Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 9
Механизмы функционирования ssb-белков в процессах клеточного метаболизма днк 9
1.1. Строение SSB-белков 10
1.1.1. Гомотетрамерные SSB-белки 10
1.1.2. Гомодимерные SSB-белки 11
1.1.3. Гетеротримерные ssb-белки, репликативный белок а 13
1.1.4. Ssb-белки другого субъединичного строения 14
1.2. Особенности доменной структуры ssb-белков и механизм их взаимодействия с днк 15
1.2.1. Ов-домен-основа структурной организации ssb-белков 15
1.2.2. Другие домены ssb-белков 23
1.2.3. Взаимодействие ssb-белков с одноцепочечной днк 26
1.3. Участие ssb-белков в клеточных процессах 31
1.3.1. Ssb-белки в процессах репликации, репарации и рекомбинации днк 31
Глава 2. Экспериментальная часть 39
2.1. Материалы 39
2.2. Методы исследования 43
Глава 3. Результаты и их обсуждение 53
3.1. Архитектура комплексов rpa с модельными днк 54
3.1.1. Особенности конформации rpa в его комплексах с днк (по данным метода ограниченного протеолитического расщепления) 54
3.1.2. Ориентированное расположение субъединиц rpa в различных типах его комплексов с днк (по данным метода фотоаффинной модификации) 72
3.1.3. Координация взаимодействия доменов rpa с частичными днк-дуплексами (по данным метода фотоаффинной
Модификации) 82
3.2. Роль малых субъединиц rpa в составе гетеротримера 92
3.2.1. Структурная роль субъединиц р32 и р14 93
3.2.2. Участие субъединиц р32 и р14 в процессе связывания днк 96
3.2.3. Роль субъединиц р32 и р14 в процессе репликации днк 102
Заключение 109
Выводы 111
Список литературы
- Гомотетрамерные SSB-белки
- Участие ssb-белков в клеточных процессах
- Особенности конформации rpa в его комплексах с днк (по данным метода ограниченного протеолитического расщепления)
- Роль малых субъединиц rpa в составе гетеротримера
Введение к работе
Исследование механизмов хранения и реализации генетической информации является одной из важнейших фундаментальных задач современной биохимии и молекулярной биологии. На данный момент значительный прогресс достигнут в изучении строения и свойств ДНК-полимераз, играющих ключевую роль в этих процессах, однако свои специализированные функции в репликации и репарации ДНК у эукариот ДНК-полимеразы осуществляют в тесном взаимодействии с другими ферментами и белковыми факторами, такими как репликативный белок A (RPA), репликативный фактор С (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), флэп-эндонуклеаза (FEN-1), апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза-1 (АРЕ1), ДНК-гликозилазы, ДНК-лигазы, поли-(АОР-рибозо)-полимераза-1 (PARP-1) и др. Системы репликации и репарации ДНК в настоящее время следует рассматривать как взаимосогласованные функциональные ансамбли белков. Таким образом, важным направлением является изучение белков и факторов репликации и репарации ДНК, которые осуществляют регулирующую и координирующую функции в этих ансамблях.
Объектом нашего исследования является эукариотический SSB-белок -репликативный белок А, являющийся ключевым фактором метаболизма ДНК, участвующим в репликации, репарации и рекомбинации ДНК. В процессах репликации и репарации RPA, с одной стороны, стабилизирует структуры ДНК, содержащие одноцепочечные участки, а с другой, координирует взаимодействие других белковых факторов с ДНК. Динамичная природа взаимодействий RPA с ДНК и белками-партнерами обусловлена особенностями структуры гетеротримера RPA, состоящего из субъединиц р70, р32 и рІ4, в которых различают сразу несколько доменов, потенциально способных взаимодействовать с нуклеиновой кислотой. Взаимодействие RPA с ДНК сопровождается формированием нескольких типов комплексов, которые отличаются расположением и ориентацией белка относительно ДНК, при этом переход одного типа комплекса в другой происходит на стадиях ферментативных превращений ДНК. Таким образом, изучение разных типов взаимодействия RPA со структурами ДНК, участвующими в репликации и репарации, вносит неоценимый вклад в исследование путей регуляции и координации этих процессов и является, безусловно, актуальной задачей. К настоящему моменту достаточно хорошо исследованы комплексы RPA с одноцепочечной ДНК, однако взаимодействие RPA с частичными ДНК-дуплексами с выступающим 5'-одноцепочечным участком, которые имитируют субстраты ДНК-полимераз, изучено в гораздо меньшей
степени. Остается открытым ряд вопросов о механизме формирования образующихся комплексов, координации ДНК-связывающей активности разных доменов и, наконец, функциональной роли доменов и субъединиц белка, не отвечающих за высокоаффинное взаимодействие с ДНК-субстратом. Таким образом, исследование "архитектуры" комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, а также механизма их формирования представляет значительный интерес и является актуальным.
