Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1. Общие свойства апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека 9
1.2. Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительно-восстановительный фактор (Ref-І) 10
1.3. Участие АРЕ1 в эксцизионной репарации оснований ДНК
1.3.1. Этапы эксцизионной репарации оснований 14
1.3.2. З -фосфатазная ц З -фосфодиэстеразная активности 16
1.3.3. Взаимодействие АРЕ1 с белками ЭРО 18
1.3.4. ДНК-связывающая, эндонуклеазная и экзонуклеазная активности
АРЕ1. Особенности механизма эндонуклеазпой реакции АРЕ1 22
1.4. 3-5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 28
1.4.1. Удаление неспаренных и модифицированных нуклеотидов с 3 -конца 28
1.4.2. Влияние типа ДНК-дуплекса на экзонуклеазную активность АРЕ1 29
1.4.3. Экзонуклеазная активность АРЕ 1 в зависимости от структурных особенностей 5 -конца олигонуклеотида 30
1.4.4. Влияние условий реакции на экзонуклеазную и эндонуклеазную
активности АРЕ1 31
1.5. Инцизионная репарация нуклеотидов ДНК 33
1.6. Участие АРЕ1 в апоптозе и других процессах 35
1.7. Роль АРЕ1 в развитии заболеваний 1.7.1. Уровень АРЕ1 при различных заболеваниях 37
1.7.2. Терапия 40
Заключение к главе 1 42
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 43
2-1; Материалы 43
2.1.1. Реактивы 43
2.1.2. Ферменты, антитела, бактериальный штамм, плазмидная ДНК и клеточный экстракт 43
2.1.3. Нуклеотиды, радиоактивномеченые соединения и оли?опуклеотиды 44
2.2. Методы исследования 46
2.2.1. Гель-электрофорез в ПААГ нуклеиновых кислот и белков 46
2.2.2. Выделение и очистка рекомбинантной апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, экспрессированной в клетках E.coli
2.2.3. Включение [32Р]-метки в 5 -конец олигонуклеотида, очистка олигонуклеотидов и формирование ДНК-дуплексов 49
2.2.4. Создание ДНК-структур, содержащих ddNMP, морфолидаты или фотоактивируемые аналоги dCMP ((У) на 3 -конце праймера 51
2.2.5. Лигирование одноцепочечного разрыва с фотоактивным аналогом dNMP на 5-конце 52
2.2.6. Встраивание в З -конец одноцепочечного разрыва природного dNMP после фотоаналога с помощью (5-полимеразы 52
2.2.7. Синтез ДНК, катализируемый Р-полгшеразой на ДНК-гес 52
2.2.8. Эндонуклеазная активность АРЕ1 52
2.2.9. Экзонуклеазная активность АРЕ1 53
2.2.10. Экзонуклеазная активность АРЕ! в обращенных мицеллах 53
2.2.11. Реакция фотоаффинной модификации 54
2.2.12. Определение концентрации АР El и Р-полимеразы в MEF-экстракте с помощью иммуноблоттинга 55
2.2.13. Определение стабильности комплексов ДНК-дуплексов с АРЕ1, р-полимеразой и/или RPA методом задержки в геле 56
2.2.14. Определение стабильности ДНК-дуплексов методом термической денатурации с оптической регистрацией сигнала 56
2.2.15. Трипсинолиз АРЕ1 57
2.2.16. Флуоресцентный анализ термической денатурации АРЕ 1 57
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 59
3.1. Выделение и очистка АРЕ1 59
3.2. 3 —5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 60
3.2.1. Экзонуклеазное выщепление природных нуклеотидов 61
3.2.2. Фотоактивируемые аналоги как модели природных dNMP в составе канонической или неканонической пары 64
3.2.3. Выщепление с 3 -конца праймера аналогов dNMP, модифицированных по рибозе 68
3.2.4. Зависимость 3 —5 -экзонуклеазной активности АРЕ1 от типа ДНК-дуплекса и структурных особенностей 5 -конца олигонуклеотида, фланкирующего одноцепочечный разрыв 71
3.2.5. Влияние условий реакции на эндонуклеазную и 3 -5 -экзонуклеазную активности АРЕ1 77
3.2.6. 3 —5 -экзонуклеазная активность АРЕ1 и стабильность ДНК-дуплекса 91
3.3. Взаимодействие АРЕ1 с ДНК и другими белками 100
3.3.1. Фотоаффинная модификация рекомбинантных белков АРЕ1 и Р-полимеразы 101
3.3.2. Фотоаффииная модификация АРЕ 1 и/3-полимеразы при совместном присутствии очищенных белков и в клеточном экстракте 104
3.3.3. Связывание АРЕ 1 с различными олигонуклеотидными структурами 107
3.3.4. Взаимодействие АРЕ 1 с Р-полимеразой, RPA uXRCCl 111
Заключение к главе 3 117
Выводы 123
Список литературы
- Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительно-восстановительный фактор (Ref-І)
- Ферменты, антитела, бактериальный штамм, плазмидная ДНК и клеточный экстракт
- Выделение и очистка рекомбинантной апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, экспрессированной в клетках E.coli
- Влияние условий реакции на эндонуклеазную и 3 -5 -экзонуклеазную активности АРЕ1
Введение к работе
Актуальность проблемы. Макромолекула ДНК подвержена спонтанному разрушению, а также повреждениям под действием различных эндогенных продуктов и внеклеточных агентов природного и искусственного происхождения. В клетке существует несколько путей репарации ДНК. Система эксцизионной репарации оснований (ЭРО) удаляет поврежденные азотистые основания и апуриновые/апиримидиновые (АР-) сайты, образующиеся либо в результате спонтанной потери основания, либо под действием ДНК-гликозилаз, расщепляющих N-гликозидную связь поврежденных нуклеотидов. АР-сайты являются субстратами для АР-эндонуклеаз, например для АР-эндонуклеазы 1 человека (АРЕ1), разрезающих ДНК с 5'-стороны от АР-сайта, в результате чего образуется З'-ОН группа и 5'-дезоксирибозофосфат (dRp). Помимо эндонуклеазной, АРЕ1 обладает З'-фосфодиэстеразной, З'-фосфатазной и 3-5'-экзонуклеазной активностями. На сегодняшний день известна последовательность стадий и основные участники ЭРО, однако механизмы регуляции системы репарации остаются объектом пристального изучения. Предполагается, что действие всех белков-участников ЭРО координировано, а АРЕ1, возможно, играет роль одного из координаторов (Wilson and Kunkel, Nature Struct. Biol. 2000, 7, 176). Известно также, что APE1 может выщеплять неканонически спаренные нуклеотиды более эффективно, чем правильно спаренные. На основании этих данных было выдвинуто предположение (Chou and Cheng, Nature 2002, 415, 655), что APE1 может выполнять в ЭРО роль "корректора" ошибок, допущенных ДНК-полимеразой Р (Р-полимеразой).
