Модифицированные ДНК-дуплексы с включениями тимидингликоля. Физико-химические свойства и взаимодействие с ДНК-узнающими белками Ян Фань

Введение к работе

Актуальность проблемы. ДНК в живых клетках непрерывно подвергается воздействию внешних факторов, таких, как ультрафиолетовый свет, ионизирующее облучение, агрессивные химические соединения. Во многих случаях в результате этих процессов возникают активные формы кислорода, которые атакуют ДНК, вызывая повреждения в углеводофосфатном остове или гетероциклических основаниях. Эти повреждения могут приводить к преждевременному старению организма, а также способствовать возникновению различных заболеваний, в том числе онкологических. Несмотря на наличие в клетке ферментов, направленных на удаление поврежденных нуклеозидов, полностью исключить влияние окислительных повреждений на функционирование клеточных белков невозможно. Одним из наиболее частых повреждений ДНК является окисление двойной связи тимидина с образованием 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидина (тимидингликоля, T^g). В недавних исследованиях методами спектроскопии ядерного магнитного разонанса (ЯМР) и рентгеноструктурного анализа (РСА) охарактеризованы свойства ДНК-дуплексов, содержащих T^g, динамика и стабильность двойной спирали et al, 1997; Brown et al, 2008; Aller et al, 2007]. Показано, что эти параметры существенными образом зависят от первичной структуры ДНК. В связи с этим, актуальным является исследование структурных и биологических последствий окисления тимидина на ДНК-моделях, в которых варьируется нуклеотидный контекст, окружающий модифицированный остаток. Важными задачами остаются разработка методов обнаружения остатка T^g в составе фрагментов ДНК, изучение влияния модифицированного нуклеозида на скорость формирования дуплексов, а также его роли в узнавании при формировании белково-нуклеиновых комплексов. На сегодняшний день накоплено много свидетельств того, что окисление тимидина имеет значительные последствия для функционирования клетки. В большинстве случаев удается наблюдать лишь конец цепи событий, первопричиной которых является появление единичного повреждения в ДНК. В последнее время предпринимаются попытки проследить реакцию отдельных клеточных ферментов на то или иное повреждение нуклеиновой кислоты. Так, широко изучается эффективность и специфичность действия ферментов репарации и различных полимераз в ответ на появление T^g в матричной цепи ДНК или в пуле нуклеозидтрифосфатов [Aller et al., 2007; Wang, 2002; Brown et al., 2010; Purmal et al., 1998]. Вместе с тем, остается актуальным исследование влияния тимидингликоля на функционирование ряда важнейших белков, оперирующих на ДНК, например, таких, как ферменты рестрикции-модификации и факторы транскрипции.

Цель работы заключалась в оценке влияния тимидингликоля - окислительного повреждения ДНК, на физико-химические свойства ДНК-дуплексов и их взаимодействие с рядом ДНК-узнающих белков в зависимости от числа модифицированных звеньев в двойной спирали и природы нуклеотидных пар, фланкирующих поврежденное звено.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Синтез олигодезоксирибонуклеотидов с сайт-направленными включениями T^g .

2. Изучение влияния остатков T^g на структуру двойной спирали и термическую устойчивость модифицированных ДНК-дуплексов.

3. Анализ взаимодействия ДНК-узнающих белков разных классов:
фосфодиэстераз, эндонуклеаз рестрикции, ДНК-метилтрансфераз, фактора
транскрипции NF-кВ, ДНК-полимераз с олигонуклеотидными дуплексами,
содержащими в заданном положении участка узнавания остатки T^g; исследование
влияния потери ароматичности гетероциклическим основанием на функционирование
указанных белков.

Научная новизна и практическая значимость работы. В качестве адекватных моделей для изучения физико-химических и биологических свойств ДНК с окислительными повреждениями тимидина предложено использовать синтетические одно- и двуспиральные фрагменты ДНК с одним или двумя включениями T^g .

Охарактеризованы физико-химические свойства модифицированных и немодифицированных ДНК-дуплексов различного нуклеотидного состава. Установлено, что величина дестабилизирующего эффекта, вносимого остатком T^g, характер кривых плавления и кооперативно сть перехода «спираль-клубок» непосредственно связаны с различием длины и состава фрагментов, примыкающих слева и справа к остатку T^g. Показано, степень влияния T^g на структуру двойной спирали зависит от длины олигонуклеотидного дуплекса, его стабильности, G-C-состава, природы и полярности нуклеотидных звеньев, фланкирующих тимидингликоль. Моделирование структуры дуплексов показало, что введение тимидингликоля в состав ДНК вызывает нарушение «стэкинг»-взаимодействий, изменение локализации фосфатных групп в районе модификации и структурной организации пары T^g -А. Это, в свою очередь, приводит к увеличению площади гидрофобной поверхности и дестабилизации ДНК-дуплекса.