Физические методы исследования отдельных белков и комплексов белков с лигандами, такие как рентгеноструктурный анализ (РСА) и метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР), зарекомендовали себя в качестве наиболее информативных подходов. В то же время каждый из этих методов имеет свои ограничения. Например, метод рентгеноструктурного анализа не всегда применим из-за проблем при кристаллизации сложных биологических комплексов. Кроме того, РСА, как правило, не дает представлений о динамике взаимодействия белков с лигандом. Метод ЯМР является достаточно дорогим в связи с необходимостью использовать большие количества исследуемого биополимера, кроме того, существуют очень жесткие ограничения на размер изучаемого объекта. В связи с этим, одним из наиболее приемлемых подходов является метод фотоаффинной модификации.
Метод фотоаффишюй модификации основан на введении в молекулу лиганда реакционноспособной группы, не влияющей драматическим образом на специфическое узнавание и связывание его ферментом. Подход предполагает образование специфического комплекса аналога лиганда с биополимером и последующее ковалентное присоединение аналога лиганда к аминокислотным остаткам, формирующим активный центр белка или находящимся в непосредственной близости от активного центра. Полученные структурные данные позволяют сделать вывод о расположении и организации участков связывания субстратов в молекуле биополимера. Подход наиболее эффективен при изучении сложных многосубстратных ферментов и надмолекулярных структур. Комбинация фотоаффинной модификации с другими биохимическими подходами, такими как метод ограниченного протеолитического расщепления, а также метод сайт-направленного мутагенеза, позволяет эффективно изучать механизмы междоменного и межсубъединичного взаимодействия в белках и их комплексах с лигандами. Использование широкого спектра фотоаффинных реагентов, обладающих самой различной эффективностью и селективностью модификации биополимера, открывает возможности исследования комплексов различной структуры и сложности. Данный подход позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белка с
лигандом, являющиеся промежуточными в динамичных процессах репликации и репарации ДНК.
Целью настоящей работы являлось исследование взаимодействия доменов репликативного белка А человека с частичными ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репликации и репарации ДНК.
В ходе исследования планировалось решить следующие задачи.
Методами фотоаффинной модификации и ограниченного протеолитического расщепления изучить структурную организацию ("архитектуру") комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, то есть расположение и ориентацию субъединиц и доменов белка относительно ДНК.
С использованием мутантных форм белка, лишенных некоторых доменов, исследовать механизмы образования комплексов RPA с частичными ДНК-дуплексами, определить роль отдельных доменов репликативного белка А и изучить взаимодействие этих доменов.
С использованием мутантных форм RPA с определенным субъединичным составом выяснить роль отдельных субъединиц RPA во взаимодействии с ДНК и поддержании его функциональной активности в модельной системе репликации SV-40.
Гомотетрамерные SSB-белки
Согласно общепринятой практике к числу SSB-белков причисляют белки, которые способны с высоким сродством связываться с одноцепочечной формой ДНК, демонстрируя при этом гораздо более низкое сродство по отношению к другим формам ДНК. При этом для белка должно соблюдаться хотя бы одно из нижеследующих условий: 1) ген, кодирующий белок, должен быть необходимым для репликации ДНК; 2) белок должен стимулировать активность репликативной ДНК-полимеразы; 3) белок должен непосредственно взаимодействовать с другими факторами и ферментами репликации; 4) белок должен связывать стехиометрические количества ДНК [6]. Совершенно неудивительно, что при таких достаточно широких критериях отбора известные на сегодняшний момент SSB-белки достаточно сильно отличаются друг от друга по своей структуре. По субъединичному строению их можно разделить на три группы. В первую группу следует отнести гомотетрамерные белки, каждая субъединица (протомер) которых кодирована одним и тем же геном. Следующую группу представляют гомодимерные белки. И, наконец, к белкам третьей группы относятся наиболее сложные в плане организации гетеротримеры, состоящие из трех разных субъединиц.
