейкемии составляют 3% от общего числа всех онкологических заболеваний в мире. Четырьмя основными типами лейкемий являются острая лимфоцитарная лейкемия (ALL), хроническая лимфоцитарная лейкемия (CLL), острая мнелоидная лейкемия (AML) и хроническая миелоидная лейкемия (CML). Развитие острой миелоидной лейкемии обычно связывают с хромосомными перестройками, приводящими к возникновению химерных генов. Транслокация t(8;21)(q22;q22), объединяющая гены АМЫ и ЕТО, известна как одна из наиболее частых хромосомных транслокаций, наблюдаемых при острой миелоидной лейкемии. Ежегодно она диагносцируется в 40% случаев AML типа М2 (острая миелобластная лейкемия), а также сопровождает до 40% случаев детской AML, и вероятность ее возникновения практически не зависит от пола ребенка (Huret, 1997). Но особенно часто эта транслокация наблюдается при так называемых «обусловленных лечением» (treatment related) или вторичных лейкозах (t-AML). Исследования последних лет свидетельствуют о том, что во многих случаях к развитию вторичных лейкозов приводит противораковая химиотерапия «первичных» онкологических заболеваний, проводящаяся с использованием препаратов, специфически ингибирующих фермент ДНК-топоизомеразу II. ДНК-топоизомераза II является жизненно необходимым ферментом, так как катализирует топологические изменения в ДНК в ходе множества клеточных процессов, таких как сегрегация дочерних хромосом после завершения процесса репликации ДНК, транскрипция, рекомбинация и реорганизация хроматина. Именно поэтому при терапии онкологических заболеваний применяются препараты, ингибирующие ее активность и вызывающие гибель активно делящихся клеток. Вследствие сказанного представляется важным изучение механизмов возникновения хромосомных перестроек, возникающих вследствие ингибирования ДНК-топоизомеразы П. Знание этих механизмов должно не только внести существенный вклад в представления об организации и функционировании клеточного ядра, но и показать исследователям новые пути решения проблемы вторичных лейкозов.
История изучения механизмов незаконной рекомбинации
На сегодняшний день картированы кластеры точек разрыва во всех распространенных при лейкемии хромосомных транслокациях, таких как t(8;21), t(4;ll), t(9;ll), inv(16), t(15;17), t(12;21). t(l;19) и t(9;22). Данные кластеры расположены в строго определенных интронных районах соответствующих генов: АМЫ, ЕТО, MLL, AF4, AF9, CBFB, MYHI1, PML, RARA, TEL, Е2А, РВХ1, BCR и ABL. Кроме того, Ьсг в MLL, AML1 и ЕТО имеют наименьший уровень свободной энергии для раскручивания двухцепочечной ДНК, то есть являются «легкоплавкими». Также известно, что сильные in vivo сайты расщепления ДНК-топоизомеразой II и сайты гиперчувствительности к ДНКазе I обычно колокализуются друг с другом в большинстве Ьсг данных генов. S/MAR-элементы ассоципрованны с Ьсг в генах АМЫ, ЕТО, MLL, AF4, AF9, и ABL. То есть районы Ьсг - это открытые и, если можно так сказать, «хрупкие» участки хроматина. Логично предположить, что они уязвимы для действия генотоксичных и других агентов и, скорее всего, являются первоначальными точками внесения разрывов в ДНК. Но что может послужить причиной разрыва ДНК? Обратимся к структуре Ьсг. S/MAR-элементы, картированные в большинстве известных нам Ьсг, представляют собой участки, в которых хроматиновые петли прикреплены к ядерному матриксу (см. обзор Razin, 1999). Известно, что ядерный матрикс обладает рекомбиногенной активностью (Sperry et al., 1989). Одним из главных компонентов ядерного матрикса является ДНК-топоизомераза II (Berrios et al., 1985). Этот фермент способен осуществлять незаконную рекомбинацию in vitro, особенно в условиях подавления лигирующей активности фермента рядом ингибиторов (Charron & Hancock, 1991; Asami et al., 2002). Такие ингибиторы, в частности, этопозид (также известный как VP-16) и тенипозид широко применяются при химиотерапии раковых заболеваний. Однако, как было отмечено выше, лечение этими препаратами часто приводит к развитию вторичных лейкозов (Felix, 1998). Вероятно, лейкозогенные транслокации индуцируются разрывами, вносимыми в ДНК ДНК-топоизомеразой II в случае ее ингибирования. Такие разрывы могут быть некорректно соединены, результатом чего и служат различные хромосомные перестройки. Хотя в рамках данной модели конкретный механизм соединения негомологичных концов ДНК по большому счету не важен, последние данные свидетельствуют о том, что их соединение происходит посредством лигирования с участием одного из стандартных механизмов репарации таких повреждений (Elliott & Jasin, 2002). Подробнее на функциях ДНК-топоизомеразы II и ее ингибировании как предпосылке для образования хромосомных транслокаций мы остановимся в следующей главе настоящего обзора.
