Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1 Общие свойства урацилов 9
1.1.1 Нуклеиновые основания и спонтанные мутации 10
1.1.2 Кето-енольная таутомерия урацилов 13
1.1.3 Анионные формы урацилов в водных растворах 18
1.1.4 Кристаллическая структура урацилов 21
1.2 Фотофизика и фотохимия урацилов 23
1.2.1 Спектроскопия поглощения урацилов 23
1.2.2 Спектроскопия люминесценции урацилов 26
1.2.3 Фотохимия нуклеиновых кислот и пиримидиновых оснований 30
1.3 Флуоресценция из высоковозбужденных синглетных состояний органических молекул 39
1.4 Супрамолекулярные комплексы-включения циклодекстринов 43
1.4.1 Строение и свойства циклодекстринов 43
1.4.2 Влияние циклодекстринов на спектрально-люминесцентные характеристики молекулы-гостя 45
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 48
2.1 Используемые реагенты 48
2.2 Квантово-химические расчёты 49
2.3 Приготовление комплексов включения 5-фторурацила с -циклодекстрином 51
2.4 Стандартное спектральное оборудование 52
2.5 Определение квантового выхода флюоресценции 53
2.6 Приготовление и методы исследования твердых образцов 5-фторурацила 53
2.7 Определение pH растворов 53
ГЛАВА 3. Обсуждение полученных результатов 54
3.1 Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных и анионных форм 5-фторурацила и тегафура в водных растворах 54
3.1.1 Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных таутомеров 5-фторурацила и тегафура в нейтральных водных растворах 54
3.1.2 Спектрально-люминесцентное исследование анионных форм 5-фторурацила и тегафура 70
3.2 Фотохимия кристаллического 5-фторурацила. 81
3.3 Сверхбыстрые излучательные S2S0 переходы урацилов в водных растворах 94
3.4 Спектрально-люминесцентное исследование комплексов включения 5-фторурацила с -циклодекстрином в нейтральных и кислых водных растворах 107
Выводы 118
Литература. 119
- Кето-енольная таутомерия урацилов
- Флуоресценция из высоковозбужденных синглетных состояний органических молекул
- Стандартное спектральное оборудование
- Спектрально-люминесцентное исследование анионных форм 5-фторурацила и тегафура
Кето-енольная таутомерия урацилов
В 1953 г. была расшифрована структура ДНК, что стало переломным моментом в развитии биологической науки. За выдающийся вклад в это открытие в 1962 г. была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине Фрэнсису Крику, Джеймсу Уотсону и Морису Уилкинсу. Предложенная Уотоном и Криком двухцепочечная модель ДНК [9] удовлетворяла принципу комплементарности нуклеиновых оснований [10] и результатам рентгенограмм, полученным Розалинд Франклин [11, 12], без которых невозможно было бы сделать выводы о структуре ДНК. Такая структура образуется из двух взаимно комплементарных антипараллельных полидезоксирибонуклеотидных цепей, закрученных в правую спираль относительно друг друга и общей оси. При этом азотистые основания обращены внутрь двойной спирали, а сахарофосфатный остов – наружу.
С точки зрения химии ДНК представляет собой длинную полимерную структуру, состоящую из повторяющихся блоков – нуклеотидов. Нуклеотиды образованы из азотистого основания, сахара (дезоксирибозы) и фосфатной группы и связываются в цепи через дезоксирибозу и фосфодиэфирные связи. Цепи в двойной спирали антипараллельны, их 5 ,3 -межнуклеотидные фосфодиэфирные мостики противоположно направлены. В ДНК имеются четыре нуклеиновых основания – аденин (A), гуанин (G), тимин и цитозин. Нуклеиновые основания одной цепи соединены с нуклеиновыми основаниями другой цепи водородными связями. Исходя из принципа комплементарности, A соединяется только с T, G – только с C [13, 14]. Во всех случаях в ДНК содержание A и T одинаково, также как G и C. Кроме того, между G и C возникают три водородные связи (GC), а между A и T – две (A=T). Существование других пар оснований в двухцепочечной спирали в нормальных условиях невозможно.