Кроме различий в субъединичном строении разные группы SSB-белков отличаются и по аминокислотным последовательностям [8, 9, 10], что затрудняет поиск гомологов в уже известных геномах организмов. С другой стороны, интенсивное исследование третичной и четвертичной структур с помощью методов РСА и ЯМР дает возможность выделить общие черты в строении и функционировании такой разнообразной группы белков. Так, в основе строения всех SSB белков, известных на настоящий момент, обнаружен структурный мотив, который называют "ОВ-укладка" (OB-fold -oligosaccharide/oligonucleotide binding fold; укладка, связывающая олигосахариды и олигонуклеотиды) [10].
Большая часть протомеров эубактериальных SSB содержит в своем составе только одну ОВ-укладку, но активные формы этих белков существуют в виде гомотетрамеров. Правилу "один ssb-ген - 1 ОВ-домен" не подчиняются только три из двухсот пятидесяти бактериальных геномов [11-13]. Основой эубактериальных SSB-протомеров является N-концевой ДНК-связывающий домен, в основе которого и лежит ОВ-укладка. С-концевая область SSB-белков этой группы обладает достаточно лабильной структурой [14]. В пределах этой области содержатся консервативные отрицательно заряженные остатки аминокислот, наличие которых характерно для всех эубактериальных SSB.
Наиболее изученным представителем гомотетрамерных белков этого класса является SSB из Е. coli. Этот белок является необходимым для жизнедеятельности клетки, принимает участие в таких важнейших процессах, как репликация, репарация и рекомбинация ДНК. Мономер белка обладает молекулярной массой около 19 кДа и состоит из 177 аминокислотных остатков [15]. Из них 120 а.о. приходится на ДНК-связывающий ОВ-домен. Кроме ДНК-связывающей активности этот домен участвует и в формировании гомотетрамерной структуры и взаимодействии с ОВ-доменами других протомеров. Функциональная форма ecoSSB представляет собой комплекс четырех протомеров, характеризующихся функциональной эквивалентностью. Такой "функционально симметричный" гомотетрамер может образовывать с ДНК несколько различных типов комплексов, отличающихся стабильностью, размерами связанной ДНК, а также "кооперативностью" посадки белка [2].
Вплотную к эубактериальным SSB-белкам примыкают митохондриальные SSB. Интересно отметить, что схожесть аминокислотных последовательностей, к примеру, между белком hsmtSSB из митохондрий человека и ecoSSB составляет всего 36%, однако анализ, проведенный методом РСА, показывает, что структура протомеров этих белков, а также механизм формирования гетеротримерной формы практически одинаковы [16, 17] Белки, кроме того, схожи по своим биохимическим характеристикам [16, 18].
Следующая группа SSB-белков имеет гомодимерное строение. В первую из подгрупп этого типа SSB следует причислить трех представителей домена эубактерий, которые являются исключениями из гомотетрамерных эубактериальных SSB. Это белки из экстремальных термофилов Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Deinococcus radiodurans. Протомеры белков этой подгруппы имеют несвойственные остальным эубактериальным SSB большие размеры. Длина аминокислотных последовательностей tthSSB, taqSSB, draSSB составляет соответственно 263, 264 и 301 а.о., а молекулярный вес протомера 29.9, 30 и 32.6 кДа [19, 20, 21]. Анализ аминокислотных последовательностей этих белков говорит по крайней мере о двух ОВ-укладках в составе каждого протомера.
Между собой эти два ОВ-домена соединены линкером с очень консервативной вторичной структурой, предполагающей образование р-складки [19, 20, 22]. Таким образом, несмотря на то, что рассматриваемые SSB имеют гомодимерное строение, в их составе, как и в остальных эубактериальных SSB, находится четыре ОВ-домена.