Также нельзя исключить участие в образовании хромосомных перестроек систем гомологичной рекомбинации. Однако имеется крайне мало свидетельствующих об этом экспериментальных данных. Описано лишь несколько транслокаций между гомологичными повторяющимися последовательностями, расположенными в разных генах (Ошю. 1992). Так или иначе, ключевую роль в образовании хромосомных перестроек, по всей видимости, играет негомологичная рекомбинация (Zhang & Rowley, 2006).
У всех живых организмов существуют системы репарации двухцепочечных разрывов ДНК. Если разрыв не ликвидируется, то это ведёт к утрате всех генов, расположенных в направлении теломеры от точки разрыва, что, как правило, летально для клетки (Philip & Pedersen-Bjergaard, 1988; Nakanishi et al, 1999; Cleary et al, 2001). Известно, что двухцепочечные разрывы ДНК могут репарироваться с участием механизмов гомологичной рекомбинацией (homologous recombination, HR) либо посредством негомологичного соединения концов ДНК (non-homologous end joining, NHEJ). С помощью гомологичной рекомбинации разрыв репарируется очень точно, но такой способ репарации в основном характерен для небольших геномов. У низших эукариот, таких как дрожжи или Trypanosoma brucei, HR доминирует над незаконной рекомбинацией (NHEJ). При повышении сложности организма соотношение смещается в сторону NHEJ. Так, у Dictyostelium отношение HR к NHEJ составляет 1:5, а у млекопитающих - уже 1:1000 (Taylor & Lehmann, 1998). Однако недавно было показано, что HR является не менее важным путём репарации двухцепочечных разрывов ДНК и у высших эукариот, и то, какой путь будет реализовываться, зависит от природы двухцепочечных разрывов, особенностей клеточного цикла и стадии развития клетки. Можно считать, что HR и NHEJ являются конкурирующими путями репарации двунитевых разрывов ДНК (Couedel et al, 2004).
Репарация двунитевых разрывов с помощью HR требует присутствия оригинальной неповрежденной последовательности в качестве матрицы для репарации разрыва. В качестве такой последовательности может выступать участок сестринской хроматиды, который и служит шаблоном для репарационного синтеза ДНК (см. обзоры Sung & Klein, 2006; Wyman et al., 2004). Если же двухцепочечные разрывы репарируются с помощью NHEJ, происходит объединение тех концов ДНК, которые просто оказались сближенными, при этом происхождение этих концов не учитывается. Следствием такого объединения нередко являются хромосомные перестройки, в том числе транслокации (Richardson & Jasin, 2000; Rothkamm & Lobrich. 2002; Kuhne et al, 2002).