Целью работы являлось исследование 3'-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 и взаимодействия АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами ЭРО и других процессов метаболизма ДНК, а также с Р-полимеразой и другими белками. В ходе работы решались следующие задачи: 1) исследование зависимости экзонуклеазной активности АРЕ1 от структурных особенностей ДНК-дуплекса, условий реакции и стабильности дуплекса; 2) анализ экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к природным нуклеотидам в составе канонической или неканонической пары, а также к ddNMP и к аналогам dNMP, содержащим вместо дезоксирибозы остаток морфолина; 3) анализ экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к аналогам dCMP замещенным по экзо-№положению фотоактивируемыми группами; 4) исследование с помощью методов задержки в геле и фотоаффинной модификации взаимодействия АРЕ1 с олигонуклеотидными ДНК-интермедиатами репарации и репликации ДНК, а также с Р-полимеразой, при совместном присутствии рекомбинантных очищенных белков и в клеточном экстракте; 5) исследование взаимного влияния АРЕ1 и Р-полимеразы на полимеразную и 3-5'-экзонуклеазную активности соответственно, а также на зависимость экзонуклеазной активности АРЕ1 от присутствия белковых факторов RPA
(репликативный белок А) и XRCC1 (белок, входящий в группу комплементации, обусловливающую чувствительность клеток к рентгеновскому излучению).
Научная новизна и практическая значимость. Проведено систематическое изучение в различных реакционных условиях (зависимость от солей и рН) 3—5'-экзонуклеазного гидролиза с З'-конца праймера, катализируемого АРЕ1, природных dNMP и их аналогов. Для нескольких типов ДНК-дуплексов впервые исследован гидролиз АРЕ1 всех возможных сочетаний пар природных dNMP в составе канонической или неканонической пары на З'-конце праймера, из нескольких типов ДНК-дуплексов. Показано, что аналоги dNMP с заменой дезоксирибозы на морфолин (З'-МогВ), расположенные на З'-конце праймера, в целом, более устойчивы к действию 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1, чем ddNMP. Для каждого ряда установлен максимально устойчивый аналог. Для фотоаффинной модификации белков и ДНК в АРЕ 1-содержащих системах рекомендован к применению один из четырех исследованных фотоактивируемых аналогов dCTP, который при встраивании в ДНК в качестве аналога З'-dCMP, наименее подвержен воздействию экзонуклеазной активности АРЕ1. Полученные в работе результаты позволяют рекомендовать условия реакции, в которых уровень 3-5'-экзонуклеазной активности АРЕ1 высок, либо, наоборот, низок. Например, условия с низкой активностью необходимы для проведения экспериментов по фотоаффинной модификации в АРЕ 1-содержащих системах, чтобы фотоактивируемый аналог не выщеплялся с З'-конца праймера. Впервые на основании анализа данных термической денатурации ДНК-дуплексов и экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРЕ1, показано, что фермент при проявлении экзонуклеазной активности действует специфично в зависимости от природы группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5'-стороны, и что эта активность АРЕ1 в значительной мере определяется способностью ДНК-дуплекса "подплавляться" с З'-конца. Впервые для частичного ДНК-дуплекса с утопленным З'-концом (ДНК-гес) показано, что АРЕ1 повышает активность р-полимеразы, RPA ингибирует, a XRCC1, наоборот, стимулирует 3-5'-экзонуклеазную активность АРЕ1.
Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и 1 обзор. Результаты работы были представлены на международных конференциях: «Chemical and biological problems of proteomics», Новосибирск, 2004; «International conference on chemical biology», Новосибирск, 2005; FEBS School «Chemistry meets biology», Спетсес, Греция, 2005; «Физико-химическая биология», Новосибирск, 2006; «31st FEBS Congress», Стамбул, Турция, 2006; «IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов», Новосибирск, 2008; «Russian-European workshop on DNA repair and epigenetic regulation of genome stability», Санкт-Петербург, 2008.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, выводов, списка литературы. Работа изложена на 141 странице, содержит 33 рисунка, 16 таблиц и список цитируемой литературы из 190 наименований.
