Введение к работе
Актуальность проблемы. Биологическое метилирование ДНК, осуществляемое ДНК-метилтрансферазами, является процессом, играющим важную роль в жизнедеятельности как прокариотических, так и эукариотических организмов. В прокариотических организмах ДНК-метнлтрансферазы входят в состав систем рестрикции-модификации и совместно с сопряженными эндонуклеазами осуществляют функцию защиты клетки от проникновения чужеродной ДНК. Акшвно изучаемые в настоящее время ДНК-метилтрансферазы типа II прокариотических организмов узнают короткие последовательности ДНК и катализируют перенос ме-тильной группы от кофактора - З-аденозил-Ь-метионина (AdoMet), донора че-тилыщй группы, на остатки аденина или цитозина узнаваемой последовательности ДНК, образуя Ыб-метиладенин, С5-метилцитозин или Ы4-метилцитозин. Наиболее хорошо изученным классом ДНК-метилтрансфераз являются С5-метилазы, для которых предложен общий механизм катализа, и для одного из ферментов имеются данные рентгеноструктурного анализа его комплекса с ДНК. При этом обнаружено полное выведение метилируемого остатка цитозина из состава двойной спирали Возможно, этот механизм является общим для всех ДНК-метилтрансфераз. Однако прямые экспериментальные данные о механизмах образования специфических ДНК-белковых контактов и о динамике переходных состояний пока отсутет-в\ют. Класс метилаз, метилирующих экзоциклические аминогруппы остатков цитозина (\;4-метнлазы), изучен крайне мало. Малоизученной является роль кофактора в регуляции взаимодействия метилаз с ДНК. Актуальной задачей является также разработка новых методов изучения взаимодействий метилаз с ДНК, позволяющих идентифицировать группы как в ДНК, так и в белке, отвечающие за образование дискриминационных ДНК - белковых контактов.
В настоящей работе изучались метилазы EcoRll (С5-метилаза) и М\а\ (N4-метнлаэа), которые узнают в ДНК одну и ту же пятизвенную последовательность 5'...CCVrGG...3' и метилируют внутренние остатки цитозина в этой последовательности. Молекулярные механизмы их взаимодействия с ДНК и строение фермент - субстратных комплексов являются практически не изученными.
Целью настоящей работы явилось выяснение особенностей узнавания ДНК метилазами W>RII (М.EcoRll) и Mval (M.Mval), зондирование возможных структурных перестроек субстрата при взаимодействии с этими ферментами, а также
разработка нового типа аналогов субстратов с реакционноспособными группами для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз.
Научная новизна и практическая ценность работы. На основании анализа данных по взаимодействию метилаз EcoRll и Мт\ с субстратами, содержащими модификации в различных положениях участка узнавания, выявлены некоторые группы атомов участка узнавания, необходимые для специфического взаимодействия M.EcoRU и M.Mval с ДНК. Установлено, что при взаимодействии с M.EcoRU и M.Mval двойная спираль ДНК участка узнавания претерпевает значительные структурные перестройки, направленные на обеспечение доступности остатка ци-тозина в процессе метилирования, но реализуемые в случае двух ферментов по-разному.
Для метилазы Mval показано, что роль кофактора в процессе взаимодействия с ДНК не ограничивается ролью донора метальной группы. В присутствии кофактора в большой степени повышается сродство ферментов к каноническим субстратам.
Предложен новый тип реагентов для аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз на базе ДНК-дуплексов, содержащих остаток 1-(Р-0-галактопирано-зил)тимина, цис-диольная группа которого превращается в реакционноспособную диальдегидную группу в процессе периодатиого окисления. Это впервые позволило вводить активную диальдегидную группу в заданные положения олигонуклеотидной цепи, входящей в состав ДНК-дуплекса - субстрата метилаз.
Показано, что метилазы способны специфично и с большими выходами ковалентно присоединяться к таким реакционноспособным аналогам субстрата.
Полученные результаты позволяют рекомендовать реагенты данного типа в качестве эффективного и гибкого инструмента для изучения широкого спектра ДНК-белковых взаимодействий.
В ходе работы была разработана оригинальная методика тестирования степени метилирования каждой из цепей ДНК-дуплекса, что позволило эффективно решать поставленные задачи.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ. Результаты работы были представлены на Ш-ем симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК" (Вильнюс, Литва, 1994), международном симпозиуме стипендиатов научного фонда Медицинского института
Говарда Хьюза стран Балтии, Центральной Европы и бывшего Советского Союза (Прага, Чешская республика, 1996), конференции FASEB "Ферменты, действующие на нуклеиновые кислоты" (Вермонт, США, 1996), Десятом симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Трест Касгл, Чешская республика, 1996).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на стра
ницах машинописного текста и содержит следующие разделы: обзор литературы
(посвящен механизмам функционирования ДНК-мстилтрансфераз типа И), обсуж
дение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( ссы
лок), содержит 15 рисунков и 8 таблиц.