Ферментативные системы, участвующие в репарации двухцепочечных разрывов ДНК, сегодня активно исследуются. В то время, как большинство репарирующих двухцепочечные разрывы белков участвуют специфично либо в HR либо в NHEJ, некоторые белки участвуют в реализации обоих путей: это MRE11/RAD50/NBS1(XRS2) комплекс, BRCA1, гистон Н2А.Х, PARP-1, RAD18, каталитическая субъединица ДНК зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs) и ATM. DNA-PKcs играет важную роль в NHEJ млекопитающих, но также участвует и в HR через сложную регуляторную сеть, которая может включать непрямое взаимодействие (crosstalk) с АТМ-киназой, и регуляцию посредством фосфорилирования, по меньшей мере, 12 белков-участников HR (Shrivastav et al, 2008).
Пространственная близость хромосомных территорий способствует образованию транслокаций
Более 120 лет назад Карл Рабл предположил, что хромосомы в интерфазном ядре организованы не случайным образом, а занимают определенные пространственные позиции. Почти век спустя в лаборатории Кремера было показано, что ультрафиолетовое облучение небольших участков интерфазных ядер приводит к разрушению дискретных участков хромосом (Cremer et al, 1982). Возникло предположение, что хромосомы внутри ядра не спутаны, а занимают определенные территории, названные впоследствии «хромосомными территориями». Эксперименты по гибридизации in situ с использованием проб, специфических к индивидуальным хромосомам, проведенные сразу в нескольких лабораториях, подтвердили предположение о том, что каждая хромосома занимает определенную зону внутри ядра (Borden & Manuelidis, 1988; Cremer et al, 1988; Pinkel et al, 1988). Было показано, что эти зоны имеют неслучайные консервативные в эволюции радиальные позиции (Cremer et al., 2001; Tanabe et al., 2002; Boyle et al., 2001; Bridger et al., 2000), в значительной степени не перекрываются и, по крайней мере, в клетках млекопитающих, гомологичные хромосомы обычно не располагаются рядом (Cremer et al., 2001). Выяснилось, что хромосомы, содержащие большое количество генов, как правило, лежат ближе к центру ядра, тогда как хромосомы с меньшим числом генов локализуются на его периферии (Croft et al, 1999; Boyle et ah, 2001). Такая упорядоченность в организации хромосом, предположительно, должна облегчать кооперацию между различными хромосомами в ходе различных процессов, таких как репликация, транскрипция и т.д. (Cremer & Cremer, 2001; Prada & Misteli, 2002).
Существование строгой корреляции между физическим размером хромосом и их ядерной позицией остается под вопросом (Croft et al., 1999; Cremer et al, 2001). К настоящему времени предпочтительные паттерны локализации определены и для отдельных генов (Roix et al., 2003). Известно, что предпочтительные позиции хромосом и генов нередко являются тканеспецифичными и зависят от типа клеток, они могут варьировать в зависимости от пролиферативного статуса или от транскрипционной активности генов (Parada et al., 2004; Bridger et al, 2000; Cremer et al., 2003). Механизмы, ответственные за изменение позиций хромосом и генов при изменении активности генома в большинстве случаев остаются неизвестными, равно как и механизмы, обеспечивающие позиционирование хромосомных территорий как таковое.
Пространственная близость хромосомных территорий способствует образованию транслокащш
На сегодняшний день известно, что локализация нескольких хромосом на одной и той же "ядерной орбите" существенно увеличивает вероятность рекомбинации между ними. Так, хромосомы 9 и 22, почти равные по генной плотности, расположены на одной "орбите", и транслокации между ними происходят сравнительно часто (Neves et al, 1999). В некоторых случаях специфичные хромосомы не просто находятся на общей ядерной орбите, а остаются ассоциированными друг с другом на протяжении всего клеточного цикла (или некоторых его фаз), что ещё более повышает вероятность рекомбинации между ними (Neves et al, 1999; Bartova et al, 2000). Таким образом, если два рекомбиногенных участка ДНК принадлежат соседним хромосомным территориям, то вероятность рекомбинации между ними существенно возрастает по сравнению с вероятностью рекомбинации между удаленными друг от друга участками генома.
