Введение к работе
Актуальность проблемы
Современная модель инициации трансляции эукариотических мРНК предполагает, что 40S рибосомная субчастица совместно с факторами инициации связывает 5'-конец мРНК. Это связывание происходит за счет специфического взаимодействия фактора инициации elF4E с кеп-структурой (7-метилгуанозин, соединенный с 5'-концевым нуклеозидом 5'-5'-трифосфатной связью) мРНК. Затем 40S рибосомная субчастица "сканирует" мРНК до первого, находящегося в благоприятном нуклеотидном контексте, AUG-кодона. Расплетание вторичной структуры 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) мРНК при этом производят факторы инициации elF4A, elF4B и elF4G. После нахождения нужного инициаторного кодона к малой рибосомной субчастице присоединяется 60S субчастица, и образовавшийся 80S комплекс начинает синтез белка.
Описанная модель предъявляет определенные требования к структуре мРНК. Подавляющее большинство эукариотических мРНК кепированы, моноцистронны и содержат относительно короткие (50-100 нуклеотидов) и слабо структурированные 5'-НТО. Инициация трансляции таких мРНК происходит обычно на ближайшем к б'-концу инициаторном AUG-кодоне. Такой механизм инициации называется кеп-зависимым. Оказалось, что к ряду мРНК этот механизм инициации трансляции неприменим в силу иного строения их 5'-НТО. Для таких мРНК была предложена модель внутренней (кеп-независимой) инициации трансляции. В соответствии с этой моделью 40S рибосомная субчастица связывается непосредственно с внутренним участком 5'-НТО мРНК, так называемым участком внутреннего связывания рибосомы, или IRES (internal ribosome entry 8йе)-элементом. Впервые подобный механизм инициации трансляции был предложен для мРНК пикорнавирусов, 5'-НТО которых не кепированы, весьма протяженны, сильно структурированы и содержат до 11 AUG-триплетов, предшествующих истинному инициаторному кодону.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ! БИБЛИОТЕКА СИ О»
4 Впоследствии IRES-элементы обнаружили и в мРНК вирусов других групп.
Синтез белка на вирусных мРНК обеспечивается трансляционным аппаратом
инфицированной клетки млекопитающих, при этом используются канонические
факторы инициации. Это послужило основанием для предположения, что некоторые
клеточные мРНК также способны к внутренней инициации. Список мРНК
млекопитающих, содержащих IRES-элементы, постоянно увеличивается и в
настоящее время включает мРНК 50-60 белков, важных для роста, дифференцировки
и функционирования клетки. Тем не менее, молекулярные механизмы внутренней
инициации трансляции на IRES-элементах клеточных мРНК до сих пор не известны.
Поиск новых IRES-элементов, а также изучение их строения и функционирования
необходимы для выяснения механизмов внутренней инициации трансляции в целом.
Цель работы
Синтез белков теплового шока в клетках млекопитающих активируется при кратковременном повышении температуры до 42С. При этом происходит снижение общего уровня белкового синтеза за счет инактивации кеп-связывающего фактора инициации трансляции elF4E. В этих условиях эффективность синтеза белков теплового шока не только не снижается, а наоборот, возрастает и остается повышенной в течение некоторого времени после возврата к нормальной температуре. Цель настоящей работы — изучение механизма инициации трансляции мРНК одного из белков теплового шока, HSP70, а также определение участков 5'-НТО MPHKHSP70, важных для взаимодействия с трансляционным аппаратом клетки.
Научная новизна и практическая ценность
В настоящей работе впервые показано, что мРНК HSP70 содержит IRES-элемент, активность которого в 4-5 раз выше активности IRES-элемента риновируса и сравнима, с активностью- IRES-элементов пикорнавирусов. Определены границы участка внутреннего связывания рибосомы и важные для инициации трансляции районы в .самом IRES-элементе. Полученные результаты имеют важное значение для
5 понимания молекулярных механизмов инициации трансляции мРНК млекопитающих.
Накопление данных об IRES-элементах мРНК млекопитающих позволит понять
механистические аспекты регуляции инициации белкового синтеза в клетках эукариот.
Публикации и апробация работы
По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 статьи в отечественных и международных журналах. Результаты работы докладывались на международных конференциях The Dynamics of Ribosome Structure and Function" (Queenstown, New Zealand. 27th January- 1st February, 2002), "8th Annual Meeting of the RNA Society" (Vienna, Austria. July 1 - July 6, 2003), III съезде Биохимического общества (Санкт-Петербург, июнь-июль 2002), The 5th International Engelhardt Conference on Molecular Biology" (Moscow, June 21 -26, 2001).
Структура и объем работы