В работе [15] Уотсоном и Криком, была выдвинута теория о механизме репликации ДНК, при которой происходит передача генетической информации от материнской клетки дочерним. Последовательность нуклеотидов в одной цепи комплементарна последовательности в другой. При делении клеток происходит разделение этих цепей с помощью ферментов. Обе цепи становятся матрицей для постройки новых комплементарных цепей. Шаг за шагом происходит синтез цепи из мононуклеотидов. Таким образом, комплементарностью нуклеотидов и их стабильностью обеспечивается передача ДНК дочерним клеткам без изменений.
Однако комплементарность пар нуклеотидов может нарушаться из-за вероятности образования их редких таутомерных форм, что может приводить к появлению точечных спонтанных мутаций [15]. В дезокситимидине (рисунок 1.1.3) первое положение занято сахарным остатком (дезоксирибоза) и вместо дикето таутомера возможно образование 2-гидрокси и 4-гидрокси форм.
При комнатной температуре урацильный остаток нуклеозида (гликозидная связь по положению N1) может принимать редкие таутомерные формы с частотой около 10-9, которая попадает в область частоты обнаруживаемых спонтанных мутаций 10-8-10-11 [16]. В случае образования 4-гидрокси таутомера дезокситимидина, возможно появление пары G, приводящая к нарушению комплементарности нуклеотидов (рисунок 1.1.4). Авторами работ [17, 18] подтверждена возможность существования такой пары нуклеотидов.
В данном случае между молекулами образуются три водородные связи, что не характерно для тимина в паре А-Т. Поскольку комплементарность пар нуклеотидов контролируется также ферментными системами, такое нарушение может быть исправлено или закреплено в геноме в виде мутации.
Таким образом, спонтанные точечные мутации возникают вследствие образования редких енольных таутомерных форм нуклеотидов во время репликации ДНК. С одной стороны, происходит нарушение в передаче наследственной информации, что может приводить также и к раковому перерождению клетки, но с другой, – такие спонтанные мутации в комбинации с естественным отбором приводят к появлению более совершенных организмов.
По этой причине изучение образования минорных таутомерных и ионных форм нуклеиновых оснований представляет значительный интерес.
Флуоресценция из высоковозбужденных синглетных состояний органических молекул
Спектры поглощения растворов урацилов регистрировали на спектрофотометре “Specord M-40”, скорректированные спектры возбуждения и излучения ФЛ на спектрофлюориметре “СМ-2203”. Для регистрации спектров возбуждения и ФЛ твердых образцов урацилов использовали приставку для твердых образцов с регистрацией ФЛ под углом 37.5.
Спектры ЯМР 1Н зарегистрированы на спектрометре «Bruker АМ-300» с рабочей частотой по протонам 300 МГц. Измерения проведены на оборудовании ЦКП «Химия» ИОХ УНЦ РАН. Для регистрации спектров ЭПР использовали спектрометр трехсантиметрового диапазона Bruker EMX (Bruker Biospin GmbH, Германия). В качестве эталонов интенсивности и g-фактора применялись 1,1 -дифенил-2-пикрилгидразил (ДФПГ) (g=2.0036) и Bruker Strong Pitch (g=2.0028). Точность определения величины g-фактора была не менее ±0.0002. 2.5 Определение квантового выхода флюоресценции
Квантовые выходы ФЛ урацила и его производных в растворах определяли по методике [193] с использованием внешнего стандарта - Тгр, по уравнению: ф = тгр X(SXA тгр)/ (Sтгр ХA), (2.3.1) где (р - квантовый выход ФЛ урацила или его производного, тгр -квантовый выход ФЛ Trp ( Тгр = 0.14 [194]), S и A - светосумма под полосой ФЛ и оптическая плотность поглощения урацилов на длине волны возбуждающего света, соответственно, Sтгр и AТтр- то же для триптофана.