Интересно отметить, что ДНК-связывающие домены каждого протомера несут в своей структуре схожие элементы, различающиеся, тем не менее, по аминокислотной последовательности. Методом сравнительного моделирования был найден целый ряд аминокислотных остатков в С-концевом OB-fold домене draSSB, которые соответствуют аминокислотным остаткам из ОВ-укладки эубактериалыюго ecoSSB, участвующим в связывании с ДНК [21, 22]. В то же самое время, в N-концевом домене аналогичная трехмерная модель показывает отсутствие ряда важных связей в комплексе белка с ДНК. Вполне возможно, что такая обнаруженная неэквивалентность доменов будет отражаться на характере взаимодействия полного гомодимера SSB с ДНК, отличая его тем самым от гомотетрамерных эубактериальных SSB.
Другая особенность рассматриваемых белков по сравнению с эубактериальными SSB - это наличие в функциональной гомодимерной форме белка только двух консервативных С-концевых неструктурированных участков, характерных для всех эубактериальных белков [22]. Так как в эубактериальных SSB аналогичные области отвечают за взаимодействие с белковыми партнерами, то можно предположить, что и характер белок-белковых взаимодействий гомодимерных эубактериальных SSB будет отличаться от гомотетрамерных аналогов.
Другой вариант гомодимерных SSB встречается в некоторых организмах царства эуриархеот домена архей. В этих белках структура отдельного мономера еще сильнее отличается от мономеров эубактериальных белков. Как и в первой группе, в составе мономера находится 2 ОВ-укладки, но, в отличие от всех эубактериальных белков в С-концевой части протомера расположен не отрицательно заряженный участок аминокислотных остатков, а структурный элемент "цинковый палец" [23]. Этот элемент не встречается в эубактериальных, зато является непременным атрибутом эукариотических SSB-белков. Следует, однако, заметить, что структура "цинкового пальца" у архейных белков несколько отличается от той, которая содержится в эукариотических SSB.
Участие ssb-белков в клеточных процессах
Как уже упоминалось выше (раздел /./), как SSB, так и RPA являются необходимыми компонентами систем репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Связываясь с оцДНК, белки препятствуют образованию вторичной структуры ДНК, наличие которой тормозит процессы репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Известно, что присутствие SSB-белков увеличивает среднюю скорость синтеза ДНК бактериальными и архейными ДНК-полимеразами [1, 6, 7]. Кроме того, в некоторых случаях повышается и точность синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразами, как, например, в случае ДНК-полимеразы Termus thermophilus, которая сама по себе не обладает корректирующей активностью [5, 76]. Известно, что ряд SSB-белков участвует в непосредственных белок-белковых взаимодействиях с другими факторами и ферментами, например, ecoSSB взаимодействует с Е. Coli polll, gp32 фага Т4 взаимодействует с gp43, gp2.5 фага Т7 также взаимодействует с соответствующей ДНК-полимеразой [3,4, 6].
В свою очередь эукариотические RPA тоже активно взаимодействуют с соответствующими полимеразами. Репликативный белок А человека способен непосредственно взаимодействовать и влиять на активность ДНК-полимеразы 5. Механизм этого взаимодействия, впрочем, сложен, так как для его реализации необходима сборка мультибелкового комплекса, включающего PCNA и RFC [77, 78]. RPA стимулирует работу другой репликативной полимеразы - ДНК-полимеразы а, способствуя ее продвижению через сайты "паузирования" при синтезе ДНК [79]. В экспериментах, проведенных in vitro, было обнаружено, что при этом кроме увеличения процессивности,
RPA повышает точность синтеза ДНК [80]. Предполагают, что в паре с pol a RPA выполняет такую же роль, как и PCNA с рої 5 - эти белки "удерживают" фермент на ДНК-субстрате [80]. Однако стимулирующее действие может смениться ингибирующим. Так, в условиях избытка RPA возникает конкуренция между этим белком и ДНК-полимеразой за связывание с ДНК-субстратом, что приводит к смещению полимеразы с ДНК [80].