Синтез АРЕ1 в клетке. АРЕ1 как окислительно-восстановительный фактор (Ref-І)
В литературе в основном подчеркивается необходимая роль репарационных функций АРЕ1 для жизнедеятельности клеток млекопитающих. Однако, попытки восстановить репарацию ДНК в клетках без АРЕ1, используя дрожжевой гомолог Apnl, который не имеет N-концевого домена, отвечающего за окислительно-восстановительную Ref-1 функцию, или используя мутанты АРЕ1 (без сайтов ацетилирования, но с репарационной функцией, или мутант Cys65Ser без Ref-І функции), полностью не восстанавливают жизнеспособность клеток [20]. С помощью специфичного ингибирования Ref-І функции было показано, что развитие гемангиобластов in vitro значительно ухудшалось. По приведенным данным сделан вывод, что репарационная функция критична для выживания, а Ref-І функция - для роста клеток [20].
Высказана гипотеза о том, что окислительно-восстановительная функция АРЕ 1/Ref-1 регулируется протеин-киназой С (РКС), осуществляющей фосфорилирование сайтов, расположенных в обоих функциональных доменах белка [28]. Клетки лейкемии человека на совокупное действие окислительного агента (гипохлорита) и метилметансульфоната отвечают повышением активности РКС с соответствующим повышением уровня фосфорилирования APEl/Ref-І. Это приводит, в свою очередь, к росту окислительно-восстановительной активности APEl/Ref-1. Эти воздействия не приводят к увеличению количества АРЕ1 в клетке и не влияют на ее репаративную активность. Результаты, полученные в данной работе, позволяют предположить, что способность АРЕ1 выполнять функцию Ref-І зависит от уровня фосфорилирования белка с помощью РКС, которое происходит в ответ на действие ДНК-повреждающих агентов. Уровень фосфорилирования, как предполагают, определяет, какие функции будет выполнять АРЕ1, репаративные или окислительно-восстановительные. Кроме того, возможно, что фосфорилирование АРЕ1 играет роль в транспорте этого белка в ядро клетки [28].
АРЕ1 также подвергается фосфорилированию с помощью казеин киназы I и казеин киназы II, киназы 3 гликогенсинтазы [20]. Другие предполагаемые или установленные экспериментально посттрансляционные модификации АРЕ1: ацетилирование, протеолиз, S-нитрозирование и сумоилирование [20]. При воздействии Н2О2 на клетки HeLa уровень ацетилирования АРЕ1 по остатку Lys6/7 значительно повышался. Это приводило к экспрессии гена ракового супрессора PTEN, которая индуцируется фактором транскрипции- Egr-І под регуляцией окислительно-востановительной функции АРЕ1 [20]. Протеолиз по остатку Lys31 требуется для апоптоза клеток, проводимого гранзимами А и К [20]. Сайты сумоилирования АРЕ1 пока не установлены экспериментально, но предположительно распределены по последовательности молекулы неравномерно, концентрируясь в N-концевом домене, который ответственен за окислительно-восстановительную Ref-І функцию [20]. S-нитрозированию под действием окиси азота могут быть подвержены два из семи остатков цистеина (Cys93 and Cys310) АРЕ1. Это ведет за собой релокализацию белка из ядра в цитоплазму. Таким образом, S-нитрозирование может выступать как механизм регуляции клеточной локализации АРЕ1 (распределения между ядром и цитоплазмой) [20].
В литературе есть данные об участии АРЕ1 в регуляции экспрессии генов [29-31]. Было обнаружено, что экспрессия гена паратиреоидного гормона (ПТГ) снижается в ответ на повышение концентрации кальция в клетке [29]. Как выяснилось, репрессия этого гена происходит за счет связывания с промотором, а именно с Са2+-зависимыми элементами (nCaRE-A и nCaRE-B), комплекса ядерных белков, в который входит АРЕ1 [31]. Вне данного комплекса АРЕ 1 не способна к такому связыванию. Затем было установлено [30], что партнером АРЕ1 в связывании с элементом nCaRE-A на промоторе гена ПТГ являются субъединицы р70 и р86 Ku-антигена, участвующего в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК. Те же авторы в более поздней работе сообщили, что элементы типа nCaRE присутствуют в гене, кодирующем сам фермент АРЕ1. В состав комплекса-репрессора, связывающегося с промотором, входят АРЕ1 и гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин L (hn-RNP-L) [31]. Таким образом, экспрессия гена АРЕ1 регулируется собственным продуктом. Это пока единственный пример такой регуляции синтеза ферментов репарации. 1.3. Участие АРЕ1 в эксцизионной репарации оснований ДНК
Эксцизионная репарация оснований ДНК — многостадийный процесс, в котором участвуют ферменты, исправляющие повреждения ДНК — модифицированные азотистые основания (например, дезаминированные цитозин и аденин, окисленные и алкилированные основания) и АР-сайты [10, 32-36]. Система ЭРО запускается при спонтанной потере азотистого основания, либо под действием ДНК-гликозилаз [4, 13, 32].