Перемешивание хромосомных территорий
На сегодняшний день остается неизвестным, что определяет границы хромосомных территорий. Но достоверно известно, что хромосомные территории не являются строго обособленными, и хроматиновые фибриллы, находящиеся на поверхности хромосомных территорий, могут перемешиваться друг с другом (в англоязычной литературе это явление получило название "intermingling"). Так. известны примеры специфической ассоциации между локусами разных хромосом (Osborne et al., 2004; Spilianakis et al., 2005), которые свидетельствуют о взаимодействии хромосом для осуществления корректной экспрессии генов (Osborne et al. 2004; Tolhuis et al. 2002; Carter et al, 2002; Lee et al, 2005; Spilianakis & Flavell, 2004; Palstra et al, 2003). Например, было показано, что богатый генами участок ДНК длиной около нескольких миллионов п.н., включающий гены главного комплекса гистосовместимости класса II (major histocompatibility complex II, МНС II), в случае активации транскрипции выпетливается за пределы хромосомной территории (Volpi et al, 2000). Также известно, что такая активация транскрипции кластера генов МНС II интерфероном-гамма (IFN-y) вызывает увеличение вероятности колокализации данного локуса с другими хромосомами (Volpi et al, 2000). Причем предпочтительность такой ассоциации с определенными хромосомами свидетельствует о специфичности, которая может либо являться следствием либо простого пространственного соседства соответствующих хромосом, либо отражать функциональную обусловленность ассоциации с конкретными локусами других хромосом (Branco & Pombo, 2006).
Локус генов НохВ представляет еще один пример подобного выпетливания генов из хромосомной территории, коррелирующего с их активацией (Chambeyron & Bickmore, 2004). Также выпетленный активированный локус НохВ демонстрирует повышенную частоту межхромосомных взаимодействий по сравнению с неактивным локусом, который контактирует преимущественно с другими локусами на той же хромосоме (Wurtele & Chartrand, 2006). Таким образом, поверхность хромосомной территории может быть увеличена посредством выпетливания ДНК в окружающее пространство и образования складок на поверхности территории (Cremer et al, 2006; Heard & Bickmore, 2007).
Выяснение положения активных генов по отношению к их хромосомным территориям является одной из целей изучения организации хромосом. Ранние сообщения, охватывающие небольшое число генов, предполагали, что они преимущественно располагаются на периферии хромосом (Kurz et al, 1996; Dietzel et al, 1999), в то время как анализ ядерной транскрипции с мечением транскриптов Br-UTP показал его включение по всей площади хромосомных территорий (Abranches et al, 1998; Verschure et al, 1999). Предполагается, что гены, находящиеся внутри хромосомной территории, снабжаются факторами транскрипции через специальные каналы, освобожденные от ДНК (Cremer et al, 2006).
В исследованиях нескольких групп генов, в частности, кластера генов НохВ, было показано, что выпетливанию хроматина из хромосомной территории сопутствует его деконденсация, необходимая для осуществления транскрипции и обеспечивающая «гибкость» выпетленного участка (Chambeyron & Bickmore, 2004). Однако выпетливание и деконденсация не всегда сопутствуют друг другу. Например, деконденсированные аллели локуса HoxD могут находиться в пределах хромосомной территории, и наоборот, вьшетленные локусы могут пребывать в конденсированном состоянии (Morey et al., 2007). Таким образом, выпетливание и деконденсация могут представлять собой два различных механизма регуляции экспрессии генов.
Значительную степень взаимного перемешивания соседних хромосом продемонстрировали и недавние исследования с использованием техники гибридизации in situ высокого разрешения с ультратонкими криосрезами клеток (cryo-FISH) (Guillot et al., 2004), а также модифицированного метода фиксации конформации хромосомы (chromosome conformation capture, 3С) (Branco & Pombo, 2006; Simonis et al, 2006). Интересно, что блокирование транскрипции нарушало характер этого перемешивания, не изменяя общего плана организации хромосомных территорий (Branco & Pombo, 2006).
