Введение к работе
Актуальность проблемы. Конструирование модифицированных синтетических олигонуклеотидов и их производных как высокоизбирательных инструментов исследования природных структур и процессов реализации генетической информации in vitro и in vivo является актуальной задачей современной биоорганической химии и молекулярной биологии. Среди модифицированных олигонуклеотидов весьма привлекательными являются аналоги олигорибонуклеотидов, несущие алкильную группу в 2*-положении. Особенность данного типа модификации заключается в том, что при этом сохраняется А-тип двойной спирали, характерный для олигонуклеотидов рибо-ряда, и значительно повышается устойчивость к действию оснований и целого ряда нуклеаз. Термическая стабильность дуплексов и триплексов с участием 2"-0-алкилрибоолигомеров в большинстве случаев оказывается выше, чем при использовании олигонуклеотидов дезоксирибо-ряда. Такое благоприятное сочетание свойств делает 2'-0-алкилированные аналоги олигорибонуклеотидов, в том числе 2'-0-метилированные аналоги, удачной альтернативой природным олигоркбонуклеотидам.
Цель работы. Целью данной работы была разработка методов синтеза олиго(2'-0-метилбонуклеотидов), новых типов их производных и изучение их свойств.
Научная новизна и практическая ценность. Разработана схема твердофазного Н-фосфонатного синтеза олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) на отечественном синтезаторе "Виктория-5М" и в "ручном варианте". В рамках этой схемы выполнен синтез олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), модифицированных путем превращения З'-концевой межнуклеотидной связи в фосфо-диэфирамидную или З'-З'-фосфодиэфирную ("инвертированную") связь. Продемонстрирована повышенная устойчивость этих новых аналогов к действию экзо- и эндонуклеаз. Синтезирован ряд новых конъюгатов олиго(2'~0-метилрибонуклеотидов), несущих на 5'-конце остаток М~(2-гидрокси-зтил)феназиния, алкилирующие или стероидные группировки. Для синтеза стероидных производных предложен защищенный патентом РФ эффективный метод, основанный на использовании в качестве ключевых соединений Н-фосфонатов гидроксилсодержащих стероидов. Показано, что синтезирован-
ные конъюгаты ояиго(2'-0-метилрибонуклеотидов) формируют с комплементарными РНК-последовательностями более стабильные дуплексы, чем с фрагментами ДНК. Впервые проведено сравнительное изучение реакции комплементарно адресованного алкилирования модельных ДНК и РНК- мишеней алкилир'ующими реагентами на основе гекса(2'-0-метилрибо)-. -рибо- и -дезоксирибонуклеотидов в отсутствие и в присутствии эффекторов - окта-нуклеотидов того же ряда, содержащих Н-{2-гидроксиэтил)-феназиниевую группировку на 5'-конце. При этом показано, что олиго(2'-0-метилрибонуклеотиды), несущие алкилирующую группировку, являются наиболее эффективными реагентами для комплементарно-адресованной модификации РНК Таким образом, в результате проделанной работы в арсенал ген-направленных соединений включен ряд новых типов производных олиго(2'-0-метилрибонуклеотидов), обладающих повышенным сродством к фрагментам РНК и устойчивостью к нуклеолитической деградации. Такое сочетание свойств позволяет считать эти производные перспективными реагентами для применения в молекулярной биологии и медицина
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на рабочем совещании по синтезу олигонуклеотидов (Пущине, Россия, 1988 г.), на Международной конференции молодых ученых по органической и биоорганической химии (Бехине, Чехословакия, 1989 г.), на Международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и перспективы практического использования" (Москва, Россия, 1991 г.), на второй планово-отчетной конференции по направлению "Генетическая и клеточная инженерия" (Пущино, Россия, 1991 г.) и на Международной конференции "Терапевтические олигонуклеотиды: от клетки к человеку" (Сейяк, Франция, 1995 г.)
Публикации. По материалам диссертации получен патент РФ и опубликовано 7 печатных работ.
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 156 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 199 наименований и содержит 11 таблиц и 23 рисунка.
