Введение к работе
Актуальность темы исследования
Борьба с онкологическими заболеваниями представляет одну из наиболее
важных задач современной медицины. Высокоэффективными
химиотерапевтическими агентами, используемыми для борьбы с широким спектром онкологических заболеваний, являются яды ДНК топоизомеразы II (Nitiss J.L., 2009, Pommeir Y., et al, 2010).
Фермент ДНК топоизомераза II у высших эукариот отвечает за разделение дочерних молекул ДНК в процессе репликации, а также за снятие позитивной суперспирализации ДНК. В процессе работы фермент связывается с молекулой ДНК, вносит двунитевой разрыв, осуществляет транспорт другого участка ДНК через разрыв и затем восстанавливает целостность разрезанной молекулы (Nitiss J.L., 2009). Известно, что накопление двунитевых разрывов ДНК в клетке в конечном итоге приводит к ее гибели. Яды ДНК топоизомеразы II препятствуют религированию двунитевых разрывов, либо способствуют внесению новых разрывов ДНК топоизомеразой П. Высокая токсичность таких веществ по отношению к раковым клеткам основана на свойстве этих клеток активно делиться, что невозможно без высокого уровня репликативной активности и работы ДНК топоизомеразы П.
Несмотря на высокую эффективность ядов ДНК топоизомеразы II в качестве агентов, подавляющих рост опухолевых клеток, применение этих веществ может приводить к развитию так называемых вторичных онкологических заболеваний, как правило, лейкемий. Для лейкемий, развившихся после курса химиотерапии ядами ДНК топоизомеразы II, характерно наличие хромосомных перестроек (Felix С.А., 1998; McClendon А.К., Osheroff N., 2007). При возникновении таких перестроек происходит объединение фрагментов двух протоонкогенов, с образованием функционально активного слитого гена. Продукты слитых в результате образования перестроек генов способствуют процессу перерождения здоровых клеток в раковые. Считается, что перестройки образуются при ошибках репарации двунитевых разрывов, возникающих, в частности, при ингибировании активности ДНК топоизомеразы П. В клетках высших эукариот основной механизм репарации двунитевых разрывов - негомологичное соединение концов (Chapman J.R., 2012). Негомологичное соединение концов позволяет соединять концы разорванных молекул ДНК безотносительно их гомологии, принадлежности к той или иной хромосоме. Точность восстановления двунитевых разрывов обусловлена высокой скоростью данного механизма и сложной
пространственной организацией ядра высших эукариот, препятствующей свободной диффузии концов разрыва.
В ядрах клеток высших эукариот в интерфазе хромосомы занимают компактные, непересекающиеся области - хромосомные территории. Помимо хромосомных территорий, образованных хроматином одной хромосомы, в ядре выделяют ряд компартментов, где в непосредственной близости оказываются участки разных хромосом. Так, в образовании ядрышек принимают участие ядрышкообразующие центры, которые в геноме человека расположены на пяти различных хромосомах. Недавно было показано, что в околоядрышковой области располагаются многочисленные локусы всех хромосом (Nemeth А, Langst G, 2011). Другими компартментами, где в пространстве ядра могут встречаться фрагменты разных хромосом, являются транскрипционные фабрики - области, содержащие активно транскрибирующие РНК полимеразы и необходимые для транскрипции белковые факторы (Davidson S., et al., 2012).
В настоящее время механизм образования хромосомных перестроек активно исследуется с учетом пространственной организации ядра. Для образования хромосомных перестроек необходим физический контакт генов-партнеров. Было выдвинуто две гипотезы. Согласно первой, хромосомные перестройки возникают в ходе репарации двунитевых разрывов при ошибочном объединении изначально расположенных рядом друг с другом фрагментов негомологичных хромосом. Такая модель образования хромосомных перестроек известна как «гипотеза первенства контакта» (Savage J.R., 2000; Nikiforova M.N., et al., 2000). Альтернативой выступает «гипотеза первенства разрыва». Согласно данной гипотезе, в роли инициатора формирования перестройки выступает двунитевой разрыв ДНК. Далее концы разрыва перемещаются в пространстве ядра для поиска партнеров по репарации. Перестройки возникают при встрече и лигировании концов порванных негомологичных хромосом (Aten et al., 2004).
В ходе работы мы анализировали перемещения концов разорванного гена MLL, наиболее часто перестраивающегося гена при развитии вторичных лейкемий, опосредованных применением ядов ДНК топоизомеразы П. Двунитевые разрывы ДНК индуцировали этопозидом, широко применяемым при терапии онкологических заболеваний ядом ДНК топоизомеразы П. Расшифровка молекулярного механизма формирования онкогенных хромосомных перестроек в клетках, обработанных этопозидом, может показать пути снижения риска возникновения таких перестроек, а, стало быть, и риска возникновения вторичных лейкозов. Именно это и определяет актуальность данной работы.
Цель работы и экспериментальные задачи
Цель работы - проанализировать перемещения района локуса llq23, содержащего протоонкоген MLL, в ядрах лимфоидных клеток при ингибировании ДНК ядом ДНК топоизомеразы II этопозидом.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие экспериментальные задачи:
-
Подобрать условия ингибирования ДНК топоизомеразы II, при которых детектируются разрывы внутри гена МЕЕ.
-
Охарактеризовать радиальные распределения нормальных и разорванных аллелей гена МЕЕ при индукции двунитевых разрывов этопозидом.
-
Оценить частоту колокализации генов-партнеров по хромосомным перестройкам МЕЕ и AF9, AML1 и ЕТО при индукции двунитевых разрывов этопозидом.
-
Оценить частоту колокализации генов MLL, AML1, AF9, ЕТО и ядрышек при индукции двунитевых разрывов этопозидом.
-
Выяснить, могут ли аллели гена МЕЕ полностью или частично выходить за пределы собственной хромосомной территории при индукции двунитевых разрывов ДНК этопозидом.
Научная новизна работы
В ходе работы впервые определена доля аллелей MLL, разорванных в области BCR непосредственно в результате обработки клеток топоизомеразным ядом этопозидом. Впервые продемонстрировано, что инкубация обработанных этопозидом клеток в течение одного часа в среде без этопозида приводит к возрастанию количества визуально детектируемых разорванных аллелей МЕЕ. Впервые продемонстрировано, что концы разорванных аллелей гена МЕЕ приобретают повышенную подвижность внутри ядра, что выражается в изменении их радиальных позиций по сравнению с неповрежденными аллелями МЕЕ и в частом расположении разорванных аллелей МЕЕ за пределами собственной хромосомной территории. Продемонстрировано удвоение числа колокализации генов МЕЕ и AF9, а также AML1 и ЕТО при ингибировании ДНК топоизомеразы П.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на 4-ой международной конференции «The ЕМВО Meeting» (2012, Ницца, Франция), на 4-ой и 5-ой международных конференциях «Early events in Human Pathologies» (2011, Ереван, Армения; 2012, Литвянка, Байкал, Россия), на 37-ом международном конгрессе FEBS «From single molecules to Systems Biology» (2012, Севилья, Испания), на 19-ой международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (2012, Москва, Россия), на конгрессе гематологов России (2012, Москва, Россия).
Публикации по теме работы
По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 2 статьи в рецензируемых научных изданиях и 6 сообщений международных и российских конференций.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Цели и задачи», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Список цитированных источников». Работа изложена на 90 страницах, содержит 12 рисунков, 5 таблиц, в работе процитировано 120 источников.