Для архейных организмов также есть примеры специфического взаимодействия SSB-белков и соответствующих ДНК-полимераз. Например, полимераза macPolBI из М. acetivorans, так же как и ее функциональный аналог - эукариотическая ДНК-полимераза а, не является высокопроцессивной. Однако известно, что процессивность и скорость синтеза этой полимеразы, а также аналогичных из P. Furiosus и М. acetivorans увеличиваются в присутствии соответствующих архейных аналогов PCNA и RFC, а также любого из трех гомологов macRPA [60, 81]. Диаметрально противоположную ситуацию наблюдали для других архейных представителей - М. thermoautotrophicus и М. kandleri. SSB-белки этих организмов в широком концентрационном диапазоне способны ингибировать действие соответствующих ДНК-полимераз [23, 59]. Интересно, что ингибирование носит высокоспецифический характер и, по-видимому, не связано с блокированием ДНК-субстрата SSB-белком, т.к. бактериальный ecoSSB не способен оказать такого действия на ДНК-полимеразы mthPolBI и mkaPolBI [23, 59]. Нужно отметить, что непосредственные взаимодействия между mthPolBI и mthRPA могут быть зафиксированы методами иммунопреципитации и совместного центрифугирования в градиенте плотности [59].
В настоящее время можно рассматривать две общие модели, по которым идет считывание и коррекция информации, заложенной в ДНК в клетке: модель заранее сформированных белковых ансамблей - "суперфермента" и модель динамического подхода к работе с ДНК - концепция "передачи ДНК-субстрата" от одного белка или белкового комплекса другому [75]. Первая модель предполагает сборку больших белковых комплексов, в которых находятся практически все участники предстоящих ферментативных превращений ДНК. Согласно этой модели после сборки происходит продвижение такого комплекса вдоль процессируемой ДНК (или, наоборот, продвижение ДНК через такой комплекс) с последовательным выполнением всех ферментативных стадий мультибелковым "суперферментом". К этой модели следует отнести концепцию реплисомы, сформулированную на основании результатов исследования системы репликации прокариот [82, 83]. Вторая модель предполагает динамическое связывание и диссоциацию лишь некоторых белковых факторов, активность которых требуется на данном конкретном этапе процессинга ДНК (см. например [84, 85]). При этом в остальное время белковые факторы находятся в свободном состоянии в клеточном ядре. Таким образом, главное отличие от предыдущей схемы заключается в меньшем размере мультибелкового ферментативного комплекса и особой роли слабых взаимодействий, которые позволяют динамично формировать и менять состав участников. Динамичность, свойственная этой модели, представляет большие возможности для регуляции процесса. Такой механизм функционирования рассматривают в качестве механизма эксцизионной репарации нуклеотидов и гомологичной рекомбинации [84, 85].
Модели функционирования белков в процессах репликации и репарации ДНК. (А) Гипотетическая модель реплисомы [83] (обозначения участников: RFC (1), PCNA (2), Pol 5(є) (3), RPA (4), геликаза (5), ДНК-полимераза а-праймаза (6), РНК-ДНК-праймер - РДП (7)). (Б) Модель эксцизионной репарации нуклеотидов [86] (обозначения участников XPOHR23B (1), TFIIH (2), ХРА (3), RPA (4), XPG (5), XPF (6), pol 5 (7), RFC (8), PCNA (9)).
В рамках обеих моделей особое внимание уделяют таким характеристикам белков, как наличие нескольких центров связывания и возможности связывания этими центрами разных лигандов, будь то ДНК или белок. Эти два свойства должны обеспечить возможность формирования целого набора сложно организованных белок-нуклеиновых комплексов. Конкуренция за один и тот же связывающий центр между двумя молекулами лиганда позволяет реализовать возможность перехода одного типа комплекса в другой и механизм передачи субстрата (будь то ДНК субстрат или заранее сформированный белок-нуклеиновый комплекс) от одного белка к другому [75].
