Введение к работе
Актуальность проблемы. Рибосомы представляют собой молекулярные машины, которые синтезируют все белки живой клетки, транслируя хранящуюся в геноме генетическую информацию. В ходе трансляции синтезируемая на рибосоме полипептидная цепь перемещается по рибосомному туннелю (РТ) от места образования очередной пептидной связи (пептидилтрансферазного центра, ПТЦ) к месту выхода из рибосомы, где начинается процесс "фолдинга" белка. РТ изучается уже почти десять лет с применением разнообразных физических, химических и молекулярно-биологических методов. В частности, установлено, что его стенки "выложены" преимущественно нуклеотидными остатками рРНК, и что взаимодействие растущей полипептидной цепи с ними в некоторых случаях является важным элементом процесса регуляции трансляции. В то же время, такие важные вопросы, как конформация полипептидной цепи в РТ, механизмы ее перемещения по туннелю и взаимодействия с рРНК остаются без ответа. Недавно в нашей лаборатории было предложено попытаться дать ответ на эти вопросы с помощью пептидных производных макролидных антибиотиков.
Действительно, одна из особенностей РТ состоит в том, что вблизи ПТЦ в нем расположен сайт специфического связывания антибиотиков-макролидов. Макролиды представляют собой семейство природных и полусинтетических антибиотиков, которые содержат характерное макроциклическое лактонное кольцо, замещенное одним или более углеводными остатками. К этому семейству относятся антибиотики тилозинового ряда, содержащие 16-членный лактонный цикл - тилонолид. Макролиды широко применяются на практике для лечения заболеваний, вызываемых грамм-положительными бактериями. Фармакологическое действие макролидов основывается на их связывании с рибосомой и блокировании перемещения полипептидной цепи белка в рибосомном туннеле. Поэтому макролидные антибиотики интересны как удобные инструменты для исследования функционирования рибосомного туннеля. С другой стороны, изучение комплексов рибосомных субъединиц с макролидами (а также с многочисленными антибиотиками других классов) важно для понимания молекулярных механизмов антибиотической активности, для выяснения причин устойчивости микроорганизмов к антибиотикам и для рационального конструирования на основе этих знаний новых антибактериальных средств.
Объектом настоящего исследования является макролидный антибиотик тилозинового ряда 5-О-микаминозилтилонолид (ОМТ), который, по сравнению с самим тилозином, лишен двух углеводных остатков - мицинозы и микарозы и содержит лишь один углеводный остаток - аминосахар микаминозу. Пространственное расположение
тилозина в РТ было определено методом рентгеноструктурного анализа (РСА). Исходя из этой структуры и некоторых биохимических данных, можно заключить, что ОМТ, подобно тилозину, связывается с рибосомой вблизи ПТЦ таким образом, что лактонное кольцо антибиотика перекрывает большую часть отверстия РТ. При этом остаток микаминозы направлен в сторону ПТЦ, а первичная гидроксильная группа в положении С23 лактонного кольца ориентирована в сторону выхода из туннеля. Важно подчеркнуть, что ОМТ, как и другие антибиотики тилозинового ряда, связывается с РТ не только специфично, но и чрезвычайно прочно.
Цель работы. Целью работы являлось осуществление дизайна и синтеза пептидных производных ОМТ по гидроксильной группе в положении С23 и изучение их биологических свойств. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
Осуществить дизайн пептидных производных ОМТ как потенциальных инструментов для изучения функционирования РТ.
Получить 5-О-микаминозилтилонолид из тилозина.
Разработать метод синтеза аминокислотных и пептидных производных ОМТ по положению С23.
Осуществить синтез N-защищенных коротких пептидов, содержащих остатки фенилаланина и триптофана.
Синтезировать фенилаланин- и триптофан-содержащие пептидные производные ОМТ по положению С23.
Изучить биологические свойства синтезированных соединений, а именно: а) специфичность связывания с рибосомой, б) способность ингибировать биосинтез белка в системе in vitro, в) антибактериальную активность.
Научная новизна и практическая значимость исследования.
Осуществлен целенаправленный дизайн оригинальных пептидных производных ОМТ - потенциальных инструментов для изучения регуляторного района рибосомного туннеля. Синтезирован ряд защищенных коротких пептидов, содержащих гидрофобные аминокислотные остатки. Впервые разработан метод синтеза и получены не описанные ранее аминокислотные и пептидные производные макролидного антибиотика ОМТ по положению С23. Впервые получены фенилаланин- и триптофан-содержащие производные ОМТ по положению С23. В случае соединений, содержащих триптофан, его остаток находится на различном расстоянии от лактонного кольца макролида, что достигается использованием в качестве линкеров глицина, Р-аланина, у-аминомасляной и
8-аминовалериановой кислот. Методами химической модификации 23 S рРНК и конкурентного вытеснения радиоактивно меченого эритромицина показано, что фенилаланин- и триптофан-содержащие производные ОМТ связываются с рибосомой в сайте связывания макролидных антибиотиков. Показано, что пептидные производные ОМТ по ингибирующей активности значительно превосходят ОМТ в системе транскрипции-трансляции зеленого флуоресцентного белка (GFP), проявляют активность, несколько превышающую таковую для ОМТ в системе трансляции мРНК люциферазы светлячков. В тестах на антибиотическую активность против некоторых штаммов стафилококков обнаружено, что триптофан-содержащие производные ОМТ обладают сравнимой с ОМТ и тилозином антибактериальной активностью. Таким образом, показана принципиальная возможность использования 23-О-пептидил-ОМТ производных в качестве инструментов для изучения взаимодействия растущего пептида с РТ.
Публикации и апробация работы.
По материалам диссертации опубликовано две статьи и шесть тезисов докладов. Результаты работы докладывались на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006" (Москва,
г.), 29-м Европейском пептидном симпозиуме 29-EPS (Гданьск, 2006 г.), III Российском симпозиуме "Белки и пептиды" (Пущино, 2007 г.), Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2007" (Москва,
г.), 30-м Европейском пептидном симпозиуме 30-EPS (Хельсинки, 2008 г.), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва-Пущино, 2009 г.).
Структура и объём работы.
Диссертация изложена на 93 страницах и содержит следующие разделы: введение, литературный обзор, обсуждение результатов, экспериментальная часть, выводы, список литературы (86 ссылок). Материал иллюстрирован 20 рисунками, 8 схемами и 6 таблицами.