Монофункциональные ДНК-гликозилазы, такие как урацил-ДНК-гликозилазы и метилпурин-ДНК-гликозилазы, удаляют поврежденное основание, расщепляя N-гликозидную связь в нуклеотидах с поврежденным основанием (рис. 1.2, путь І) [13]. В этом случае образуется АР-сайт, который является субстратом для АР-эндонуклеаз, например, для АРЕ1. АР-эндонуклеазы расщепляют сахарофосфатный остов цепи ДНК с 5 -стороны от АР-сайта с образованием одноцепочечного разрыва с З -ОН и 5 -dRp группами [11]. Далее процесс ЭРО может протекать двумя путями: "короткозаплаточным" (с включением одного нуклеотида) и "длиннозаплаточным" (с включением нескольких нуклеотидов) [37]. При короткозаплаточном пути (рис. 1.2, путь 1а) Р-полимераза достраивает один нуклеотид и удаляет dRp за счет присущей ей лиазной активности [38]. Реакция выщепления dRp происходит по механизму р-элиминирования [38, 39]. Этот процесс чувствителен к химической модификации dRp: так, например, окисленные или восстановленные АР-сайты устойчивы к р-элиминированию. В этом случае репарация АР-сайтов идет по длиннозаплаточному пути (рис. 1.2, путь 16): в растущую цепь включается более одного (2-7) нуклеотида, что сопровождается вытеснением цепи ДНК, ограничивающей разрыв [40, 41]. Первый нуклеотид включается с помощью 0-полимеразы [6, 42], далее синтез может осуществляться р-полимеразой [43] и/или полимеразами 5 и є с участием белковых факторов PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и RFC (репликативный фактор С) (рис. 1.2, путь 16) [43, 44]. В длиннозаплаточном пути репарации задействован фермент флэп-эндонуклеаза 1 (FEN1), который вырезает свисающую последовательность из нескольких нуклеотидов - "хвост" или "флэп", содержащий 5 -dRp группу [43, 45, 46].
Ферменты, антитела, бактериальный штамм, плазмидная ДНК и клеточный экстракт
Реакционные смеси содержали 20 нМ АРдцДНК (табл. 2.2) и 0.5 нМ АРЕ1. Реакцию проводили в буфере 1 Tris,OMg50KpH8 или 7 Hepes1Ms50KpH7 (табл. 2.4). В экспериментах по определению кинетических параметров кса\ и Кт реакционные смеси содержали компоненты буфера 1 Tris10Mg50KpH8, 0.5 нМ АРЕ1, АРдцДНК в различных концентрациях: 10, 20, 50, 100 и 200 нМ. Реакцию проводили при 37С в течение 15 с—10 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% денатурирующем ПААГ (пункт 2.2.1). Кинетические константы определяли согласно схеме Михаэлиса-Ментен в координатах Эдди-Хофсти [150] с помощью программы OriginPro7.5.
Реакционные смеси содержали 10-20 нМ ДНК-дуплекс, АРЕ1 (4 нМ-2 мкМ, в различных концентрациях, указанных на соответствующих рисунках), а также буферные компоненты: 50 мМ Tris-HCl или 25 мМ Hepes (состав и значение рН для разных буферов указано в табл. 2.4), соли MgCb (или МпСЬ) и КС1 в указанных в каждом случае концентрациях (табл. 2.4), буферы
Сонце нтрация буферного к омпонента: T ris-HCI 50 мМ или Hepes 25 мМ. В экспериментах по влиянию других белков на экзонуклеазную активность реакционные смеси содержали 20 нМ (либо в различных концентрациях, где указано) XRCC1 или 0.2 либо 2 мкМ RPA. Реакцию проводили при 37С в течение 2-30 мин. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 20% денатурирующем ПААГ (пункт 2.2.1). Расчет кинетических параметров ксм и Кт экзонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1, проводили с помощью программы OriginPro7.5 по формуле: In(l-[P]/[S0]) = - WEoMATm +[Ео]), в координатах t/ln(l-[P]/[S0]) от (1/[Е0]). Для каждой точки проводилось 3-4 эксперимента. Расчетное значение полученных параметров усредняли. Разница между средним значением и крайним значением составляла не более 10% от среднего.
Реакционные смеси объемом 100 мкл содержали 1 мМ MgCh, 20 мМ Tris, 2 нМ ДНК дуплекс. К водному раствору реакционной смеси, содержащей ДНК-субстрат, добавляли микроэмульсию в указанном в каждом отдельном случае количестве, смесь для формирования обращенных мицелл, содержащих ДНК-субстрат, быстро встряхивали до прозрачности (5 с). Добавляли АРЕ1 до конечной концентрации 10 нМ, еще раз встряхивали реакционную смесь. Реакцию проводили при 22С в течение 5-30 мин и останавливали добавлением этанола. Для анализа электрофорезом в 20% денатурирующем ПААГ (пункт 2.2.1) продукты реакции высаживали 10-кратным избытком этанола в течение 2-14 часов при -20С. Осадки растворяли в буфере для нанесения.