Тонкие слои кристаллических образцов FU готовили упариванием его водных растворов на боковой поверхности кварцевой кюветы (l = 2 мм) и облучали светом ксеноновой лампы на длине волны возбуждающего света А.ех= 265 нм непосредственно в кюветном отделении спектрофлюориметра. Интенсивность светового потока при фотооблучении, которая составила квант/(см с), определяли с помощью радиационного компенсированного термоэлемента РТН-1У. Рекомбинационную люминесценцию регистрировали на фотометре с чувствительностью 10 квант/с. Кислотность среды определяли лабораторным цифровым pН-метром ОР-211/1 с применением pН-чувствительного комбинированного стеклянного электрода типа OP-0808P (точность измерения p H составляла 0.01 единиц). Калибровка электрода проводилась с помощью стандартных буферных растворов. Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных и анионных форм 5-фторурацила и тегафура в водных растворах
Начиная с работ Уотсона и Крика [9, 15], принято считать, что присутствие енольных и анионных форм нуклеиновых оснований является причиной спонтанных точечных мутаций, что и обуславливает важность исследования данных форм природных пиримидинов и их производных.
Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных и анионных форм были проведены на примере 5-фторурацила и тегафура.
Спектрально-люминесцентное исследование кето-енольных таутомеров 5-фторурацила и тегафура в нейтральных водных растворах
На рисунке 3.1.2 приведены спектры поглощения, скорректированные спектры возбуждения и флуоресценции 5-фторурацила в воде (рН 6.5). Спектр 3 ФЛ с max.fl = 340 нм (рисунок 3.1.2) получен при возбуждении светом в максимуме поглощения 5-фторурацила 265 нм, и соответствует данным спектроскопических исследований водных растворов FU [19, 74]. Рисунок 3.1.2 - Спектры 5-фторурацила в воде: 1 - поглощения; 2 -возбуждения ФЛ (Лem = 470 нм); 3 - ФЛ. (c(FU) = 10-4 моль/л, /Цex = 265 нм, рН 6.5, 298 К).
В работе [19] была зарегистрирована ФЛ FU в более длинноволновой области, которую авторы предположительно отнесли к суммарному излучению минорных форм. Тем не менее, индивидуальные спектры ФЛ енольных таутомеров ранее не наблюдали.
Обращает на себя внимание несоответствие спектров поглощения (спектр 1, рисунок 3.1.2) и возбуждения (спектр 2, рисунок 3.1.2) ФЛ 5-фторурацила. Такие различия встречаются не часто и возможны лишь в том случае, если наблюдается излучение нескольких эмиттеров с существенно отличающимися квантовыми выходами ФЛ и перекрывающимися спектрами поглощения. Это навело нас на мысль о возможности спектрально-люминесцентного обнаружения редких таутомерных форм, при их селективном фотовозбуждении в максимумах и перегибах в спектре возбуждения (спектр 2, рисунок 3.1.2). Тщательное сканирование по частотам возбуждающего света с шагом в 1 нм позволило нам впервые экспериментально зарегистрировать излучение четырех таутомерных форм FU, с максимумами при 340, 378, 414 и 434 нм, (рисунок 3.1.3).
Нормированные по максимуму скорректированные спектры флуоресценции 5-фторурацила в нейтральных водных растворах, полученные при возбуждении светом 1ех: 1 - 265 нм, 2 - 305 нм, 3 - 320 нм и 4 - 345 нм (c(FU) = 10 моль/л, рН 6.8, 298 К).
Однозначность отнесения полосы ФЛ с /imax.fi = 340 нм (спектр 1, рисунок 3.1.3) к таутомеру A FU не вызывает сомнения и согласуется с литературными данными [19, 74]. К сожалению, на сегодняшний день в практике квантово-химических расчетов отсутствуют данные по вероятности излучательных переходов таутомерных форм FU в водных растворах. В этой связи корректное отнесение, обнаруженных длинноволновых полос ФЛ к тому или иному таутомеру 5-фторурацила возможно лишь на основании эксперимента.