Многоцентровые взаимодействия SSB-белков с лигапдами
В общем случае белки, участвующие в процессах, связанных с ДНК, отличает модульность строения. Несколько доменов такого белка выполняют разные биохимические функции. Между собой эти структурно-функциональные участки соединены подвижными гибкими линкерными областями. С одной стороны, каждый из доменов оказывается высокоспециализированным для оптимального выполнения конкретной биохимической активности, с другой, объединение разных доменов в одном белке позволяет координировать эти активности между собой. Модульность строения белков определяет специфику функционирования мультибелковых комплексов - в них образуется сразу несколько контактов между любой парой участников [82, 84, 85]. Стадии же ферментативного превращения проходят без диссоциации белка из комплекса, а лишь с заменой одних связей в комплексе другими, вызывающей изменение структурной организации комплекса [84]. Характерной особенностью таких комплексов является то, что константа диссоциации каждого отдельного белка из комплекса может варьировать в больших пределах и может достигать наномолярных значений в зависимости от того, сколько контактов образуется между этим белком и его партнерами [75]. С другой стороны, тот факт, что компоненты комплекса взаимодействуют посредством сразу нескольких связывающих центров, обеспечивает несколько возможных путей регулирования этих взаимодействий. В качестве примера можно рассмотреть работу репликативного мультибелкового комплекса, состоящего из рої 5, репликативного фактора С (RFC) и репликативного белка А. В ходе репликации RFC взаимодействует с RPA тремя из пяти своих субъединиц [77]. Считается, что на поверхности RPA расположены два сайта связывания с RFC, причем один из них перекрывается с сайтом связывания с рої 8
Особенности конформации rpa в его комплексах с днк (по данным метода ограниченного протеолитического расщепления)
Метод ограниченного протеолитического расщепления белков зарекомендовал себя достаточно информативным подходом к исследованию комплексов с участием белковых молекул, в общем случае не требующим специальной дорогостоящей аппаратуры. Проведение экспериментов предполагает использование ферментативной активности протеаз, как широкого спектра действия, так и специфически распознающих определенные аминокислотные остатки. В рамках этого подхода исследователи получают информацию о доступности тех или иных протеолитических сайтов в структуре белка и на основании этой информации делают выводы о конформационных перестройках, происходящих в белковой молекуле, и поверхностях взаимодействия, если изучаются белок-белковые или белок-нуклеиновые комплексы.
Метод ограниченного протеолитического расщепления был ранее использован для анализа RPA, находящегося как в свободном состоянии в растворе, так и в комплексе с одноцепочечной ДНК [69]. Однако основной акцент в цитируемой работе был сделан на идентификацию структурных доменов белка, а не на анализ конформационных перестроек гетеротримера, происходящих при его связывании с оцДНК. В нашей работе было проведено детальное исследование укладки белковой глобулы в зависимости от типа связывания RPA с ДНК. Для этого мы изучали отличия в профилях протеолитического расщепления RPA, полученных в присутствии различных ДНК-структур, от профиля расщепления свободной формы белка в растворе. Под термином "профиль протеолитического расщепления" мы подразумеваем набор пептидных фрагментов, образуемых при протеолитическом расщеплении белка на определенную ее глубину.
Условия проведения ограниченного протеолитического расщепления RPA
Критерием выбора фермента-протеазы, применяемой при исследовании конформации белка или поверхностей взаимодействия методом ограниченного протеолитического расщепления, должно служить наличие специфически расположенных сайтов расщепления. Эти сайты должны быть доступны в одном состоянии белка и скрыты в другом. Кроме того, обработка протеазой должна приводить к формированию легко различимых стабильных протеолитических фрагментов.
Из ферментов, имеющихся в распоряжении, выбор был остановлен на трех протеазах с разной специфичностью: субтилизин А, папаин и трипсин. Субтилизин А (ЕС 3.4.21.62) является сериновой протеазой широкого спектра действия, субстрат которой должен содержать с N-конца от разрываемой пептидной связи стерически большой незаряженный остаток аминокислоты. Папаин (ЕС 3.4.22.2) представляет собой цистеиновую протеазу также широкого спектра действия, которая расщепляет пептидную связь, расположенную в направлении С-конца и отстоящую на один аминокислотный остаток от большого гидрофобного бокового радикала. Кроме того, папаин не расщепляет пептидную связь с N-конца от остатка валина. И, наконец, для высокоспецифичной сериновой протеазы, трипсина (ЕС 3.4.21.4), с N-конца от разрываемой пептидной связи должен находится остаток аргинина или лизина.
После обработки RPA субтилизином А или папаином и последующего электрофоретического разделения протеолитических фрагментов мы наблюдали появление множественных продуктов расщепления с молекулярными массами в районе от 16 до 20 кДа (рис. 3.2А). Идентификация этих пептидов после их разделения одномерным гель-электрофорезом в денатурирующих условиях представляет практически невыполнимую задачу. С другой стороны, использование высокоспецифичной протеазы, такой как трипсин, приводит к легкочитаемому и информативному характеристичному профилю расщепления (рис. 3.2Б).