Реакцию фотомодификации чистых белков АРЕ1 и р-полимеразы проводили в реакционной смеси, содержавшей 50 нМ ДНК-субстрат и компоненты буферов 1м-3м (табл. 2.5). К смеси добавляли АРЕ1 и/или р-полимеразу до конечной концентрации 0.5 мкМ. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 37С. Реакцию фотомодификации белков MEF-экстракта проводили в смеси объемом 10 мкл, которая содержала белки MEF-экстракта (конечная концентрация в реакционной смеси 3.0 мг/мл), 100 нМ ДНК-субстрат, 50 мМ Tris-HCl (рН 7.5), а также компоненты, введенные с экстрактом: 2.5 мМ Tris-HCl (рН 7.8), 50 мМ КС1, 0.25 мМ ЭДТА, 5% глицерин, 0.025% NP-40, 0.25 мМ дитиотреитол и смесь ингибиторов протеаз. Реакционную смесь инкубировали в течение 5 мин при 37С. УФ-Облучение проводили при 312 нм. Источник излучения - кросслинкер BioLink BLX ("Vilber-Lourmat", Франция) с интенсивностью падающего света 0.12 Дж-см"-с" (0.115 Дж-мин 1, время облучения 5 мин). Иммунопреципитацию проводили, как описано в работе [9]. К реакционной смеси (100 мкл) после УФ-облучения добавляли 20 мкл антител против АРЕ1 или р-полимеразы, инкубировали 1 ч при 4С. Затем комплекс адсорбировали на протеин-О-агарозе (20 мкл), уравновешенной буфером, рекомендованным производителем. Далее реакционные смеси обрабатывали согласно протоколу производителя протеин-О-агарозы. Продукты, специфически адсорбированные на протеин-О-агарозе, анализировали электрофорезом в 15% ПААГ по Лэммли (пункт 2.2.1).
Для-оценки содержания АРЕ1 и р-полимеразы в MEF-экстракте аликвоты образца (5, 10 и 15 мкл, с конечной суммарной концентрацией белков в экстракте 3.9 мг/мл) наносили на гель и разделяли белки экстракта электрофорезом по Лэммли в 15% ПААГ (пункт 2.2.1). В качестве контроля наносили очищенные рекомбинантные АРЕ1 и р-полимеразу в количестве 1.5, 0.5, 0.15 и 0.05 пмоль/дорожку. После разделения проводили электроперенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану с диаметром пор 0.45 мкм ("Millipore", США) в буфере, содержащем 10% метанол (анодный буфер - Tris-HCl, рН 10.4, катодный - 25 мМ Tris-HCl, рН 8.5, 40 мМ глицин). Перенос проводили в течение 40 мин при силе тока 2 мА/см с помощью прибора фирмы "Hoefer Scientific Instruments" (США). Затем нитроцеллюлозную мембрану промывали в течение 10 мин при комнатной температуре буфером ТБС (40 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl) и выдерживали в течение 15 мин в 5% обезжиренном молоке с 0.05% Tween20. После промывки буфером ТБС (1 мин) мембрану инкубировали в течение ночи при 4С с поликлональными антителами кролика против АРЕ1 или р-полимеразы, разбавленными до необходимого титра буфером ТБС. Далее мембрану промывали три раза по 5 мин тем же буфером, выдерживали в течение 15 мин в 5% обезжиренном молоке с 0.05% Tween20 и промывали буфером ТБС 1 мин. Далее мембрану инкубировали 2 ч с разбавленными в 2000 раз
Выделение и очистка рекомбинантной апурнновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 человека, экспрессированной в клетках E.coli
Параметр kcat практически не отличается для этих различных ДНК-структур, при этом четких зависимостей от того, какое основание входит в состав нуклеотида, не наблюдается. Параметр же Кт, напротив, заметно изменяется для разных ДНК-структур. Каталитическая эффективность реакции экзонуклеазного гидролиза, которая оценивалась по соотношению kcat/Km (табл. 3.4), таким образом, в значительной мере зависит от величины Km. ddNMP выщепляются АРЕ1 с З -конца наиболее эффективно по сравнению с dNMP и З -МогВ, независимо от того, какое азотистое основание входит в состав нуклеотида. В работе [98], посвященной исследованию экзонуклеазной активности АРЕ1 по отношению к З -р-Ь-диоксоланцитидину и другим аналогам dCMP, уже отмечалось более эффективное выщепление ddCMP по сравнению с dCMP. В случае, когда в состав нуклеотидов и их аналогов входит С или А, более эффективно выщепляется dNMP, чем З -МогВ, а в случае G и Т - наоборот. Для dNMP и ddNMP каталитическая эффективность экзонуклеазной реакции, катализируемой АРЕ1, падает в ряду: A/T C/G G/OT/A. Для \ морфолидатов наблюдается совсем другая зависимость: 3 -МогА/Т 3 -Моги/А 3 -MorG/C 3 -MorC/G (табл. 3.4). Поскольку З -МогВ являются менее подверженными гидролизу, чем ddNMP, З -МогС в составе канонической пары является наименее выщепляемым АРЕ1 из исследованных терминирующих аналогов, модифицированных по остатку рибозы. Таким образом, можно сделать вывод, что