Стандартное спектральное оборудование
С. И. Вавиловым было установлено, что квантовый выход ФЛ не зависит от частоты возбуждающего света [141]. Иными словами, независимо от того на какой электронно-возбужденный синглетный Sn-уровень (n 1) перешла молекула при поглощении кванта света, вследствие сверхбыстрых ( 1012 с-1) безызлучательных Sn Sn–1 переходов излучение всегда осуществляется с S1-уровня, и спектр ФЛ неизменен при варьировании длины волны возбуждающего света. Однако, следует отметить, что закон Вавилова носит полуэмпирический характер и нет строгого запрета для ФЛ с более высоковозбужденных синглетных Sn (n 1) уровней.
Первым надежно установленным примером нарушения закона Вавилова о независимости квантового выхода флуоресценции от частоты возбуждающего света является ФЛ азулена [142]. Авторы показали, что ФЛ раствора азулена при прямом возбуждении во вторую или более коротковолновые полосы поглощения происходит при переходе со второго возбужденного уровня на основной (S2 S0 - переход), минуя первое синглетное S1-состояние (вследствие запрета излучательного S2 S1-перехода), что приводит к уменьшению квантового выхода ФЛ с S1-уровня.
По правилу “энергетического интервала”, малая вероятность внутренней S2 S1-конверсии обусловлена большой энергетической щелью между этими уровнями и малым изменением конфигурации молекулы в синглетном S2- состоянии. Вследствие этого, долгое время (и по сей день) бытовало мнение, что “аномальная” S2 S0 ФЛ может быть зарегистрирована только у соединений с большим энергетическим зазором между S2- и S1-уровнями (E(S2 – S1)). Следует оговориться, что, прочно утвердившийся в научной литературе термин “аномальная” S2 S0 ФЛ весьма условен, поскольку, как было сказано выше, строгого запрета для S2 S0 излучательного перехода не существует.
Тем не менее, впоследствии были обнаружены примеры нарушения закона Вавилова и для соединений со значительно меньшим энергетическим зазором между S2 и S1 уровнями, нежели для азулена: Zn-тетрабензопорфирина (E(S2 – S1) = 7400 см-1), бриллиантового зеленого (E(S2 – S1) = 6300 см-1) и др. [209].
Большинство фотохимических реакций, например перенос электрона, протекают со скоростями, превышающими безызлучательные переходы между высоковозбужденными синглетными Sn (n 1)-состояниями в молекулах органических соединений [209]. В последние годы, прогресс в развитии фемтосекундной техники сделал доступными прямые измерения времен жизни ФЛ пиримидиновых оснований [74]. Оказалось, что время жизни первого синглетно возбужденного уровня у урацила и его производных в растворах экстремально короткое – менее пикосекунды, что на три порядка ниже, характерных для большинства органических молекул времен жизни люминесценции.
Чрезвычайно короткие субпикосекундные времена жизни ФЛ структурных элементов ДНК и РНК - урацила и тимина, с одной стороны определяют высокую фотохимическую стабильность нуклеиновых кислот к повреждающему действию УФ-света, с другой позволяют предположить возможность излучательного S2 S0 перехода со второго возбужденного S2-уровня на основной. Наше предположение базировалось на том, что сверхбыстрая S1 S0 безызлучательная дезактивация (внутренняя конверсия) в молекулах урацила и его производных при возбуждении в S2 S0 полосу поглощения может определять конкурентоспособность S2-уровня по отношению к так называемому “флюоресцентному” S1-состоянию.
С целью подтверждения этой гипотезы в данном разделе было изучено влияние частоты возбуждающего света на спектральный состав и квантовый выход ФЛ ряда урацилов в водных растворах и твердом состоянии.