Анализ продуктов ограниченного протеолитического расщепления RPA различными протеолитическими ферментами, проведенный с помощью гель-электрофореза по Лэммли и окраски серебром (см. гл. Материалы и методы). Профили протеолитического расщепления протеазами широкого спектра действия (А) и высокоспецифичной протеазой (Б). Справа указаны положение и молекулярные массы маркерных белков (дорожка А/), слева - положения субъединиц нативного RPA (дорожка R).
Ограниченное число хорошо разделяемых продуктов деградации обусловило наш окончательный выбор именно в пользу последней протеазы. С другой стороны, у всех трех профилей протеолитического расщепления есть общие черты, что говорит о схожих путях протеолитического расщепления RPA независимо от типа выбранной протеазы. Так, можно отметить, что ни одна из протеаз не расщепляла субъединицу р14. а субъединица р70 на начальных стадиях гидролизовалась с образованием достаточно стабильного пептида с молекулярной массой около 53 кДа.
Анализ расположения сайтов протеолитического расщепления RPA
Проделанная работа по подбору протеолитического фермента (раздел 3.1.1. Г) еще раз демонстрирует, что для успешного применения метода сайты расщепления должны находится в областях междоменного, межсубъединичного взаимодействия или в области взаимодействия белок-лиганд. Для того, чтобы определить, где располагаются места протеолитического расщепления RPA с помощью трипсина, необходимо было идентифицировать образующиеся пептидные фрагменты (рис. 3.3). Следует отметить, что в этой серии экспериментов схема их проведения была изменена. Если ранее глубину прохождения расщепления изменяли, варьируя времена инкубации RPA с протеазой (рис. 3.2Б), то в последующих экспериментах варьировали молярное соотношение ЯРА:трипсин (рис. 3.3). Сравнение профилей расщепления, полученных в тех и других экспериментах, не выявило принципиальных отличий.
Роль малых субъединиц rpa в составе гетеротримера
Схема протеолитического расщепления субъединицы р70 RPA под действием трипсина в присутствии ДНК-дуплексов, составленная на основании анализа профилей протеолитического расщепления RPA (раздел 3.1.1.5, рис. 3.9). Серыми стрелками показано расположение сайтов расщепления субъединицы р70 и ее фрагментов фр.З и фр.5б, вновь образованные при этом протеолитические фрагменты обозначены выше или ниже стрелки. Наиболее доступные сайты расщепления указаны черными стрелками, наименее доступные - светло-серыми стрелками. Положения протеолитических сайтов, доступность которых зависит от размера одноцепочечного участка ДНК-дуплекса, отмечены звездочками.
Среди других ярко выраженных отличий можно отметить появление заметных количеств протеолитического продукта фр.5б. Такой фрагмент образуется из фр.З при расщеплении по сайтам, расположенным в домене р70С (рис 3.9 и 3.10). Фрагмент фр.5б несет в своем составе интактный кластер ДНК-связывающих доменов р70АВ и часть р70С, и может быть далее расщеплен протеазой в районе остатка Lys-473 домена р70С с образованием еще одного фрагмента массой 33 кДа. Однако, при протеолизе свободной формы белка или в присутствии одноцепочечных олигонуклеотидов оба эти полипептида или практически отсутствуют, или обнаруживаются в весьма незначительных количествах. Фрагмент фр.5б также может быть атакован протеазой по сайтам домена р70В с образованием фрагмента фр.9б. Последний уже несет в себе только один неповрежденный ДНК-связывающий домен - р70А, но его наличие не является характерным для профилей расщепления, полученных в присутствии ДНК, так как он может образовываться из фрагментов фр.З и фр.5а и при протеолизе свободного белка (рис. 3.8, 3.9 и 3.10).