морфолинонуклеозидтрифосфаты, и в особенности МогС, являются более предпочтительными противовирусными агентами, чем ddNTP. Данный аналог (МогС) был выбран в работе [154] как наиболее эффективный терминирующий субстрат HIV-1 RT, который потенциально может быть использован в качестве специфического ингибитора этого фермента. Поскольку MorU менее эффективный субстрат по сравнению с МогС для HIV-1 RT, и, в то же время, МогС плохо встраивается Р-полимеразой по сравнению с MorU, потенциально МогС может быть использован в качестве специфического ингибитора HIV-1 RT. При этом отмечается [154], что его низкая субстратная активность при синтезе р-полимеразой может обеспечить щадящее воздействие МогС на репаративный синтез ДНК. В указанной публикации [154], кроме аналогов МогВ использовали аналоги, содержащие различные заместители в остатке морфолина. Один из них содержал углеводородный линкер с ИНг-группой, присоединенный к атому азота в остатке MorU, а другой аналог MorU содержал остаток биотина. В случае таких аналогов, содержащих объемные модификации остатка дезоксирибозы, Р-полимераза встраивала их с меньшей эффективностью, чем MorU, a HIV-1 RT не встраивала совсем. Поэтому такие аналоги были выбраны для исследования экзонуклеазной активности АРЕ1, как терминирующие субстраты, применяемые для подавления репарационного синтеза ДНК, катализируемого р-полимеразой. Данные по экзонуклеазному выщеплению аналогов 3 -МогВ опубликованы не были. На основании полученных результатов [154] был сделан вывод, что морфолинонуклеозидтрифосфаты терминируют синтез ДНК, катализируемый Р-полимеразой. В то же время, возникающее в результате блокирование репаративного синтеза может быть не столь существенным, поскольку АРЕ1 удаляет терминирующий нуклеотид с помощью своей 3 -5 -экзонуклеазной активности. Авторы отмечают [154], что вклад АРЕ1 в результате ее кооперации с Р-полимеразой [36, 156] может обеспечить щадящее воздействие таких ингибиторов на репаративный синтез при эффективном подавлении синтеза ДНК, катализируемого обратной транскриптазой HIV-1. Согласно полученным в настоящей работе результатам, З -МогС в составе канонической пары является наименее выщепляемым АРЕ1 из исследованных аналогов (З -МогВ и ddNMP). Однако утверждение о том, что МогВ являются более предпочтительными антивирусными агентами, чем ddNMP, требует дополнительного изучения сравнительных свойств ddNMP и МогВ в реакции элонгации, катализируемой Р-полимеразой и HIV-1 RT. Следует отметить, что по возможности нужно также учитывать вероятность выщепления аналога с 3 -конца другими экзонуклеазами.
Влияние структуры 3 - и 5 -концов олигонуклеотидов, обрамляющих одноцепочечный разрыв/брешь, на 3 -5 -экзонуклеазную активность АРЕ1 исследована разными авторами. Наличие фосфата на 3 -конце однонуклеотидной бреши или разрыва не влияет на эффективность экзонуклеазной реакции по сравнению с гидроксильной группой в этом положении [8]. Природа 5 -концевой группы, напротив, заметно сказывается на эффективности экзонуклеазного гидролиза [8, 9, 75, 102].
Кроме зависимости экзонуклеазной активности АРЕ1 от состава нуклеотидной пары, подвергаемой выщеплению (разделы 3.2.1-3.2.3), мы исследовали влияние на эту активность группы, фланкирующей одноцепочечный разрыв с 5 -стороны. Структуры использованных для этой цели ДНК-дуплексов приведены в табл. 2.2. При формировании ДНК-субстратов было использовано три типа запирающих разрыв праймеров (ЗП), содержащих на 5 -конце: фосфат (ДНК-р), гидроксильную группу (ДНК-ОН), или тетрагидрофуранофосфат (ДНК-pF), который моделирует дезоксирибозофосфат.. Тетрагидрофуран (F) — аналог дезоксирибозы в составе синтетического АР-сайта неспособный подвергаться р-элиминированию. ДНК-дуплекс с 5 -pF-rpynnofl, фланкирующей брешь или разрыв, можно рассматривать как модель ДНК-структуры, возникающей при переключении ЭРО с короткозаплаточного пути на длиннозаплаточный (описание и схема процесса ЭРО приведены в разделе 1.3.1 и на рис. 1.2). Такое переключение происходит в случае, когда р-полимераза с помощью лиазной активности не может удалить модифицированный сахарофосфат, например, тетрагидрофурановый остаток. ДНК-структура с 5 -р группой в одноцепочечном разрыве (ДНК-р) является моделью интермедиата ЭРО, возникающего на этапе заполнения бреши и подлежащего лигированию. ДНК-структуры, содержащие 5 -гидроксильную группу в разрыве (ДНК-ОН) могут возникать вследствие потери фосфата [3, 157].