Следует отметить, что тщательный анализ литературных данных по ФЛ урацилов показал, что их фотовозбуждение всегда проводилось исключительно в область длинноволнового S1 S0 поглощения. На рисунке 3.3.1, приведены электронные спектры поглощения урацила, тимина, 5-фторурацила, 5-хлорурацила, тегафура и тиетаноксиметилурацила в нейтральных водных растворах.
Спектры поглощения урацилов характеризуются полосами высокой интенсивности S2 S0 и S1 S0 переходов (рисунок 3.3.1). Установленные значения максимумов и коэффициентов экстинкции S1 S0 переходов U, T FU и ClU (таблица 3.3.1) соответствуют литературным данным [74]
Как можно видеть из таблицы 3.3.1, введение заместителей в молекулу урацила приводит к батохромному сдвигу полосы S1 S0-перехода, который увеличивается в ряду U T FU TF=TOMU ClU. Влияние же заместителей на положение максимума полосы S2 S0-перехода незначительное. Значения энергетических зазоров между S2- и S1-уровнями (E(S2–S1)) исследованных урацилов находятся в области 10500-11700 см-1 (таблица 3.3.1), в то время как, например, для бриллиантового зелёного, для которого обнаруживается S2 S0 флюоресценция, энергетический зазор равен 6300 см-1 [209]. Это позволяет предположить, что для данных соединений также возможно наблюдение излучательного S2 S0-перехода.
Спектрально-люминесцентное исследование анионных форм 5-фторурацила и тегафура
Квантовый выход ФЛ свободного FU составляет в нейтральных водных растворах при рН 7, как было показано выше: ро - 2.2x10 (1 300 К). Значения квантовых выходов ФЛ (рх определяли с использованием внешнего стандарта - Тгр по уравнению: ср-х = xtrp х (SoxDi)/(SixDxrp) ( Ttrp - квантовый выход ФЛ триптофана равный 0.14 [12], S; и Ц - светосумма ФЛ и оптическая плотность поглощения FU на длине волны возбуждающего света (265 нм), соответственно, Sirp и Djrp- то же для триптофана).
Как видно из уравнения 3.4.2, константа равновесия К может быть определена по наклону графика зависимости величины 1/((р{ - (р о) от 1/[CD], а квантовый выход ФЛ комплекса [FU CD] ( рк) из отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат. Линейная зависимость графика в координатах уравнения 3.4.2 (рисунок 3.4.2) в широком интервале концентраций CD свидетельствует об эквимольном соотношении компонентов в комплексе [FU CD]. Квантовый выход ФЛ комплекса 2,4-дикоксо-таутомера 5-фторурацила с -циклодекстрином, определенный из отрезка, отсекаемого прямой на оси ординат рисунка 3.4.2 равен: рк - 3.6x10 . Увеличение квантового выхода ФЛ при комплесообразовании ( ро - 2.2x10 ) объясняется экранированием включенного в полость -циклодекстрина электронно-возбужденного FU от “тушащего” влияния растворителя.
Значение константы устойчивости супрамолекулярного комплекса включения FU с CD, определенное из тангенса угла наклона прямой 2 на рисунке 3.4.2 составило 44 л/моль. Комплексы [FU CD], которые можно рассматривать как своеобразные наноконтейнеры по доставке лекарственного вещества к опухоли, должны быть достаточно лабильными и это условие действительно выполняется. Еще одним важным моментом, определяющим фармацевтическую перспективность клатратов [FU CD] является тот факт, что олигосахариды-циклодестрины поглощают в УФ-области солнечного спектра, а это априори позволяет предположить их фотопротекторные свойства.
Один из самых практически важных моментов - увеличение растворимости FU в комплексе с -циклодекстрином. Растворимость CD составляет 1.85 г/100 мл. В насыщенном растворе CD растворимость FU составила 1.4 г/100 мл, что в 14 раз превышает растворимость свободного 5-фторурацила (0.1 г/100 мл).