Электрофорез в пульсирующем поле
Клеточную культуру первичных фибробластов человека растили в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM, Dulbecco s modified Eagles medium) с добавлением 10% фетальной сыворотки теленка, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (либо 200 мкг/мл канамицина). Клеточную линию эритролейкемии человека Jurkat выращивали в среде RPMI 1640 с 10% фетальной сыворотки теленка, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (либо 200 мкг/мл канамицина). Культивирование вели при 37С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислоты. Плотность клеточной суспензии поддерживали в пределах 0,2—3 млн/мл. Плотность прикрепленной культуры оценивали визуально.
В экспериментах использовали клетки в экспоненциальной стадии роста, прошедшие 3-4 пассажа после размораживания. Электрофорез в пульсирующем поле. После обработки этопозидом клетки HEF 1698 снимали с чашек Петри 1% раствором трипсина, собирали центрифугированием (800 g) и ресуспендировали в среде без сыворотки (14 х 10 клеток/мл). Затем клетки смешивали с равным объемом 2%-ной легкоплавкой агарозы, после чего 100 мкл этого раствора помещали в специальные заливочные блочки. После застывания агарозы блочки, содержащие клетки, инкубировали 24 ч при 56С в лизирующем буфере (0,2 М ЭДТА, 1% додецилсульфата натрия (SDS), 0,5 мг/мл протеиназьт К). Затем блочки промывали 4-5 раз в буфере ТЕ (10 мМ Трис-НС1, 1 мМ ЭДТА, рН8.0) при комнатной температуре и использовали для проведения гель-электрофореза в пульсирующем поле. ДНК разделяли в 1%-ном агарозном геле. Электрофорез проводили в 0,5х буфере ТВЕ (IxTBE: 89 мМ Трис-НС1, 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА, рН8,0) при напряженности поля 6 В/см с изменяющимся временем пульса (от 10 до 90 с), в течение 18 ч при 14С. Гели окрашивали бромистым этидием (1 мкг/мл, 30 мин).
Определение количества мертвых клеток
Семь частей суспензии клеток смешивали с одной частью 0.4% раствора трипанового синего (Gibco), выдерживали в течение 10 мин и выявляли клетки, окрашенные в синий цвет, с помощью светового микроскопа.
Иммун о окрашивание
Клетки HEF 1698 выращивали на предметных стеклах, а клетки Jurkat осаждали на покровные стекла с помощью BD Cellak, в соответствии с инструкцией производителя (BD Biosciences). Клетки фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида в течение 20 мин при комнатной температуре, промывали 3 раза по 5 мин фосфатно-солевым буфером (PBS, 7 MMNa2HP04, 1,5 мМ КН2Р04, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КС1), пермеабшшзировали 1%-ным раствором Тритон Х-100 и снова промывали PBS. Затем стекла с иммобилизованными клетками инкубировали в 1%-ном растворе БСА (бычий сывороточный альбумин) в течение 1 часа (для подавления неспецифической сорбции антител), после чего проводили инкубацию (90 мин при комнатной температуре) с первичными антителами. Клетки промывали 3 раза по 5 мин PBS с добавлением 0,2% БСА и 0,05% Tween 20. Первичные антитела выявляли антителами против мышиных и кроличьих иммуноглобулинов, конъюгированными с Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 594, либо с Alexa Fluor 633. ДНК окрашивали флюоресцентными красителями DAPI (4,6-диамино-2-фенлиндолом) либо Sytox Green (Molecular Probes). Препараты анализировали с помощью флюоресцентного микроскопа Leica DRMB, либо лазерного сканирующего микроскопа Carl Zeiss LSM 510. Флюоресиентная гибридизаиия in situ (FISH) Приготовление двумерных препаратов фиксированных клеток
Фибробласты HEF1698, выращенные на предметных стеклах, пермеабшшзировали на льду в течение 10 минут буфером, содержащим 10 мМ PIPES, рН7,8, 0,5% Тритона X-100. 100 мМ NaCl, 0,3 М сахарозы, 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 3 мМ MgCb и 0,1мМ CuSC 4. Затем препараты промывали несколько раз буфером ТМ (50 мМ Трис-HCl, рН7,5, 3 мМ MgCb) и фиксировали при комнатной температуре в течение 20 мин. 4%-ным раствором параформальдегида, приготовленным на PBS с добавлением MgCli до концентрации 50мМ. После отмывания от фиксирующего раствора с применением PBS, препараты обезвоживали путем проведения через серию разведений этилового спирта, концентрация которого плавно повышалась с 70% до 96%. Далее стекла высушивали на воздухе и хранили при 4С.