Ранее несколькими авторами сообщалось о том, что уровень экзонуклеазной активности АРЕ1 зависит от типа ДНК-дуплекса (например, частичный ДНК-дуплекс или дуплекс с брешью/разрывом) и от природы 5 -группы, фланкирующей брешь/разрыв [7, 8, 9, 27, 75, 102]. В большинстве работ показано, что присутствие 5 -pF-rpynnbi в бреши/разрыве, снижает эффективность выщепления АР-эндонуклеазой 1 З -концевого нуклеотида по сравнению с ДНК-дуплексом, содержащим 5 -р-группу в этом положении [9, 75, 102]. Во всех работах отмечается наибольшая эффективность экзонуклеазной реакции при наличии 5 -ОН группы в бреши или разрыве по сравнению с фосфатной или pF-группами. Например, фосфатная группа по сравнению с 5 -ОН уменьшает эффективность выщепления нуклеотида в 10 [8] или 8 [102] раз, a 5 -pF группа - в 5 раз [8]. Полученные нами результаты согласуются с литературными данными о наибольшей эффективности экзонуклеазной активности АРЕ1 при наличии 5 -гидроксильной группы. В этом случае за эффективность принимали долю (%) продукта экзонуклеазной реакции от общего количества ДНК-субстрата. Для всех исследуемых аналогов, кроме FABOdCMP, эффективность выщепления остатка dNMP уменьшалась в следующем ряду: ДНК с гидроксильной (ОН) фосфатной (р) тетрагидрофуранофосфатной (pF) группой
Влияние условий реакции на эндонуклеазную и 3 -5 -экзонуклеазную активности АРЕ1
Зависимость уровня экзонуклеазного гидролиза, катализируемого АРЕ1, была сопоставлена с зависимостью термостабильности от природы 5 -группы. ДНК-структура с одноцепочечным разрывом, содержащая 5 -ОН группу (ДНК-ОН), оказалась наиболее стабильной, но экзонуклеазная активность на такой структуре также наиболее высока. Таким образом, в этом случае не наблюдается корреляции между стабильностью дуплекса и экзонуклеазной активностью, и тип 5 -группы значительно влияет на эту активность. Кроме того, экзонуклеазная активность АРЕ1 выше на субстратах с 5 -ОН группой, а также с 5 -флэпом (ДНК-flap) или на частичном ДНК-дуплексе с утопленным З -концом (ДНК-гес), хотя такие ДНК-дуплексы более стабильны. В то же время, ДНК-дуплексы ДНК-р и ДНК-pF (структура дуплексов приведена в табл. 2.2) менее стабильны, но не являются предпочтительными субстратами для 3 —5 -экзонуклеазной активности АРЕ1. Следовательно, эта активность АРЕ1 проявляется довольно специфично по отношению к ДНК-субстрату, независимо от стабильности 5 -конца ДНК-дуплекса в разрыве, в отличие от заметного влияния структуры и прямой корреляции со стабильностью 3 -конца ДНК-дуплекса (раздел 3.2.6.1).
5 -Концы без фосфатной группы могут возникать, например, вследствие потери фосфата из одноцепочечного разрыва в результате повреждения ДНК под действием ионизирующей радиации [3, 157]. Такие повреждения ДНК исправляет система репарации одноцепочечных разрывов, которая может рассматриваться как частный случай ЭРО, отличающийся по начальным стадиям до этапа синтеза ДНК [3, 170, 171]. Возможно, что АРЕ1 участвует в этом пути репарации проявляя 3 -5 -экзонуклеазную активность на ДНК с 5 -ОН группой в разрыве. Другой вывод из сопоставления данных по стабильности дуплекса и экзонуклеазной активности — высокое сродство АРЕ1 к ДНК с флэпом и высокий уровень экзонуклеазной активности АРЕ1 на таком субстрате. ДНК-структуры с флэпом имитируют интермедиаты длиннозаплаточного пути ЭРО. Недавно было показано, что АРЕ1 стимулирует синтез ДНК с вытеснением цепи, катализируемый р-полимеразой, а также исправляет ошибки за полимеразой, удаляя неканонические пары с помощью экзонуклеазной активности, возникающие в ходе длиннозаплаточной ЭРО [68]. Ранее было показано, что АРЕ1 оказывает влияние на активности FEN-1 и ДНК лигазы I -двух других ферментов, участвующих в этом пути ЭРО, а также в репликации ДНК на отстающей нити [78]. Наши данные свидетельствуют в пользу того, что АРЕ1 взаимодействует с ДНК-flap, проявляя экзонуклеазную активность (раздел 1.3.1, рис. 1.2). Возможно, что АРЕ1 за счет экзонуклеазной активности может исправлять ошибки в ходе синтеза в процессе длиннозаплаточного пути ЭРО, не исключен вклад этой активности и в процесс репликации на отстающей нити, в ходе которого тоже возникают флэп-структуры. Полученные результаты показывают, что и другая структура, моделирующая интермедиат репликации - частичный ДНК-дуплекс с утопленным 3 -концом (ДНК-гес) также является предпочтительным субстратом для экзонуклеазной активности АРЕ1 по сравнению с ДНК с одноцепочечным разрывом, несущим 5 -р группу (ДНК-р). Такое предпочтение ДНК-гес согласуется с ранее опубликованными данными [8, 75], но не согласуется с результатами другой статьи, опубликованной в журнале "Nature", в которой говорится, что АРЕ1 проявляет экзонуклеазную активность одинаково интенсивно на ДНК с разрывом или брешью, и минимальную на частичном ДНК-дуплексе с утопленным З -концом [7].
Стабильность дуплекса - только один из факторов, регулирующих экзонуклеазную активность АРЕ1. Как эффективность экзонуклеазной реакции, так и стабильность ДНК-дуплекса зависят от природы группы, фланкирующей разрыв/брешь с 5 -стороны. Экзонуклеазная активность АРЕ1 высока на ДНК-субстратах с гидроксильной группой на 5 -конце в разрыве, равно как и на ДНК с флэпом или утопленным З -концом. Для ДНК-структур, несущих разные канонические или неканонические пары на З -конце в одноцепочечном разрыве, наблюдается прямая корреляция экзонуклеазной активности со стабильностью ДНК-дуплекса (раздел 3.2.6.1). Напротив, в случае ДНК-дуплексов с разными 5 -группами в разрыве такой корреляции между стабильностью дуплекса и экзонуклеазной активностью не наблюдается, например, экзонуклеазная активность АРЕ1 выше на субстрате ДНК-ОН, который более стабилен (рис. 3.15). Следовательно, экзонуклеазная активность АРЕ1 проявляет значительную специфичность по отношению к ДНК-субстрату, вероятно, на этапе узнавания ДНК-структуры ферментом, и, видимо, при этом имеет значение структура 5 -конца разрыва, в то же время на эффективность катализа реакции экзонуклеазного гидролиза влияет "подплавление" 3 -конца разрыва. Возможно, что экзонуклеазная активность АРЕ1 в силу специфического узнавания структуры ДНК и композиции одноцепочечного разрыва проявляется в определенных механизмах метаболизма ДНК. На основании полученных данных можно выдвинуть предположение о том, что эта активность АРЕ1 проявляется в процессе длиннозаплаточного пути ЭРО, либо в ходе репликации ДНК на отстающей нити. Существуют данные об участии в репликации других белков ЭРО, например, р-полимеразы, однако предположение об участии в этом процессе АРЕ1 требует дальнейшего изучения и подтверждения.
