Введение к работе
Актуальность проблемы. Ферменты рестрикции-модификации (РМ) типа П с высокой специфичностью расщепляют (эндонуклеазы рестрикции) или метилируют (ДНК-метилтрансферазы) определенные короткие последовательности ДНК. Они выполняют функцию защиты прокариотической клетки от проникновения чужеродной ДНК. Со времени своего открытия ферменты РМ служат важнейшим объектом для изучения природы ДНК-белковых взаимодействий, прежде всего, ввиду своей уникальной специфичности. Особое значение имеет исследование прокариотических метилаз в качестве модельной системы для выяснения природы биологического метилирования ДНК, которое играет первостепенную роль в процессах транскрипции генов, канцерогенеза и др.
Объектами исследований в настоящей работе являются метилазы ЕсоКй (С5-метилаза) и Mval (М-метилаза), а также эндонуклеаза рестрикции ЕсоКй, которые узнают в ДНК одну и ту же пятизвенную последовательность 5'...lCCTGG ...3'. Метилазы ЕсоКП.
3'... GGACCT...5' (M..EcoWT) и Mval (M.MvaT) катализируют перенос метальной группы от кофактора S-аденозил-Ь-метионина на атомы углерода С5 (M.coRII) или на атомы азота N4 (M.MvaT) внутренних остатков цитозина в этой последовательности. Эндонуклеаза рестрикции соРЛ (R.EcoRTI) в присутствии ионов магния гидролизует фосфодиэфирные связи участка узнавания в положениях, указанных стрелками. Специфическое узнавание ДНК ферментами РМ включает образование контактов между аминокислотными остатками белков и гетероциклическими основаниями и фосфатными группами ДНК. Для метилаз ЕсоКК и Mval неизвестно, какие участки белков ответственны за специфическое узнавание ДНК. Для R.coRH сделана попытка определить участки связывания ДНК путем экстраполяции данных по связыванию с ДНК всех составляющих эндонуклеазу ЕсоКП. пептидов на полноразмерный белок (М.Рейтер и др. 1999). В отсутствие рентгеноструктурного анализа (РСА) этих ферментов существует сравнительно небольшое число методов, позволяющих определять участки в белках, взаимодействующие с ДНК. Эффективным методом является аффинная модификация ферментов модифицированными ДНК-дуплексами с последующим определением участков белков, образующих контакты с ДНК. Чаще всего для аффинной модификации ферментов используются ДНК-дуплексы, содержащие фотоактивируемые аналоги гетероциклических оснований. Перспективной является разработка методов аффинной модификации ферментов аналогами ДНК, содержащими активную группу в углеводофосфатном остове.
Диальдегидные производные нуклеозидов и нуклеотидов, а также тРНК, содержащие периодат-окисленные нуклеотидные остатки на 3'-конце, широко используются для аффинной модификации ферментов, кофакторами или субстратами которых являются нуклеозидтрифосфаты, и для тРНК-синтетаз соответственно. Однако для ДНК-связывающих белков такой метод не разработан.
Цель и задачи исследования. Целью работы является разработка нового метода аффинной модификации ДНК-метилтрансфераз и эндонуклеаз рестрикции на основе диальдегидсодержащих аналогов субстратов.
В работе решались следующие задачи: (1) конструирование и характеристика ДНК-дуплексов - аналогов субстратов ферментов РМ ЕсоКП. и метилазы Mval с направленно введенными альдегидными группами; (2) исследование субстратных свойств диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов и их способности специфически связываться с изучаемыми ферментами; (3) разработка реакции ковалентного присоединения диальдегидсодержащих аналогов субстратов к метилазам ЕсоКП и Mval и эндонуклеазе ЕсоКП; (4) зондирование участков метилаз ЕсоКП и Mval, взаимодействующих с ДНК.