Изменение доступности протеолитических сайтов в зависимости от размера связанного одноцепочечного участка модельных ДНК-дуплексов наиболее ярко можно продемонстрировать, рассмотрев пути протеолитического расщепления фрагмента фр.З. Наличие в реакционной смеси модельных ДНК-дуплексов с короткими выступающими одноцепочечными участками, например ДЦ-5, приводит к стабилизации фрагмента фр.З (рис. 3.9В). Следовательно, на начальных этапах расщепления присутствие такой ДНК подавляет действие протеазы по сайтам, расположенным в домене р70В и в линкере между р70В и р70С. Такой же эффект проявлялся и в присутствии модельной ДНК с более длинным одноцепочечным участком - ДЦ-9, одновременно с этим наблюдали увеличение доступности протеолитических сайтов в составе домена р70С (рис. 3.9Г). Увеличение размера одноцепочечного участка модельной ДНК до 17нт и больше (ДЦ-17, ДЦ-33) приводит к тому, что фрагменты фр.5б, 33 кДа, фр.9б появляются только при использовании очень высоких концентраций трипсина (рис. 3.9Д и 3.9Е). Это уже, в свою очередь, является свидетельством обратного процесса - подавления протеолитического гидролиза в домене р70С в присутствии ДЦ-17 и ДЦ-33.
Вышеописанные изменения путей расщепления, по-видимому, отражают последовательное изменение доступности сайтов протеолиза в составе ДНК-связывающих доменов субъединицы р70, происходящие по мере увеличения длины одноцепочечного участка связанной ДНК (рис. 3.11). О взаимодействии этих доменов непосредственно с одноцепочечной частью модельной ДНК можно рассуждать, проводя аналогии с механизмами образования комплексов с одноцепочечной ДНК. Для комплексов, сформированных по типу RPA10, основную ДНК-связывающую роль играют домены р70А и р70В. Тогда правомерно предположить, что за связывание с коротким одноцепочечным участком в составе модельной структуры ДЦ-9 отвечает тандем этих доменов, что приводит к экранированию домена р70В от действия протеаз. При этом укладка субъединицы р70 на одноцепочечный участок ДНК, расположенный в непосредственной близости от перехода оцДНК-дцДНК, сопровождается также конформационными изменениями, которые приводят к увеличению числа разрывов в домене р70С. Однако этот самый домен р70С участвует в непосредственных взаимодействиях с более длинными одноцепочечными участками модельных ДНК ДЦ-17 и ДЦ-33, при этом экранируются протеолитические сайты в его составе. Такая форма укладки отражает архитектуру комплексов с оцДНК. сформированных по типу RPA17 [65, 50].
. Модель изменения пути протеолитического расщепления субъединицы р70 RPA в зависимости от укладки ДНК-связывающих доменов белка на одноцепочечные участки частичных ДНК-дуплексов (составлено на основании результатов, представленных в разд. 3.1.1.5, на рис. 3.9 и 3.10). Серыми стрелками показано расположение некоторых сайтов расщепления субъединицы р70 и ее фрагментов фр.З и фр.5б. Рядом со стрелками отражено влияние частичных ДНК-дуплексов на доступность сайтов, а также предполагаемое расположение ДНК-связывающих доменов RPA в комплексе с ДНК.
Ранее было показано, что в присутствии одноцепочечного олигонуклеотида с1(Т)зо характер и скорость протеолитического расщепления субъединицы р32 значительно изменяются по сравнению с расщеплением свободной формы белка [69]. Судя по условиям проведения экспериментов, изменение в профиле протеолитического расщепления р32 происходит в случае формирования комплексов с оцДНК по типу RPA30. Согласно предполагаемой схеме в таком типе комплексов домен p32D непосредственно связан с ДНК. Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что белковая молекула гетеротример RPA "вытянута" вдоль ДНК. что. вполне возможно, и приводит к значительному изменению в чувствительности к действию протеаз [66]. Однако, в случае модельных ДНК-дуплексов с выступающими одноцепочечными участками (рис. 3.7 и 3.9) ни для субъединицы р32, ни для ее фрагмента фр.7 не наблюдали вышеописанных значительных отличий в скорости деградации. Незначительная стабилизация р32, обусловленная уменьшением частоты отщепления ее N-концевого участка p32N, сопутствует образованию комплексов с модельными ДНК ДЦ-17 и ДЦ-32, несущими протяженный одноцепочечный участок. На основании неизменности характера протеолитического расщепления этой субъединицы в присутствии модельных ДНК-дуплексов можно сделать вывод о том, что при связывании модельной ДНК домен p32D, по-видимому, не принимает участия в контактах с одноцепочечной выступающей частью ДНК. Такое поведение субъединицы отличает способ формирования комплексов RPA с модельными ДНК-дуплексами от наблюдаемого при связывании одноцепочечной ДНК в варианте RPA30.
