Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям белково-ігуклеішоиьіе юаимодейстаия лежат в основе регуляции процессов жизнедеятельности клетки, таких как репликация, репарация и транскрипция. Интенсивное развитие методов исследования ДНК-белковых комплексов и успехи сшгонуклеотидного синтеза обеспечивают широкие возможнссти для изучения механизмов этих взаимодействий и открывают практические перспективы направленного влияния на регуляцию клеточных процессов. Развитие наших предсгашіеїшй о структурном многообразии форм существования ДНК in vivo за последнее десятилетие предопределяет новый взгляд на многообразие механизмов специфических ДНК-белковых взаимодействий. С этим связан повышенный интерес к исследованию структуры белково-ігуклеиновьгхкомгтекоов, различньккшформаций ДНК, узнаваемых специфическими белками и реализующихся в переходных состояниях активных комплексов.
Эндонуклеазы рестрикции П-го типа узнают и расщепляют в ДНК определенные
ігуклеотиднью последовательности. Вместе с сопутствующими им метилгрансферазами,
эндонуклеазы рестрикции предстагшяют собой защитную систему, функции которой направлены
против проникновения в клетку чужеродной ДНК Помимо широкого прикладного значения, ОШI
являются прекрасными моделями для изучения ДНК-белковых взаимодействий. Несмотря на то,
что к настоящему моменту их выделено около 1.5 тысяч, подробно изучены лишь комплексы
ферментов ЕхШ и fboRV с субстратом. Обоснование принципов узнавания и расщеплен ДНК
ферментами рестрикции требует расширения круга исследуемых объектов.
Объектами нашего исследования явились эндонуклеазы рестрикции типа П:
ЕаШ и SsoU
_ ^ССПЗО. _ '''CCNGG...
„GGACC „GGNCC-
t Г
(стрелки указывают место расщепления, N - любой из четырех нуклеотидов), которые узнают аналогичные нуклеотидные последовательности с частично или полностью выражвснном центральной нукпеогидной парой соответственно. Эндонуклеаза рестрикции j5»RTI (RJroRII) выделена из штамма-отсргфодуценга Esdiaicliia сой B834/pSK323 (Косых с ссавт. 1980). Недавно было обнаружено, что этот фермент не гидролизует ггротяженные ДНКфаговТЗиТ7, содержаивю соответственно один и три участка узнавания БсоШ. Однако такое расщепление стимулируется добавлением 'чувствительных" к RfboRII ДНК (Крюгер с соавт., 1988; Пайн с соавт., 1991). Природа механизма активации оставалась невыяаЕнной. Эндонуклеаза рестрикции Ssott (К&юП) выделена из клеток Siigella sonrvi 47 (Никатьская с соавт., 1983). На кафедре химии природных соединений были получены первые данные о взаимодействии этого фермента с синтетическими субстратами: выявлены некоторые особенности стадии образования фермент-субстратного комплекса.
Целью настоящей работы явилось исследование механизмов узнавания и расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции JEboRTI и SsoU. В случае эндонуклеазы ЕсоШ предстояло изучить механизм стимулирования гидролиза ДНК исследовать природу этого эффекта, оценіггь
структурные детерминанты субстрата-активатора, описать кинетическую схему и установить стехиометрию ферметтгч}<5стратного комплекса. Особый интерес представляло сриаюнис структурных особенностей субстрата и активных комплексах с R/5x>RII и RSsoU с целью предложшъ молекулярные модели узиаиания и расщепления ДНК этими ферментами. Для решения поставленных задач мы использоиши широкий набор немодифиціїрованньїх и модифицированных аналогои субаратов различной длины.
Научная ношена и практическая ценность работы. На осиоизнии анализа субстратных сиоіісш ДІЧК-дуплексои различной длины с одним участком узнавания RixoRli и изучения и качестие активаторов широкого набора модифицированных и немедифицированных аналогов субстратов исследован механизм активации фермента RjEcoRH. Показано, что эффективность пшролиза RcoRlI уменьшается с увеличением длины одассайтового субстрата - эффект "ішпироианного сайта". Активация гидролша наблюдаггея только в присутствии расщепляющегося активатора, который, таким образом, является вторым субстратом. Обнаружено, что некоторые устойчивые к действию R»RI1 модифицироваштые ДНК-дуплексы начинают расщепляться в присутствии канонического субстрата. Описана кинетическая схема и разработан приближенный метод оценки кинетических параметров кооперативного шаимодейсшия RixoRII с двумя участками узнавания. Предложена модель симметричного активного комплекса эндонуклаиы firoRU ссубстратом, сотоятітот га двух су<лещтшщ белка ичегыг^тяжей ДНК
На основании заширования структуры ДНК в активном комплексе с R&sII показано, что кон(|юрмационная дестабилизация участка узнавания пртшодит к значительному увеличению эффективности (ійрмеїлативного гидролиза. Впервые для эндонуклеаз рестрикции Li-го типа в случ;с SaM обнаружена возможность направленного изменения специфичности расщепления при введет шив участок узі іавания этого фермента неїтутоіеотидньк вставок. Высказано предположа тис, что в активном комплексе с R-SdII ДНК ітаходится в "открытой" форме. Таким обратом, были продемонстрированы тірітнципиальньїе различия структуры ДНК в активных комплексах ферментов RjEcoRII и R&fl, подптерждаюшіїе исключительное разнообразие структурітьіх форм Д Н К при взаі шодействии с экдонуклеазами рестрикции типа П.
Ап]Х)бащія работы. Результаты работы докладывались на П-ом симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК' (ЗааБерлин, 1990), международттом симпозиуме "Сннтстнчиские оштготту'клеотиды; проблемы и перспективы практического использовшшя" (Москиа, 1991), конференции молодых ученых Межфакультетской проблемной НИЛ пмАН.Бглсоерского МГУ (Москва, 1991), 11-си Всесоюзном симпозиуме 'Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), международной конференции "Современная экзимология: проблемы и направления" (Санкт-Петербург, 1992), lV-ом симпозиуме New England Biolabs 'Эндонуклеазы рестрикции и метилтроноферазы: Структуры и механизмы" (Вермонт, США, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 работ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 162 страницах машинописно!!) текста и cccroTtr из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, эксперимет пальмой части, выводов, списка литературы (165 ссылок), содержит 25 рисунков и 6 таблиц.