Научная новизна и практическая ценность работы. Получены новые реагенты для аффинной модификации метилаз ЕсоВЛ и Mval и эндонуклеазы рестрикции ЕсоКП., содержащие реакционноспособную диальдегидную группу. Для введения диальдегидной группы в заданные положения ДНК-субстрата заменяли пиримидиновые нуклеозидные остатки на остатки 2'-0-Р-0-рибофуранозилцитидина (Crib') или l-((3-D-галактопиранозил)тимина (Tgal'), содержащие і/ис-диольную группу, с последующим окислением. Оптимизированы условия окисления олигонуклеотидов, содержащих остатки галактогшранозилнуклеозидов и дисахаридных нуклеозидов.
Эффективность метилирования и расщепления аналогов субстратов зависит от природы модифицированного остатка, содержащего диальдегидную группу, локализации этого остатка в ДНК-дуплексе и природы фермента. ДНК-дуплексы, содержащие окисленный остаток 2'-0-р-0-рибофуранозилцитидина (Crib), метилируются метилазами ЕсоКП и Mval лучше ДНК-дуплексов, содержащих окисленный остаток 1-(J3-D-галактопиранозил)тимина (Tgal), причем предпочтительной является локализация диальдегидной группы во фланкирующих нуклеотидных последовательностях по сравнению с участком узнавания. Эндонуклеаза ЕсоКП намного более чувствительна к введению диальдегидной группы в ДНК-дуплексы по сравнению с метилазами. Практически все диальдегидсодержащие дуплексы связываются с изучаемыми ферментами независимо от их способности метилироваться или расщепляться. Исключениями являются несколько Tgal-содержащих ДНК-дуплексов, которые не связываются с К.ЕсоКП.
Подобраны условия ковалентного присоединения диальдегидсодержащих ДНК-дуплексов к метішазам EcoRIl и Mval: соотношение ферментов и ДНК; концентрация восстановителя и время восстановления, необходимые для получения стабильного ковалентного комплекса. Показано, что Crib-содержащие ДНК-дуплексы стабильны в условиях ковалентного присоединения, а в случае ДНК-дуплексов, содержащих окисленный остаток галактозы, наряду с ковалентным присоединением к ферментам может происходить реакция расщепления модифицированной олигонуклеотидной цепи. Получен набор конъюгатов метилаз ЕсоКП и Mval с диальдегидсодержашими аналогами субстратов, и определены ковалентно связанные участки этих ферментов. Это позволило выявить остатки лизина, сближенные с углеводофосфатным остовом ДНК. Полученные данные являются первым экспериментальным зондированием ДНК-связывающих участков К4-метилаз (на примере Mval) и С5-метилазы ЕсоКП.
Полученные результаты позволяют рекомендовать диальдегидсодержащие реагенты для изучения взаимодействия различных ДНК-связывающих белков с углеводофосфатным остовом ДНК.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано б статей. Литературный обзор "Диальдегидсодержащие нуклеиновые кислоты и их компоненты: синтез, свойства, аффинная модификация белков" опубликован в журнале "Успехи химии" (1999). Результаты работы были представлены на 4-ом международном симпозиуме New England Biolabs "Биологическая модификация ДНК" (Инсбрук-Игле, Австрия, 1997), международных симпозиумах стипендиатов научного фонда Медицинского института Говарда Хьюза стран Балтии, Центральной Европы и бывшего Советского Союза (Варшава, Польша, 1997; Будапешт, Венгрия, 1998), 4-ом международном симпозиуме по изучению узнавания в нуклеиновых кислотах NACON-IV (Шеффилд, Великобритания, 1998), международной конференции "Биокатализ-98" (Пущино, Россия, 1998), ХШ-ом международном симпозиуме "Нуклеозиды, нуклеотиды и их биологическое применение" (Монпелье, Франция, 1998), 4-ой международной конференции по молекулярной биологии им. Энгельгардта (Москва-Санкт-Петербург, Россия, 1999).
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах
машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( цитируемых работ). Материал иллюстрирован рисунками и таблицами.