В то же время, недостатком CD является невозможность его инъекционного применения ввиду токсичного воздействия на нефроны почек. Кроме того растворимость CD, далеко не максимальна для этого класса соединений. Снятием этих ограничений может являться использование гидроксипропил-производных -циклодекстрина. Гидроксипропил--циклодекстрины, разрешены как для применения внутрь, так и парэнтерального введения, а их растворимость в воде достигает 60 г/100 мл и выше. Комплексообразовние FU с гидроксипропил--циклодекстринами будет предметом дальнейших исследований.
Теоретические расчеты устойчивости таутомеров 5-фторурацила и их комплексов с -циклодекстрином составов 1:1 и 2:2.
С целью исследования возможных состояний комплексов включения [FU CD] выполнено теоретическое моделирование строения ряда модельных структур.
Изначально было выдвинуто предположение о стехиометрическом составе комплекса, равном 1:1. Размер полости CD таков, что образование комплекса включения требует освобождения FU от первичной гидратной оболочки. Найдено, что CD способен удерживать в полости все таутомеры 5-фторурацила. Для доминирующего дикето-таутомера A FU возможны различные способы координации внутри полости -циклодекстрина. На рисунке 3.4.3 приведена структура наиболее энергетически выгодного комплекса – [ACD].
Другой возможностью связывания FU с -циклодекстрином является образование комплекса включения стехиометрического состава 2:2, в котором две молекулы CD образуют замкнутую полость, в которую инкапсулирован димер FU. Вследствие сравнительно низкой растворимости FU, в растворе всегда присутствуют его ассоциированные формы, что способствует комплексообразованию по типу 2:2. Поскольку мы наблюдаем комплексообразование только для дикето-таутомера A, модельные расчеты проведены для структур, в которых молекулы FU образуют симметричные димеры со связыванием по типу N1-HO=C2 (12), C2=OH-N3 (23) и N3-H=OC4 (34). Строение комплексов включения стехиометрического состава 2:2 [CDAACD] показано на рисунке 3.4.4.
Отметим некоторые особенности строения этих комплексов. Образование замкнутых структур становится возможным вследствие внешней гидрофильной кромки циклодекстрина, состоящей из гидроксильных групп при 2- и 3-углеродном атоме мономера глюкозы.
Образование межмолекулярных водородных связей между 3-O-H2-O-H группами формирует капсулу, размер внутренней полости которой практически совпадает с размером димера FU. При этом димер «подстраивается» под размер полости путем нарушения планарности димерной структуры. В частности, для комплекса [CDA3434ACD] угол между плоскостями урацильных циклов составляет 120, тогда как для [CDA2323ACD] он равен 140 и практически развернут ( 170) для комплекса со связыванием урацильных фрагментов по типу N1-HO=C2 (12). В последнем случае узкая кромка CD, образованная водородными связями 6-O-H6-O-H соседних глюкозных единиц, оказывается сближенной с гидрофильной частью FU (C4=O и C5-F фрагменты), что приводит к частичному разрушению узкой кромки CD и увеличению размера внутренней полости.
Таким образом, образование комплексов стехиометрического состава 1:1 и 2:2 теоретически непротиворечиво и разумно согласуется с наблюдаемыми экспериментальными закономерностями. Вхождение FU в полость CD требует освобождения урацила от гидратной оболочки. В этом случае наблюдаемое увеличение квантового выхода ФЛ обусловливается снятием тушащего действия растворителя.
Спектрально-люминесцентное исследование комплексообразования FU с -циклодекстрином в кислых водных растворах.
Поскольку при пероральном применении лекарственные препараты попадают в агрессивную кислую среду желудка, представляется важным исследование свойств комплексов [FUCD] при низких значениях pH. Аналогично нейтральным водным растворам, при pH 3 образование комплексов включения FU с CD проявляется в спектрах ФЛ (рисунок 3.4.5).