Впервые изучено взаимодействие синтетических фрагментов ДНК, содержащих T^g, на функционирование фосфодиэстеразы змеиного яда, эндонуклеаз рестрикции 11-го типа, С5-цитозиновой метилтрансферазы SsoII, субъединиц р50 и р65 фактора транскрипции NF-кВ, ДНК-полимераз X и (3.

Показано, что введение поврежденного основания в олигонуклеотидную цепь ингибирует действие фосфодиэстеразы змеиного яда. Полученная информация важна в связи с возрастающим интересом к фармакологическим свойствам нуклеаз.

Продемонстрировано, что эндонуклеаза рестрикции П-го типа SsoII может быть использована в качестве индикатора, позволяющего охарактеризовать локальные структурные изменения ДНК, вызванные остатком T^g. Разница, обнаруженная в поведении двух ферментов - Psp6I и MspR9I, узнающих одну и ту же нуклеотидную последовательность, позволяет использовать их тандем для тестирования присутствия T^gl в ДНК.

При изучении взаимодействия ДНК-метилтрансферазы SsoII с ДНК-дуплексами, содержащими T^g в участке метилирования и регуляторном участке, впервые обнаружено, что наличие окисленного основания приводит к нарушению связывания

фермента с обоими участками и негативно влияет на метилирование ДНК.

Замена тимидина на T^g в одной из вырожденных позиций кВ -участка в целом не оказывает существенного влияния на функционирование р50 субъединицы фактора транскрипции NF-кВ, но в 3-5 раз ухудшает связывание модифицированных дуплексов с р65 субъединицей. Обнаружена зависимость между значениями констант диссоциации ДНК-белковых комплексов и «контекстом» кВ-участка (его последовательностью, местоположением T^g и микроокружением модифицированного нуклеозида).

Полученная в данной работе информация о влиянии окислительного повреждения тимидина на термодинамические свойства двойной спирали, ее структуру и взаимодействие с ДНК-узнающими белками может быть использована при моделировании протекания различных клеточных процессов в экстремальных условиях.

Возможности химического синтеза модифицированных фрагментов ДНК, содержащих модифицированный нуклеозид в заданном положении без ограничения количества включений, открывают перспективы для создания адекватных моделей НК-белковых комплексов, формирующихся и функционирующих в клетке.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в российском и международных периодических изданиях. Результаты были представлены на конференции «Ломоносов-2009» (Москва, Россия, апрель 2009 г.), IV-ом съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, май 2008 г.), XlXth International symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Тулуза, Франция, апрель 2007 г.)

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список цитируемой литературы. Материал иллюстрирован 58 рисунками, 4 схемами, 19 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 160 цитированных работ. Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 09-04-0315, 10-04-01578), РФФИ-ННИО «Международные исследовательские группы с участием молодых ученых» (грант 08-04-91974 ННИОМ).

Похожие диссертации на Модифицированные ДНК-дуплексы с включениями тимидингликоля. Физико-химические свойства и взаимодействие с ДНК-узнающими белками

Анализ взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами методами ограниченного протеолитического расщепления и аффинной модификацииПестряков Павел Ефимович

С5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsollВоробьева Ольга Валерьевна

C5-цитозиновая ДНК-метилтрансфераза Ssoll как бифункциональный белок: изучение взаимодействия с участком метилирования и с промоторной областью генов системы рестрикции-модификации SsollВоробьева Ольга Валерьевна

Взаимодействие репликативного белка А, флэп-эндонуклеазы-1 и ДНК-полимеразы с фотореакционноспособными интермедиатами репликации и репарации ДНКХлиманков Денис Юрьевич

Взаимодействие апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека с ДНК-интермедиатами и белками репарации и репликацииДырхеева Надежда Сергеевна

ДНК-дуплексы, содержащие реакционноспособные группировки в углеводофосфатном остове, как реагенты для аффинной модификации остатков цистеина и лизина белковРоманенков Андрей Сергеевич

Структурно-функциональный анализ ДНК-узнающих белков с помощью синтетических фрагментов ДНККубарева Елена Александровна

Фотосенсибилизированная модификация ДНК-полимераз в реконструированных ансамблях белков и в экстрактах клеток и ядерЛебедева Наталья Александровна

Диальдегидросодержащие ДНК-дуплексы как реагенты для аффинной модификации ДНК- метилтрансфераз MvaI и EcoRH и эндонуклеазы рестрикции EcoRHГриценко, Оксана Михайловна

Особенности химического лигирования в ДНК-дуплексах необычной пространственной структурыФедорова, Ольга Александровна