Выделение бакмидной ДНК из клеток E.coli
Клетки E.coli, несущие бакмиды ВАС RP1-140K16 и ВАС RP11-777J24 (CHORI ВАСРАС Resources Center), растили в течение 16 ч при 37С в 10 мл среды LB (1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 12,5 мкг/мл хлорамфеникол). Клетки осаждали центрифугированием в течение 7 мин при 3200g при комнатной температуре.
Осадок ресуспендировали в 300 мкл буфера GTE (50 мМ глюкоза, 25 мМ Трис-НС1 (рН8,0), 10 мМ ЭДТА), добавляли 600 мкл раствора для лизиса клеток (0,2 М NaOH, 1% SDS), аккуратно перемешивали, затем добавляли 500 мкл 7,5 М ацетата аммония и инкубировали во льду 10 мин. Раствор после инкубации центрифугировали в течение 20 мин (12000g) при комнатной температуре, супернатант переносили в чистые пробирки и центрифугировали так же в течение 10 мин. После этого супернатант смешивали с 700 мкл изопропанола, и центрифугировали в течение 20 мин (12000g) при комнатной температуре. Осадок ДНК промывали 500 мкл 70% этанола, и центрифугировали раствор так же в течение 5 мин. Осадок растворяли в 100 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис (рН8,0), 1 мМ ЭДТА), добавляли РНК-азу А до концентрации 100 мкг/мл и икубировали 30 мин при 37С. К раствору добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия, 3 объема 96% этанола и выдерживали 20 мин при -20С. Далее проводили центрифугирование в течение 15 мин (12000g) при комнатной температуре, осадок ДНК промывали 70% этанолом и центрифугировали раствор в течение еще 5 минут. Полученный осадок растворяли в 100 мкл 10 мМ Трис-HCl (рН7,5) и хранили при -20С.
Синтез пробы
Синтез пробы для визуализации генов AML1 и ЕТО осуществляли методом построения цепи на случайной затравке (random prime), либо методом ник-трансляции в присутствии модифицированного биотином (biotin-11-dUTP) либо дигоксигенином УТФ (digoxigenin-11-dUTP) с использованием наборов Roche и в соответствии с инструкцией производителя. В качестве матрицы использовали бакмиды ВАС RP1-140K16 и ВАС RP11-777J24 (CHORI), соответственно.
Гибридизация
Перед гибридизацией препараты клеток обрабатывали в течение 30 минут РНК-азой А (100 мкг/мл в 2xSSC), затем в течение 10 минут 0,01%-м раствором пепсина в ЮмМ НС1 при 37С, 10 минут фиксировали в 1%-м растворе параформальдегида на PBS с 50мМ MgCb и проводили через серию спиртов с концентрацией этанола 70%, 80% и 96%.
Гибридизационная смесь содержала 65% формамида, 2х SSC, 10% сульфата декстрана, 0,1% Tween-20, 10 мкг Cotl ДНК человека (Sigma), 2 мкг дрожжевой т-РНК и 25-50 нг меченой пробы. 5-10 мкл такой смеси наносили на стекла с фиксированными клетками, денатурировали и гибридизовали под покровным стеклом. Для денатурации ДНК, как в пробе, так и в препаратах, стекла прогревали в течение 4 минут при 72-75С. Гибридизацию проводили в течение ночи при температуре 37С во влажной камере.