Система эксцизионной репарации оснований (ЭРО) ДНК (схема ЭРО представлена на рис. 1.2) - многостадийный процесс, протекающий с участием ряда белков и направленный на исправление повреждений в ДНК, таких как модифицированные азотистые основания и АР-сайты [10, 34]. Работу всех белков ЭРО координирует механизм "передачи эстафетной палочки", где в роли "палочки" выступает репарируемая ДНК, которая переходит от одного белка к другому [6]. АРЕ1 является одним из кандидатов на роль координатора ЭРО, который участвует в контроле работы всего процесса [6, 11]. Такое предположение основано на результатах анализа ряда работ, продемонстрировавших, что АРЕ1 участвует в стимуляции активностей ферментов ЭРО [35, 60-66, 68, 78].
Основная ДНК-полимераза репаративного синтеза ЭРО в клетках млекопитающих — В-полимераза [69]. Помимо предположения о роли АРЕ1 как "корректора" ошибок, допущенных р-полимеразой [7], существуют и другие модели взаимодействия этих двух белков - участников ЭРО. Находясь на АР-сайте, АРЕ1 способствует связыванию Р-полимеразы с нерасщепленным АР-сайтом ДНК, а также стимулирует лиазную активность этого фермента [36]. Эти результаты послужили основой для предположения о координации действий АРЕ1 и Р-полимеразы на начальных этапах короткозаплаточного пути ЭРО [36]. АРЕ1 также стимулирует катализируемый Р-полимеразой синтез ДНК с вытеснением цепи, характерный для репарации по длиннозаплаточному пути [68].
В данной работе была исследована эффективность взаимодействия АРЕ1 и Р-полимеразы с различными ДНК-структурами. Некоторые из исследуемых /ДНК-дуплексов можно рассматривать как интермедиаты короткозаплаточного (например, ДНКм-р, ДНКМ 100 gap) или длиннозаплаточного путей ЭРО (например, ДНК -pF, ДНК -flap) (структуры ДНК представлены в табл. 2.2 и 2.3). Изучение взаимодействия АРЕ1 и Р-полимеразы с ДНК проводили с помощью методов задержки в геле и фотоаффинной модификации. ДНК-структуры, применяемые для фотоаффинной модификации, содержали на З -конце праймера модифицированный нуклеотид (Ср) с фотоактивируемой группой (рис. 2.1). Применение метода фотоаффинной модификации для исследования комплекса белков ЭРО, взаимодействующего с ДНК-интермедиатами репарации, позволило выявить основные белки этого комплекса [9, 76]. На основании ранее полученных данных о влиянии условий реакции (раздел 3.2.5) и природы 5 -концевой группы в одноцепочечном разрыве (раздел 3.2.4) на экзонуклеазную активность АРЕ1 было проведено сопоставление эффективности взаимодействия с различными ДНК-структурами рекомбинантной очищенной АРЕ1 и фермента в составе клеточного экстракта. Набор структур (табл. 2.3), содержащих различные группы на 5 -конце одноцепочечного разрыва, был расширен по сравнению с ранее исследовавшимися [9, 76] и включал в себя не только модели интермедиатов ЭРО, но и частичный ДНК-дуплекс с утопленным 3 -концом (ДНКм-гес) и ДНК с 5 -ОН-группой (ДНКм-ОН).
Используемые в данной работе ДНК-субстраты, содержащие фотоактивируемый нуклеотид на З -конце праймера, были созданы из предсинтезированного in vitro с помощью Р-полимеразы и очищенного 5 -[32Р]-меченого праймера. АРЕ1 способна выщеплять с 3 -конца одноцепочечного разрыва не только неканонически спаренные, но и модифицированные аналоги нуклеотидов [27, 98]. Для фотоаффинной модификации в АРЕ 1-содержащих системах нами был выбран наименее выщепляемый аналог dCMP (FAPdCMP) из четырех исследованных фотоактивируемых производных (рис. 2.1, раздел 3.2.2). На основании полученных результатов (раздел 3.2.5) были подобраны такие условия фотоаффинной модификации, при которых З -концевой FAPdCMP комплементарный dGMP матрицы незначительно выщеплялся АР-эндонуклеазой 1. Параллельно с разделением продуктов реакции фотохимического присоединения белков к ДНК в ПААГ [148] проводили анализ уровня выщепления FAPdCMP с З -конца праймера. Выход продукта экзонуклеазного гидролиза 3 -FAPdCMP не превышал 4% (максимальный выход 4 % наблюдали для ДНК-дуплекса с 5 -гидроксильной группой в одноцепочечном разрыве (ДНКм-ОН)).