Анализ взаимного расположения генов aml1 и ето в культуре первичных эмбриональных фибробластов человека
Обработка клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы II часто приводит к возникновению различных хромосомных аберраций, некоторые из которых ассоциированы с развитием лейкемий. Есть веские основания полагать, что хромосомные транслокации генерируются в результате некорректной репарации двухцепочечных разрывов ДНК (Agarwal et al, 2006; Elliott & Jasin, 2002; Kantidze et ah, 2006). Для того чтобы разорванные концы различных хромосом были некорректно соединены, они, в первую очередь, должны физически встретиться. Однако известно, что хромосомы во внутриядерном пространстве расположены не случайно (Boyle et al., 2001; Cremer & Cremer, 2001; Croft et al., 1999). Специфическое радиальное распределение хромосомных территорий должно накладывать определенные ограничения на мобильность большинства генов и, следовательно, на возможность транслокаций между ними (Taslerova et al.. 2003). Существует предположение, что предпочтительные сайты транслокаций предопределяются именно пространственными позициями хромосом и субхромосомных доменов внутри ядра (Nikiforova et al., 2000; Savage, 2000). В самом деле, в некоторых случаях партнеры по транслокациям располагаются в непосредственной пространственной близости (Lukasova et al., 1997; Roccato et al., 2005; Roix et al., 2003). Однако это не является общим правилом. Во многих случаях никакой корреляции между пространственной близостью партнеров по транслокациям и частотой возникновения соответствующих хромосомных перестроек не наблюдается (Gue et al., 2006). Для объяснения данного различия была предложена так называемая "breakage-first" (разрыв первичен) модель. В соответствии с данной моделью, разорванные концы хромосом могут мигрировать на большие расстояния внутри ядра в поисках партнеров для осуществления транслокации. Такая миграция на самом деле наблюдалась в ядрах, подвергнутых бомбардировке а-частицами (Aten et al., 2004). Авторами данной работы были получены косвенные свидетельства того, что перемещение разорванных концов хромосом осуществляется активно с участием актин-миозиновых моторов (Aten et al., 2004). Однако в других исследованиях были получены противоречащие этому результаты. Было показано, что разорванные концы хромосом сохраняют свою позиционную стабильность внутри ядра (Soutoglou et al., 2007).
Гены АМЫ и ЕТО, исследованные в настоящей работе, расположены в различных ядерных слоях. Тем не менее, транслокации между данными генами являются типичными для вторичных лейкозов, возникающих вследствие противораковой химиотерапии с применением препаратов, специфично ингибирующих ДНК-топоизомеразу II (а именно «топоизомеразных ядов»). Представляется очевидным, что для осуществления транслокации необходим физический контакт между данными генами. В связи с этим мы сделали предположение, что в условиях ингибирования активности ДНК-топоизомеразы II нормальная пространственная организация интерфазных хромосом в ядре может изменяться. Мы обнаружили, что расстояния между генами АМЫ и ЕТО в ядрах нормальных фибробластов человека меньше, чем можно было бы ожидать в том случае, если бы оба гена характеризовались случайным распределением во внутриядерном пространстве. Это может объясняться тем фактом, что локализация гена АМЫ (в силу пространственного позиционирования хромосомы 21) ограничена центральной областью ядра. Этой причины достаточно для того, чтобы расстояния между генами АМЫ и ЕТО не могли в значительной степени превышать длину радиуса ядра. Также мы продемонстрировали, что в условиях ингибирования лигирующей активности ДНК-топоизомеразы II, то есть в условиях, стимулирующих активацию репарации двухцепочечных разрывов ДНК по механизму негомологичного зашивания концов (NHEJ), (Kantidze et al., 2006), значительная часть гена ЕТО релокализуется в центральную часть ядра, то есть туда, где расположен ген АМЫ. Данный результат хорошо согласуется с первым предположением "breakage-first" модели и предоставляет разумное объяснение высокой частоты рекомбинаций между генами АМЫ и ЕТО. Интересно, что релокализация гена ЕТО в направлении центра ядра происходит предпочтительно в делящихся клетках. После обработки делящихся клеток этопозидом, около 50% сигналов, соответсвующих гену ЕТО, было обнаружено в том же ядерном слое, что 96% сигналов, соответсвующих гену АМЫ. Это может быть связано с тем фактом, что делящиеся клетки, в отличие от покоящихся, более чувствительны к последствиям ингибирования ДНК-топоизомеразы П. Механизмы, ответственные за релокализацию гена ЕТО остаются неизвестными. В связи с этим необходимо подчеркнуть, что распределение гена ЕТО по ядерным слоям является широким и практически равномерным, в силу чего в некоторой части клеток этот ген находится в одном ядерном слое с геном АМЫ вне зависимости от обработки клеток ингибиторами ДНК-топоизомеразы П. Пространственное распределение хромосомных территорий внутри ядра является, по всей видимости, скорее динамичным, нежели статичным (Spector, 2003). Поэтому наблюдаемый сдвиг распределения гена ЕТО в сторону бимодального распределения в реплицирующихся фибробластах, обработанных ингибиторами ДНК-топоизомеразы II, вполне может объясняться простой фиксацией арестованных промежуточных комплексов ДНК-топоизомеразы II и/или арестованных репликационпых вилок в центральной части ядра. Такая фиксация может являться следствием неслучайного распределения внутри объема ядра тех ферментов, которые вовлечены в процессинг промежуточных комплексов или в NHEJ. Другая возможность состоит в том, что арестованные промежуточные комплексы ДНК-топоизомеразы II могут активно перемещаться в направлении центра ядра. Подавление данного перемещения в присутствии БДМ, ингибитора ядерного миозина (Aten et al., 2004), эту гипотезу поддерживает. К сожалению нам не удалось проверить, нарушается ли перемещение гена ЕТО вследствие деполимеризации актина, поскольку обработка клеток цитохалазином Б (cytochalasin В) либо латрункулином Д (latrunkulin D) приводила к радикальному изменению формы клеток и ядер. Итак, полученные нами результаты согласуются с моделью "breakage-first", постулирующей, что поврежденные участки разных хромосом, локализованные в отстоящих друг от друга областях ядра, могут быть активно сближены, в результате чего становится возможным осуществление между этими участками реципрокных транслокаций.
В следующей серии экспериментов мы показали, что обработка фибробластов и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком. Здесь важно отметить, что высокий процент колокализации, наблюдаемый в случае фибробластов, может отчасти являться следствием простого наложения сигналов в двумерных препаратах, а не свидетельствовать о наличии прямого контакта гена ЕТО с ядрышком (см. пример на рис. 15Б2 фронтальный вид и вид слева). Для исключения такой возможности мы и исследовали объемные препараты клеток Jurkat, и это позволило нам избежать ошибок в определении взаимного расположения объектов в трехмерном пространстве. Тот факт, что обработка фибробластов и клеток Jurkat этопозидом приводит к увеличению частоты колокализации гена ЕТО с ядрышком, позволил нам предположить, что биологический смысл наблюдаемого нами перемещения гена ЕТО заключается именно в том, что оно обеспечивает сближение данного гена с ядрышком. Почему это может быть целесообразно для клетки?
Первое возможное объяснение состоит в том, что для того, чтобы начать репарацию разрыва, необходимо сперва удалить с ДНК арестованный промежуточный комплекс ДНК-топоизомеразы П. Как упоминалось выше ковалентные комплексы ДНК-топоизомеразы II с ДНК, разрушаются по «убиквитин/268 протеосома»-зависимому пути (Ogiso et al., 2000; Мао, 2001). А в 2005 году на примере SurvivindeltaEx3, нового сплайс-варианта белка Survivin, была впервые продемонстрирована возможность локализации данного белка и его быстрой деградации по «убиквитин/268 протеосома»-зависимому пути в ядрышке. Стало понятно, что такой механизм деградации белков может функционировать не только в цитозоле, ядре, эндоплазматическом ретикулуме или в лизосомах, но также и в wpbimKe(Song & Wu, 2005).
